3-1 نتایج حاصل از تکنیک ایمونوهیستوشیمی 3-1-1 مقایسه داده های آماری حاصل از میزان واکنش کلاژن نوع iv در غشاء پایه مویرگ های مغز موش های 1، 6 و 12 ماهه npar tests kruskal-wallis test test statistics(a،b) the level of ihc reaction chi-square 14.036 df 2 asymp. sig. .001 a kruskal wallis test b grouping variable: age category n = 18 جدول 3-1-1- مقایسه نتایج آماری حاصل انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی نمونه های مغز موش 1، 6 و 12 ماهه، توسط نرم افزار spss و تست آماری kruskal-wallis نشان می دهد که نتایج معنی داری از مقایسه سه گروه به دست آورده ایم (**p< 0.01). 3-1-2-مقایسه میزان واکنش کلاژن نوع iv غشاء پایه مویرگ های قشر مغز موش های 1 ماهه با 6 ماهه. npar tests mann-whitney test test statistics(b) the level of ihc reaction mann-whitney u 1.000 wilcoxon w 22.000 z -2.900 asymp. sig. (2-tailed) .004 b grouping variable: age category n = 12 جدول 3-1-2- مقایسه نتایج آماری حاصل انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی نمونه های مغز موش 1و 6 ماهه، توسط نرم افزار spss و تست آماریu mann-whitney، نشان می دهد که از نظر آماری افزایش معنی داری در میزان کلاژن نوع iv مغز موش های 6 ماهه نسبت به موش های 1 ماهه ایجاد شده استp < 0.01) ** .( 3-1-3- مقایسه میزان واکنش کلاژن نوع iv غشا پایه ای مویرگ های قشر مغز موش های 6 ماهه با 12 ماهه. npar tests mann-whitney test test statistics(b) the level of ihc reaction mann-whitney u 5.000 wilcoxon w 26.000 z -2.373 asymp. sig. (2-tailed) .018 b grouping variable: age category n = 12 جدول 3-1-3- مقایسه نتایج آماری حاصل انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی نمونه های مغز موش 6 ماهه با 12 ماهه، توسط نرم افزار spss و تست آماری mann-whitney، مشخص شد از نظر آماری افزایش معنی داری در میزان کلاژن نوع iv مغز موش های 12 ماهه نسبت به گروه سنی 6 ماهه ایجاد شده است(*p< 0.05) . 3-1-4- نمودار حاصل از مقایسه میزان واکنش رنگی کلاژن نوع iv غشاء پایه عروق ریز مغز موش های 1، 6 و12 ماهه . نمودار 3-1-4- مشاهده می شود که میانه حاصل از درجه بندی واکنش رنگی کلاژن نوع iv، در غشاء پایه مویرگ های قشر مغز موش های 6 ماهه نسبت به گروه سنی 1 ماهه افزایش معنی داری پیدا کرده است. این افزایش معنی دار در نتایج حاصل از بررسی گروه سنی 12 ماهه نسبت به 6 ماهه نیز به میزان کمتری، دیده می شود (p<0.01**، p<0.05*)، n=18)). 3-2- نتایج حاصل از مطالعات استریولوژی مربوط به تغییرات وابسته به سن تراکم عروق ریز مغز موش. 3-2-1- اطلاعات توصیفی به دست آمده از محاسبه lv، برای موش های سه گروه سنی 1، 6 و 12 ماهه. سن شماره گروه 1 ماهه 6 ماهه 12ماهه 1 0.24 0.288 0.28 2 0.236 0.28 0.28 3 0.232 0.24 0.28 4 0.232 0.28 0.28 5 0.24 0.28 0.28 6 0.24 0.28 0.29 میانگین ± خطای استاندارد میانگین 0.2367 ± 0.0168 0.2733 ± 0.0067 0.2817 ± 0.017 جدول 3-2-1- مقادیر lv به دست آمده برای هر نمونه از سه گروه سنی و میانگین lv های سه گروه سنی. 3-2-2- بررسی آماری داده های حاصل از شمارش عروق ریز مغز موش های 1، 6 و 12 ماهه. بررسی داده های حاصل از شمارش عروق ریز نشان داد که پیش فرض های لازم برای انجام تست anova وجود ندارد. این پیش فرض ها شامل توزیع نرمال داده ها و هم جنسی واریانس ها می باشد. به همین دلیل تست kruskal-wallis وu mann-whitney انجام شد. kruskal-wallis test test statistics(a،b) capillary density chi-square 13.316 df 2 asymp. sig. .001 a kruskal wallis test b grouping variable: age category (n=18) جدول 3-2-2- نتایج نشان میدهد که تغییرات مشاهده شده در شمارش عروق ریز مغزی، بین گروه های سنی مورد نظر، از لحاظ آماری معنی دار بوده است (**p< 0.01). ولی مشخص نمی باشد که این تغییر معنی دار بین کدام گروه ها ایجاد شده است. به این منظور اقدام به انجام تست آماری mann-whitney، شد. 3-2-3- مقایسه داده های حاصل از شمارش عروق ریز مغزی، بین موش های گروه سنی 1 و 6 ماهه. مقایسه انجام شده توسط تسط آماری mann-whitney، نتایج زیر را نشان داد. mann-whitney u test test statistics(b) capillary density mann-whitney u 1.500 wilcoxon w 22.500 z -2.798 asymp. sig. (2-tailed) .005 b grouping variable: age category جدول 3-2-3- نتایج نشان می دهد که موش های گروه سنی شش ماهه نسبت به گروه سنی یک ماهه افزایش در میانگین تراکم عروق ریز داشته اند. که از نظر آماری معنی دار بوده است (**p< 0.01) 3-2-4- مقایسه داده های حاصل از شمارش عروق ریز مغزی، بین موش های گروه سنی 6 و 12 ماهه. مقایسه انجام شده توسط تسط آماری mann-whitney، نتایج زیر را نشان داد. mann-whitney u test test statistics(b) capillary density mann-whitney u 12.500 wilcoxon w 33.500 z -1.354 asymp. sig. (2-tailed) .176 b grouping variable: age category جدول 3-2-4- نتایج حاصل نشان می دهد با وجود افزایش میانگین تراکم عروق ریز قشر مغز گروه سنی دوازده ماهه نسبت به شش ماهه، این افزایش از نظر محاسبات آماری معنی دار نبوده است. 3-2-5- نمودار حاصل از مقایسه آماری میانگین تراکم عروق ریز مغزی در موش های سه گروه سنی 1، 6 و 12 ماه. نمودار 3-2-5- نمودار رسم شده افزایش در میانگین تراکم عروق ریز مغز موش های شش ماهه نسبت به موش های یک ماهه را نشان می دهد که این افزایش میانگین تراکم عروق ریز از نظر محاسبات آماری نیز معنی دار بود. همچنین افزایش کمی در میانگین تراکم عروق ریز مغز موش های دوازده ماهه نسبت به موش های شش ماهه دیده می شود. گرچه این افزایش در نمودار رسم شده دیده می شود، ولی از نظر محاسبات آماری این افزایش معنی دار نبود. (**p< 0.01)، n=18))، نتایج به صورت mean±sem ارائه شد. شکل3-1- مقطع عروق ریز بخش اکسی پیتال مغز موش با رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی کلاژن غشاء پایه. a: مقطع مغز موش یک ماهه. واکنش پذیری ضعیف کلاژن نوع iv غشاء پایه عروق ریز (فلش). b: موش 6 ماهه، واکنش رنگی کلاژن غشاء پایه به طور معنی داری نسبت به گروه 1 ماهه افزایش پیدا کرده است (فلش)، (**p< 0.01). c: موش 12 ماهه، واکنش رنگی نسبت به دو گروه سنی قبل به طور معنی داری افزایش پیدا کرده است (فلش)، ) p<0.05*). شکل3-2- مقطع عروق ریز بخش اکسی پیتال مغز موش با رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی کلاژن غشاء پایه. a: مقطع مغز موش یک ماهه. واکنش پذیری ضعیف کلاژن نوع iv غشاء پایه عروق ریز (فلش). b: موش 6 ماهه، واکنش رنگی کلاژن غشاء پایه به طور معنی داری نسبت به گروه 1 ماهه افزایش پیدا کرده است (فلش)، (**p< 0.01). c: موش 12 ماهه، واکنش رنگی نسبت به دو گروه سنی قبل به طور معنی داری افزایش پیدا کرده است (فلش)، ) p<0.05*)، (رنگ آمیزی زمینه هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگنمایی 100). شکل 3-3- مقطع قشر اکسی پیتال مغز موش با رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین. a: مغز موش یک ماهه. b: مغز موش شش ماهه. c: مغز موش دوازده ماهه. کادر مشکی: کادر استفاده شده برای شمارش تعداد عروق ریز. بزرگنمایی 40. به طور کلی افزایش سن می تواند با مجموعه ای پیچیده از فرایند ها که با گذشت زمان منجر به مختل شدن سلامت، سالخوردگی و در نهایت مرگ فرد می شوند، همراه باشد. هر فرایندی که در کاهش وابسته به سن کارایی، باروری و سلامت دخلات داشته باشد، موئلفه ای از فرایند سالخوردگی می باشد که سزاوار توجه و بررسی است. می توان پیری را که گروهی از فرایندهای مسئول برای چنین تظاهراتی می باشد، به عنوان افزایش خطر ناتوانی، بیماری و نیز افزایش میزان مرگ و میر تعریف کرد. افزایش سن به صورت طبیعی و نرمال ممکن است بر تمام فرایند های فیزیولوژیکی اثر بگذارد و منجر به تغییرات غیرقابل برگشت در عملکرد اکثر اندام ها بشود [4]. فرایند هایی که ممکن است منجر به کاهش درک، عملکرد و یا تغییراتی در بافت های تشکیل شده از سلول و ماتریکس خارج سلولی بشوند بسیار متفاوتند. گرچه این تغییرات به صورت بیماری ارزیابی نمی شوند، ولی اثراتی منفی بر ظرفیت عملکردی افراد در سنین بالا خواهند داشت. در بین عواملی که در بروز تغییرات دخالت دارند، سیستم عروقی مغز و جریان خون سیستم عصبی مرکزی نقش بسیار مهمی را به خود اختصاص می دهند. مخصوصا عروق ریز مغزی که نقشی ضروری در حفظ جریان خون موضعی مغز و در نهایت تامین نیاز های متابولیکی برای عملکرد طبیعی، بازی می کنند [94]. با توجه به این مسئله که عروق ریز، از جمله مویرگ های قشر مغز بیشترین میزان مواد مغذی را به نوروپیل های احاطه کننده، منتشر می کنند و بسیار بیشتر از عروق بزرگ تحت تاثیر تغییرات وابسته به سن، قرار می گیرند [3, 95]. در این پروژه سعی بر این بود تا اثر افزایش سن بر تغییرات ایجاد شده در اجزای ماتریکس خارج سلولی عروق ریز قشر مغز مورد بررسی قرار بگیرد. به این منظور برش های سریالی با ضخامت 5 میکرون از بخش اکسی پیتال قشر مغز تهیه شد و به بررسی تغییرات فراساختاری در این ناحیه قشر مغز، پرداخته شد. با توجه به مطالعات inoue در 1990، همچنین michaloudو همکارانش در 2005، این بخش قشر مغز ترکم عروق ریز بالایی دارد [96, 97]. هرچند تفاوت های بارزی در ماهیت تغییرات دیده شده در مطالعات مختلف وجود دارد. ارزیابی این اختلافات به دلیل تفاوت در حیوانات های مورد استفاده، ناحیه مغزی نمونه برداری شده و روش های متفاوت انجام آزمایش مشکل می باشد. در اکثر مطالعات انجام شده بر تغییرات وابسته به سن، میزان پروتئین های ماتریکس خارج سلولی و تغییرات فراساختاری عروق ریز مغز رت و یا بیماری های نورودژنریتیو انسان بررسی شده است. در این تحقیق برای اولین بار تغییرات فراساختاری عروق ریز بخش اکسی پیتال قشر مغز موش مورد بررسی قرار گرفت. از بین پروتئین های سازنده غشاء پایه، تغییرات وابسته به سن کلاژن نوع iv که داربست اصلی را برای سایر اجزاء سازنده غشاء ایجاد می کند مورد توجه قرار گرفت. موش های مورد مطالعه از سه گروه سنی 1، 6 و 12 ماه انتخاب شدند و تغییرات وابسته به سن میزان پروتئین کلاژن نوع iv در غشاء پایه عروق ریز مغز آنها مورد مقایسه قرار گرفت. برای نشان دادن تفاوت میزان کلاژن نوع iv غشاء پایه در سه گروه سنی موش مورد مطالعه، از تکنیک ایمونوهیستوشیمی به دلیل قابلیت تشخیص اختصاصی آنتی ژن های مورد نظر بافت [98] استفاده شد تا توسط آنتی بادی مونوکلونال آنتی کلاژن iv، کلاژن به وسیله ایجاد واکنش رنگی قابل مشاهده در بافت نشان داده شود و در سه گروه سنی قابل مقایسه با یکدیگر باشد. سپس توسط تکنیک رتبه بندی gong [92]، مشاهدات کیفی به صورت نتایج نیمه کمی درآمد و مورد بررسی تست های آماری قرار گرفت. در نهایت این گونه نشان داده شد که کلاژن نوع iv در غشاء پایه عروق ریز مغز موش های یک ماهه واکنش ضعیفی داشته است و با افزایش سن در موش های شش ماهه میزان واکنش پذیری شدید تر شده است (شکل 3-1). مقاسیه نتایج حاصل از تست های آماری نشان داد که افزایش واکنش پذیری رنگی دیده شده توسط تکنیک ایمونوهیستوشیمی از نظر آماری معنی دار بوده است (0.04p=)، (بخش 3-1-2). میزان واکنش پذیری رنگی مشاهده شده در غشاء پایه عروق ریز در گروه سنی دوازده ماهه نیز نسبت به دو گروه قبلی افزایش پیدا کرده بود و محاسبات آماری داده های کمی معنی دار بودن این افزایش را نشان دادند(0.018p=)، (بخش 3-1-2). بازرترین تغییر فرا ساختاری وابسته به سن ثبت شده در سایر گزارشات مربوط به عروق ریز مغزی پستانداران، قطور شدن غشاء پایه (لایه قاعده ای) [1, 3, 95, 99-102]، همچنین افزایش محتوی کلاژن در دیواره عروق ریز رت های پیر [1, 39, 102-104] و انسان ها [3, 101] می باشد. افزایش محتوی کلاژن، نه تنها با افزایش سن نشان داده شده است، بلکه در بیماری های آلزایمر [105] و فشارخون [39] نیز دیده شده است. و این طور می توان بیان کرد که افزایش محتوی کلاژن تنها مرتبط با افزایش سن نمی باشد. تحقیقاتی که تا کنون بر روی کلاژن نوع iv (کلاژن غشای پایه) صورت گرفته است، با مطالعه ی کفالید و وینزلر، که با استفاده از روش تفرق اشعه x، برای اولین بار حضور ساختاری مطابق با الگوی مارپیچ سه گانه کلاژن را در غشا پایه نشان دادند، آغاز شد. این دو محقق سپس غشاپایه گلومرول سگ را با استفاده از اوره جداسازی کردند و به آنالیز اسیدهای آمینه آن پرداختند و حضور میزان بالایی هیدروکسی لیزین و هیدروکسی پرولین را نشان دادند. و در نهایت این گونه نتیجه گرفتند که این جزء غشاء پایه می تواند به عنوان کلاژنی با ترکیبی منحصر به فرد - 5/1 برابر محتوی هیدروکسی پرولین و 6 برابر محتوی هیدروکسی لیزین بیشتری نسبت به سایر کلاژن های پستانداران – طبقه بندی بشود [59, 106]. بعد ها مطالعات بیشتری بر روی کلاژن نوعiv، که کلاژن غشاء پایه ای نامیده می شود صورت گرفت. با استفاده از تکنیک ایمونو فلورسانس، نحوه توزیع زنجیره های مختلف کلاژن نوع iv در نرم شامه و شبکه کوروئیدی مغز موش بررسی شد و محققان به این نتیجه دست یافتند که کلاژن iv در غشای پایه زیر اندوتلیال عروق مغزی و غشای پایه اپاندیم شبکه کوروئیدی مغز، در زیر نرم شامه مشاهده می شود. به طور کلی در هر جایی که غشای پایه ای حضور داشته باشد کلاژن نوع iv، نیز مشاهده خواهد شد [12]. نتایج مشابه با موارد دیده شده در پروژه حاضر را در مطالعات پیشین می توان مشاهده کرد. تعداد زیادی از تحقیقات گذشته، بررسی تغییرات فراساختاری وابسته به سن بستر عروقی بخش های مختلف مغز رت، افزایش محتوی کلاژن غشای پایه را به صورت فیبریل هایی در نمونه های مسن با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نشان داده اند. مطالعه ما افزایش وابسته به سن میزان کلاژن را توسط آنتی کلاژن iv و سوبسترای دی آمینوبنزیدین به صورت یک واکنش رنگی قابل مشاهده با میکروسکوپ نوری نشان داد. افزایش شدت واکنش رنگی کلاژن از موش 1 ماهه تا 12 ماهه قابل مشاهده بود(شکل 3-1و 3-2). در مطالعات ذکر شده قبلی بر اساس دوره تناوب فیبریل های دیده شده با میکروسکوپ الکترونی، آنها را به عنوان کلاژن شناسایی کردند و این افزایش میزان کلاژن را به عنوان عامل اصلی در افزایش ضخامت غشای پایه ای مطرح کرده اند و به این دلیل که این افزایش در نمونه های کم سن مشاهده نشده بود، آن را به صورت پدیده ای وابسته به سن مطرح کردند [1, 3, 27, 103, 104, 107]. همین نتیجه را از بررسی تغییرات وابسته به سن غشاء پایه هیپوکامپ میمون توسط میکروسکوپ الکترونی و همچنین عروق ریز جسم سفید مغز سگ نیز به دست آورده اند [94, 108]. در برخی مطالعات نیز بر خلاف نتایج دیده شده در این مطالعه و مطالعات ذکر شده فوق، عدم تغییر در میزان فیبریل های شبه کلاژنی غشای پایه عروق ریز بخشی از قشر و پل مغزی رت با افزایش سن مشاهده شده است و بررسی تغییرات وابسته به سن غشای پایه مویرگ ها را نیازمند داشتن اطلاعات بیشتری از نقش غشای پایه ای در عملکرد مویرگ ها دانسته اند [28, 109]. در مطالعه ای بر مغز رت، مکانیسم قطور شدن غشاء پایه ای و مواد تجمع یافته در آن را با افزایش سن، ناشناخته گزارش کردند [110]. در مطالعات صورت گرفته بر تغییرات غشای پایه عروق ریز مغز انسان بیشتر به بررسی تغییرات وابسته به سن عروق ریز و اجزای سازنده غشای پایه درافراد دچار به بیماری های نورودژنریتیو همراه با افزایش سن مثل پارکینسون و آلزلیمر همچنین بیماری فشارخون پرداخته شده است و بروز این تغییرات طی افزایش سن فرد به صورت طبیعی، کمتر مورد بررسی قرار گرفته است [17, 111, 112]. یکی از مطالعات صورت گرفته بر مغز انسان که نتایجی بسیار مشابه با نتایج حاصل از پروژه ما ارائه داده است، در سال 2004، بر روی عروق ریز بخش پوتامن مغز افرادی در رده های سنی مختلف، با هدف بررسی تغییرات وابسته به سن کلاژن نوع iv غشاء پایه انجام شد. در این تحقیق نیز با استفاده از تکنیک ایمونوهیستوشیمی، افزایش محتوی کلاژن عروق مغزی نمونه های مسن در مقایسه با نمونه های جوان مشاهده شد [113]. افزایش کلاژن نوع iv با افزایش سن در غشا پایه، علاوه بر سیستم عروق ریز عصبی مرکزی در سایر بخش ها مثل عروق خونی اندونوریال و اپینوریال عصب محیطی oculomotor رت، عروق ناحیه مرکزی جوانه بویایی، کپسول عدسی موش و بافت همبند آلوئولار ریه انسان بررسی شده است [91, 114-116]. همچنین برخی مطالعات دپلیمریزاسیون و در نتیجه کاهش میزان فیبرهای کلاژنی را در مراحل سنی خیلی بالا گزارش کرده اند [104]. در نهایت مقایسه نتایج پروژه ما با نتایج به دست آمده از مطالعات سایرین، نشان می دهد که با افزایش سن و گذراندن دوران کودکی و جوانی و نیز میان سالی و ورود به دوران پیری، میزان کلاژن نوع iv غشای پایه عروق ریز مغز افزایش می یابد. دلایل بروز تغییرات در پروتئین های ماتریکس خارج سلولی عروق با افزایش سن واضح نمی باشد. نه تنها افزایش سن با افزایش پروتئین های ماتریکس خارج سلولی همراه می باشد بلکه این تغییرات را در بیماری های مختلفی مثل فشارخون، تومور مغزی [117]، پارکینسون [111] و آلزایمر [105] نیز می توان مشاهده کرد. علت افزایش میزان کلاژن iv غشاء پایه عروق ریز مغزی در سنین بالا، شرکت سلول های اندوتلیال در ساخت این کلاژن و همچنین احتمال همکاری آستروسیت ها با سلول های اندوتلیال [104, 105] و یا کاهش فعالیت سیستم های پروتئولیتیک مانند متالوپروتئیناز های ماتریکس و سیستم پلاسمینوژن/پلاسمین، مطرح شده است [118]. نتیجه حاصل از مطالعات مختلف بر تغییرات فرا ساختاری عروق ریز مغز می تواند توضیح دهنده این مسئله باشد که با توجه به این که حفظ فعالیت مغزی نرمال در بین فاکتور های متعدد، وابسته به سلامت سد خونی مغزی می باشد، افزایش وابسته به سن کلاژن در غشاء پایه عروق ریز مغز ممکن است نقص در نقل و انتقالات مواد مغذی از جمله گلوکز را از طریق سلول های اندوتلیال و در نتیجه القا کاهش مزمن گلوکز در مغز را موجب بشود که در نهایت در صورت عدم تامین نیاز های متابولیکی مغز عملکرد آن ممکن است تحت تاثیر قرار بگیرد و در افراد با سنین بالا شاهد کاهش قدرت درک و عملکرد باشیم. در مطالعات انجام شده تا کنون، تغیرات وابسته به سن متفاوتی در فراساختار مویرگ های مغزی گزارش شده است. علاوه بر تغییر میزان پروتئین های ماتریکس خارج سلولی عروق، کاهش خفیفی در تعداد سلول های اندوتلیال در قشر مغز رت [37, 119] کاهش بارز تعداد سلول های اندوتلیال و پریسیت ها در شبکیه رت [120] و انسان [121]، کاهش و یا عدم تغییر در تعداد میتوکندری های سلول های اندوتلیال و افزایش در ضخامت غشاء پایه ای [14, 27, 99]، هیپر تروفی استطاله های آستروسیت ها که مویرگ ها را احاطه می کنند و دژنره شدن سلول های پیرامیدال در لایه های iii و v قشر حرکتی رت های 32 ماهه [104]، تغییرات میانگین قطر مویرگی به صورت افزایش میانگین قطر در قشر مغز رت [37, 122] و نیز انسان [25]، کاهش قطر عروق ریز قشر مغز رت [39] و یا عدم تغییر قطر مویرگی با افزایش سن در قشر مغز انسان [24] و قشر حسی پیکری مغز موش [123] دیده شده است. از بین تغییرات مورفولوژیکی وابسته به سن ایجاد شده در بافت، تغییر تراکم عروق ریز به این دلیل که تراکم عروق ریز در واحد حجم نوروپیل، به طور قابل بحثی نشان دهنده وضعیت عروق ریز می باشد و می تواند تعیین کننده فاصله یک سلول از منبع اکسیژن و مواد مغذی باشد، اهمیت بسزایی دارد که در این پروژه مورد بحث و بررسی قرار گرفت. به طور کلی تغییر در فعالیت نورونی در طی دوران تکامل، منجر به تغییر قابل پیش بینی در تراکم عروق ریز می شود با توجه به این مسئله که شروع رشد جاندار در محیط زیست به طور مشخصی باعث افزایش سیناپتوژنز و رشد نوروپیل ها در قشر مغز می شود، افزایشی در نیاز های متابولیکی نیز ایجاد خواهد شد که منجر به رشد عروق جدید می شود. به این ترتیب کاهش فعالیت نورونی نیز منجر به کاهش رشد می شود. در نتیجه عواملی که باعث تغییر در عملکرد نورونی و تامین نیاز های متابولیکی آنها می شود می تواند تراکم عروق را نیز تحت تاثیر قرار بدهد [124]. مطالعات مختلفی عروق ریز مغزی را در افراد جوان و مسن به منظور تشخیص تغییر وابسته به سن در تراکم، بررسی کرده اند. گرچه گزارشات فراوانی در باره کاهش وابسته به سن تراکم عروق ریز در اندام هایی مانند قلب و عضله اسکلتی وجود دارد [125, 126]. تنها تعداد معدودی از مطالعات اثر افزایش سن را بر تراکم عروق ریز مغزی بررسی کرده اند. در پروژه حاضر، به منظور بررسی تغییرات وابسته به سن تراکم عروق ریز مغز موش بخش اکسی پیتال مغز به دلیل تراکم بالای عروق ریز انتخاب و فرمول lv = 2q.a، به کار گرفته شد [27]. در این فرمول، lvنشان دهنده تراکم عروق در واحد حجم می باشد. نتایج حاصل، افزایش تراکم عروق ریز قشر اکسی پیتال مغز موش های گروه سنی شش ماهه را نسبت به تراکم عروق ریز همان بخش در مغز موش های گروه سنی یک ماهه نشان دادند و با انجام محاسبات آماری مشخص شد که در این دوره سنی افزایش ایجاد شده در تراکم عروق ریز از سطح معنی داری برخوردار می باشد (0.005p=). همچنین مقایسه نتایج حاصل از بررسی تغییرات وابسته به سن در تراکم عروق ریز بخش اکسی پیتال مغز موش های شش ماهه با تراکم عروق ریز همان ناحیه از مغز موش های دوازده ماهه، افزایش نامحسوسی را در تراکم عروق ریز مغز موش های دوازده ماهه نسبت به موش های شش ماهه نشان داد و با انجام محاسبات آماری این گونه مشخص شد که در این دوره سنی تغییر ایجاد شده در تراکم عروق ریز از لحاظ آماری معنی دار نمی باشد (0.176p=). نتایج مشابه با نتایج حاصل از این پروژه انجام شده در مطالعه دیگری، شبکه عروق ریز مغز را قادر به پاسخگویی به تغییر در متابولیسم و فشار خون دانسته اند [24] و مطالعه جدید تر دیگری کاهش وابسته به سن تراکم عروق ریز همراه با افزایش میزان کلاژن iv غشائ پایه عروق ریز بخش پوتامن مغز انسان را در نتیجه کاهش رگ زایی در مغز افراد در حال پیر شدن دانسته اند [113]. به طور کلی تا کنون توافق نظر قابل توجهی در مورد اثرات افزایش سن بر تراکم مویرگی مغز به دلیل تفاوت در ناحیه مغزی مورد بررسی به دست نیامده است. زیرا هر ناحیه نیاز های متابولیکی خاصی دارد در نتیجه شبکه عروق ریز متمایزی خواهد داشت و الگوهای مختلفی از تغییرات عروق مشاهده خواهد شد. همچنین روش های متفاوت بررسی تغییرات که در مطالعات استفاده می شود منجر به نتایج نامشابه خواهد شد و این مسئله نیز می تواند مورد توجه قرار بگیرد که تغییرات تراکم عروق ریز می تواند چند فاز متفاوت داشته باشد و در یک دوره سنی افزایش و در دوره سنی دیگری کاهش یابد [113]. در پروژه حاضر نمونه ی موش به دلیل کمی تعداد مطالعات صورت گرفته بر روی آن انتخاب شد و بررسی تغییرات وابسته به سن تراکم عروق ریز، افزایش معنی داری را در تراکم عروق مغز موش ها در محدوده سنی یک تا شش ماهه نشان داده است که با افزایش سن تا دوازده ماهگی این افزایش تراکم عروق به طور خفیفی صورت گرفته است و از نظر آماری معنی دار نمی باشد. در نهایت در نمونه های موش مورد بررسی در این تحقیق، افزایش معنی داری در میزان ظهور کلاژن نوع iv غشاء پایه عروق ریز قشر مغز موش های یک تا دوازده ماهه صورت گرفته است که همراه با افزایش تراکم عروق ریز مغز در این محدوده سنی بوده است و همچنین افزایش میزان بیان کلاژن نوع iv تا سن دوازده ماهگی ادامه پیدا کرده که از نظر محاسبات آماری معنی دار بوده و همراه با افزایش خفیفی در تراکم عروق ریز مغز بوده است. به طور کلی با مشاهده نتایج اکثر مطالعات انجام شده بر روی رت و انسان (رجوع شود به جدول 1-1)، می توان این گونه پیشنهاد کرد که کاهش کلی در تراکم عروق ریز برخی نواحی مغزی مثل هیپوکامپ و قشر مغز با افزایش سن مشاهده می شود که بر خلاف نتیجه مشاهده شده در این پروژه می باشد. این کاهش را در نتیجه از بین رفتن عروق با افزایش سن دانسته اند. همچنین تعداد کمتری از مطالعات انجام شده بر روی همین نمونه ها افزایش تراکم را نشان داده اند. شواهد مبنی بر از دست رفتن مویرگ های مغزی با افزایش سن کافی و قوی نمی باشند و هنوز مطالعات وسیع تری مورد نیاز است. و روش های استریولوژیکی پیشرفته مورد استفاده در مطالعات عروق ریز مغز، در آزمایشگاه های مختلف هنوز در بررسی فرایند پیری مورد استفاده قرار نگرفته اند. برای مشخص کردن الگوی تغییرات وابسته به سن عروق ریز نمونه مورد مطالعه باید نواحی عصبی متعدد در یک نمونه مشخص و با استفاده از یک روش مورد مطالعه قرار بگیرد [5]. ? 4-3 پیشنهادات 1- بررسی تغییرات وابسته به سن عروق ریز قشر مغز موش در سنین بالاتر از 12 ماه. 2- بررسی تغییرات وابسته به سن ضخامت غشاء پایه عروق ریز مغز موش و اثر افزایش وابسته به سن میزان کلاژن نوع iv در تغییر ضخامت غشاء پایه عروق. 3- بررسی تغییرات وابسته به سن در تراکم میتوکندری های سلول های آندوتلیال و ویژگی های این سلول ها. 4- بررسی تغییرات وابسته به سن متالوپروتئیناز های ماتریکس خارج سلولی و مقایسه تغییرات آنها با تغییرات وابسته به سن ایجاد شده در اجزای سازنده ماتریکس های خارج سلولی. 5- ارزیابی تغییرات وابسته به سن در قطر عروق ریز قشر مغز در مقایسه با تغییر میزان کلاژن غشاء پایه عروق ریز. 6- دلایل تغییر وابسته به سن پروتئین های ماتریکس خارج سلولی و افزایش میزان آنها با افزایش سن و در طی بیماری، ناشناخته می باشد و نیازمند تحقیقات بیشتری می باشد.