بخش 193 اسید آمینه ای انتهای کربوکسیل آنزیم آلفا آمیلاز از سویه باسیلوس kr8104 قطعه پروتئینی می باشد که توسط بخش انتهایی ژن کدکننده آنزیم مربوطه کد می شود ولی در آنزیم ترشح شده از این باکتری دیده نمیشود. با توجه به مشاهدات انجام شده این سئوال مطرح می باشد که نقش قطعه 193 اسید آمینه ای انتهای کربوکسیل چیست و چرا این قطعه توسط ژن مربوط به این آنزیم کد می شود در حالی که به نظر می رسد آنزیم مربوطه بدون حضور آن فعالیت خود را می تواند انجام دهد. در تحقیق انجام شده در این پایان نامه ما بخش ژنی کد کننده این قطعه انتهایی را به تنهایی و با کمک یک حامل بیانی در باکتری اشرشیا کلی کلون نمودیم و پس از بیان و خالص سازی قطعه پروتئینی 193 اسید آمینه ای انتهایی نقش های احتمالی که ممکن بود این قطعه 193 اسید آمینه ای داشته باشد مانند نقش چاپرونی، نقش مهار کنندگی و نقش کمک ترشحی را با استفاده از روشهای بیوشیمیایی مورد مطالعه و بررسی قرار دادیم. همچنین ساختار دوم این قطعه پروتئینی را با استفاده از روش طیف سنجی دورنگنمایی دورانی در آب و حلال های تقلید کننده شرایط غشایی مطالعه نمودیم و با ساختار دوم قطعه پروتئین انتهایی کربوکسیل مشابه موجود در آنزیم آلفا آمیلاز از سویه altermonas haloplanctis مورد مقایسه قرار دادیم. در ادامه مطالعه ساختار پروتئین در حضور و عدم حضور حلال های تقلید کننده شرایط غشایی با استفاده از روش فلورسانس انجام شد. نتایج مطالعات بیوشیمیایی نشان داد که قطعه193 اسید آمینه ای انتهای کربوکسیل کد شده توسط بخش ژنی انتهایی کد کننده آنزیم آلفا آمیلاز از سویه باسیلوس kr8104 نقش چاپرونی و مهارکنندگی را دارا نمی باشد و با توجه به نتایج حاصل از روشهای بیوشیمیایی و روش طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی و فلورسانس این احتمال وجود دارد که قطعه انتهای کربوکسیل مانند قطعه انتهای کربوکسیل آنزیم آلفا آمیلاز باکتری altermonas haloplanctis یک کمک کننده ترشحی باشد.

امروزه آلودگی آب یکی از بزرگترین مشکلات نوع بشر می باشد و از میان ترکیبات آلوده کننده آب ترکیبات btex (بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و زایلن) ترکیباتی هستند که طیف گسترده ای از بیماری ها را به همراه دارند. زیست گزارشگرهای باکتریایی یکی از ابزاری هستند که توانایی سنجش کیفی و تا حدودی کمی آلودگی های زیست محیطی را دارا می باشند و این پتانسیل را دارند که جهت غربالگری نمونه های محیطی قبل از آنالیز دقیق آنها با روش های استاندارد مورد استفاده قرار گیرند. بعضی از باکتریها و قارچها دارای ژنهایی هستند که محصول روشن شدن آنها آنزیمهایی با توانایی باز کردن این ترکیبات حلقوی به شکل خطی و مصرف نهایی آنها به صورت واسطه های چرخه کربس و در نهایت زیست پالایی این مواد می باشد. یکی از این موجودات تجزیه کننده ترکیبات btex باکتری ralstonia pickettii pko1 می باشد. اپرون tbua1ubva2c اولین آنزیم مسیر تجزیه ترکیبات btex را در این باکتری کد می کند و tbua1 بخش پروموتری این اپرون می باشد که آنزیم rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از آن را انجام می دهد اما این آنزیم دارای تمایل بسیارکمی برای شروع رونویسی از tbua1می باشد. پروتئین فعال کننده رونویسی tbut مسئول کنترل مثبت این اپرون می باشد و این توانایی را دارد تا در حضور ترکیبات btex به توالی uas از این اپرون متصل شود و این کمپلکس حاصل با میان کنش با rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از tbua1 را تقویت می کند. در این تحقیق یک توالی سنتزی ساخته شد که توانایی تولید پیوسطه tbut را داراست. ژن گزارشگر gfp در این توالی تحت کنترل پروموتر tbua1 بیان می شود و این استراتژی سبب می شود که در حضور ترکیبات btex باکتریهایی که این توالی سنتزی به صورت الحاق شده در ناقل pgem-7zf(+) به درون آن ها وارد شده است از خود پیام فلورسنس تولید کنند. در این تحقیق اثر عواملی مانند نوع محیط کشت، نوع میزبان، دمای کشت، مرحله رشد بر این زیست گزارشگر و پارامترهای اختصاصی بون، حساسیت و lod آن سنجیده شد و با سایر گزارشات مشابه مقایسه شده است. نتایج نشان می دهد نوع محیط کشت و مرحله رشد بر پاسخ زیست گزارشگر موثر است و دمای 37 درجه سانتیگراد بهترین دمای بررسی زیست گزارشگر می باشد. میزان lod تولوئن و زمان پاسخ بعد از القا به ترتیب 5 میکرومولار و 48 ساعت می باشد. پاسخ زیست گزارشگر به ترکیبات btex اختصاصی است و دارای بیشتری انتخاب پذیری به تولوئن می باشد. همچنین نتایج نشان داد پاسخ زیست گزارشگر به مخلوط ترکیبات btex جمع پذیر می باشد.