نام پژوهشگر: آرزو لطفی

همسانه سازی و بیان ژن پروتئین پوششی ویروس زردی غربی چغندر درcoli escherichia و آماده سازی آنتی سرم علیه آن
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه تربیت مدرس - دانشکده کشاورزی 1390
  آرزو لطفی   مسعود شمس بخش

ویروس زردی غربی چغندرقند (bwyv) beet western yellows virus یکی از ویروس های مهم بیماری زا در گیاهان می باشد. تشخیص سریع و به موقع این ویروس نقش به سزایی در اتخاذ روش های کنترل و خسارت آن دارد. از روش های متداول، معتبر و ارزان برای تشخیص ویروس در سطح وسیع، روش سرولوژیکی می باشد که در این روش تامین منبع آنتی ژن ویروسی برای استفاده در فرآیند تولید آنتی بادی پلی کلونال ضروری است. در تحقیق حاضر ژن رمزکننده پروتئین پوششی bwyv، جدا شده از ایران (bwyv-cl10)، طی واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) تکثیر شد و در ناقل بیانی pet26b همسانه سازی گردید و سازه حاصل pet-bwyv-cp نامیده شد. سپس این سازه به سویه بیانی (bl21) باکتری escherichia coli منتقل شد و بیان پروتئین پوششی نوترکیب با iptg القاء گردید. سپس نمونه برداری در ساعات مختلف (2، 4، 6 و 8 ساعت) پس از القاء انجام شد. پروتئین محلول کل استخراج و به کمک الکتروفورز در ژل sds-page تفکیک گردید و باند پروتئین مورد نظر مشاهده شد. صحت پروتئین بیان شده توسط روش لکه گذاری وسترن و با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی تولید شده علیه ذرات ویروسی تأیید شد. با الکتروفورز قطعه ژل حاوی پروتئین نوترکیب در کیسه دیالیز این پروتئین خالص سازی گردید و برای حذف بافر الکتروفورز، پروتئین نوترکیب به مدت 24 ساعت علیه آب مقطر دیالیز شد. سپس پروتئین خالص سازی شده با استفاده از دستگاه لیوفیلیزه کننده تغلیظ و به خرگوش جهت تولید آنتی سرم تزریق شد. آنتی سرم تولید شده، پروتئین پوششی نوترکیب را در عصاره باکتری نوترکیب القاء شده و مخلوط با عصاره پروتئینی گیاه کلزا سالم با استفاده از تکنیک وسترن بلات با رقت 1:45000 شناسایی نمود اما واکنش مثبتی با عصاره گیاهان کلزای آلوده مشاهده نشد. نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند که تولید آنتی بادی تشخیصی علیه ویروس زردی غربی چغندر بوسیله پروتئین پوششی نوترکیب آسان نیست و نیاز به استراتژی های خاص دارد.