در این تحقیق روش جدید، ساده و سریع میکرواستخراج مایع-مایع پخشی به همراه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا برای تعیین بتولینیک اسید در نمونه های گیاهی استفاده شده است. در این روش جهت استخراج بتولینیک اسید به محلول متانولی ، کلروفرم به عنوان حلال استخراجی اضافه می‏شود. پس از اضافه کردن آب به مخلوط، فاز ابری تشکیل شده و به سرعت از حلال آبی جداشده و در انتهای لوله آزمایش ته نشین و به آسانی جدا می شود. حلال استخراجی تبخیر شده و باقیمانده جهت آنالیزهای بعدی توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در استونیتریل حل می شود. اثر پارامترهای مختلف روی استخراج با استفاده از روش پاسخ سطح (rsm) مورد بررسی قرار گرفت. سه متغییر مستقل حجم حلال استخراجی(a) ، زمان (b) و حجم آب (c) انتخاب شدند. آنالیزهای آماری نشان دادند متغییر مستقل a و اثرات متقابل بین b و c ، اثرات معنی داری بروی سطح زیر پیک بتولینیک اسید دارند (p<0.05). شرایط بهینه به صورت ذیل بودند: 90 میکرولیتر حلال استخراجی، زمان استخراج 3/4 دقیقه و 2/5 میلی لیتر حجم محلول. تحت شرایط بهینه، حد تشخیص 8/1 میکروگرم بر لیتر بود. انحراف استاندارد نسبی حاصل از 10 تکرار کمتر از 9/3 % بود. از این روش جهت استخراج و تعیین بتولینیک اسید در نمونه-های گیاهی استفاده شده است.