کریپتوسپوریدیوز از بیماریهای انگلی بوده که دراثر تک یاخته کریپتوسپوریدیوم ایجاد شده و گاسترو آنتریت حاد یا مزمن را بوجود می آورد (marques et al., 2005). این انگل در حاشیه میکروویلیهای اپتیلیوم روده ساکن شده و موجب بروز علائم بالینی میگردد که از یک اسهال حاد آبکی در افراد با ایمنی کامل (immunocompetent) که خود محدود شونده است شروع، و تا گاستروآنتریت شدید مزمن در افراد دچار ضعف سیستم ایمنی immunocompromised)) که می تواند منجر بمرگ شود متغیراست (xiao et al., 2004). علائم بالینی بیماری شامل اسهال آبکی، دردهای شکمی و کاهش وزن میباشد که از این نظر مورد توجه پزشکان و دامپزشکان قرار می گیرد (et al., 2000 makni). از جمله عوارض مهم و شایع بیماری اسهال می باشد که نیاز به تشخیص سریع و مطمئن را ایجاب می کند بویژه در افراد با نقص ایمنی، که میتواند حتی منجر به مرگ میزبان شود(leitch & he, 1994a; 1994b; 1999) و اکنون به همراه دیگر عوامل عفونی در ردیف مهمترین پاتوژنهای روده ای مولد اسهال در انسان قرار میگیرد (محدث و قربانی, 1370). با توجه به رقم بالای کریپتوسپوریدیوز در مبتلایان به نقص ایمنی در جهان و شیوع 33.4% و 11.1% بترتیب در مبتلایان به ایدز و بدخیمی های خونی دارای اسهال در ایران nahrevanian & assmar, 2006) ، نهروانیان, 1383) اهمیت این انگل آشکار میشود. از مهمترین عوامل مستعد کننده آلودگی میتوان از سن و وضعیت ایمنی نام برد (باغبانزاده و رسولی، 1368). بطوری که بیماران با نقص ایمنی به آلودگیهای ناشی از آب و غذا بسیار حساس بوده و خطرات جدی آنان را تهدید می کنند .(makri et al., 2004) از نقطه نظر علائم بالینی میتوان از اسهال، بی اشتهایی، استفراغ، دردهای شکمی، تب و کاهش وزن نام برد که در افراد با ایمنی کار آمد این علائم حداکثر طی سه هفته خود بخود محدود شده و بیماری بهبود می یابد اما در افراد با نقص ایمنی بویژه در t–cell deficiency، انگل سبب ایجاد اسهال طولانی مدت، سوء جذب و کاهش فوق العاده وزن میگردد.(hunter p.r. & nichols, 2002) در مبتلایان به ایدز, اسهالهای ناشی از c. parvum خطرات جدی را برای آنان ایجاد نموده است2004; cranendonk et al., 2003) (de souza et al., . در بیماران با نقص ایمنی اگر درمان صورت نگیرد, بیماری به شکل مزمن در آمده و اشکال خارج گوارشی بروز میکند (gentile et al., 1991; gardner et al., 1991). راهکار ایمنی بدن علیه انگل، حضور پادتنهای موضعی با همکاری ایمنی سلولی است که در زدودن انگل از روده نقش دارد و همکاری دفاع سلولی و هومورال در مهار انگل قابل توجه است، ولی ایمنی سلولی نقش مهمتری دارد (reese & betls, 1991). نقص ایمنی اکتسابی بیماران به نوع و مقدار عوامل سرکوبگر ایمنی (immunosuppressive agents) بستگی دارد که منجر به آسیب رسانی مکانیزم های ایمنی میگردد. از عوامل عمده این نوع نقص ایمنی میتوان طحال برداری، درمان با داروهای سرکوبگر ایمنی چون کورتیکواستروئیدها، سایتوتوکسیکها و پرتو درمانی را نام برد (نهروانیان, 1373; makni et al., 2000)، بعلاوه ارتباط بین تکثیر این انگل و شدت سرکوب عوامل موثر در ایمنی میزبان بوضوح مورد تایید قرار گرفته استmakni et al., 2000) )، بطوریکه حضور کریپتوسپوریدیوم در افراد عادی و در بیماران دچار نقص ایمنی چون ایدز، بدخیمی ها، آماگلوبولینمی و تحت درمان با داروهای سایتوتوکسیک گزارش شده است rezk et al., 2001) et al., 1985; casemore). از طرفی, موارد متعددی از آلودگی تجربی در حیوانات آزمایشگاهی با ایمنی سرکوب شده, نیز گزارش گردیده است(yang et al, 2000; habib et al., 2002) . آلودگی به این انگل از طرق مختلفی از جمله انتقال شخص به شخص، حیوانات، غذا و یا آب گسترش می یابد (& nichols, et al., 2002 hunter)، بنابراین از نقطه نظر اهمیت موضوع، آلودگی به کریپتوسپوریدیوم را به دلایل زیر بایستی جدی در نظر گرفت: الف) هنوز روش درمانی کاملا‍“ موثری برای مقابله با آن شناخته نشده است. ب) مرگ و میر ناشی از اسهالهای کریپتوسپوریدیایی در مبتلایان به نقص ایمنی بویژه در ایدز قابل ملاحظه بوده است. ج) بدلیل کوچکی و مقاومت انگل راه اساسی برای از بین بردن آن مشخص نشده است. از طرفی با توجه به بکارگیری تعداد زیادی از داروها بر علیه کریپتوسپوریدیوم، ناموفق بودن اکثر آنها به اثبات رسیده است اما گزارشات درمانی نسبتا“ رضایت بخشی در مورد برخی داروها ارائه شده است (نهروانیان, 1373). با توجه به جدی بودن کریپتوسپوریدیوز در افراد با نقص ایمنی و اهمیت محافظت آنان در مقابل عفونت، هنوز اطلاعات کامل در زمینه شناسایی انگل و آنتی ژنهای محافظت کننده، مکانیزم ایمنی، درمان و واکسن در دسترس نیست (et al., 1991 current & garcia)، لذا مشابه سازی انسانهای با نقص ایمنی در میزبان حیوانی میتواند در شناخت بیشتر انگل و تعامل آن با میزبان کمک شایانی داشته باشد. بررسی هایی که تا کنون در مورد کریپتوسپوریدیوم در ایران انجام شده اند اکثرا با رویکرد اپیدمیولوژیک بوده و توجه کمتری به مطالعات بنیادین شده است، لذا هدف این پژوهش، مدلسازی بیماری در حیوانات با نقص ایمنی، تلقیح انگلهای بومی به این حیوانات، تکثیر انگل و شناسایی ایزوله های ایرانی کریپتوسپوریدیوم می باشد. + ب – هدف و ضرورت تحقیق: با توجه به رشد فزاینده ایدز در کشور و نقش بارز کریپتوسپوریدیوم در مرگ و میر این بیماران ((nahrevanian & assmar, 2006 اهمیت این بیماری واضح بوده و اساس یک برنامه مدون در راستای کنترل، پیشگیری و درمان بیماری نیازمند در اختیار داشتن اطلاعات کلی از عامل پاتوژن میباشد. لذا مدلسازی بیماری در حیوانات با ایمنی سرکوب شده اساس چنین مطالعاتی میباشد که در این راستا، در مطالعه حاضر فیزیوپاتولوژی تک یاخته کریپتوسپوریدیوم در موشهای inbred با ایمنی سرکوب شده مورد تحقیق قرار میگیرد. پ – پیشینه تحقیق: کریپتو سپوردیوم در آغاز توسط clarke از سلول های اپیتیلیالی گاستریک موش در سال 1895 جداسازی شدند او از آنها به عنوان خوشه های مخمری در آن سلول ها توصیف کرد بعدها آنها به عنوان گونه های جدید توسط tyzzer در سال 1907 شناسایی شدند.(keusch و همکاران 1995) در سال 1991 scagliam و همکارانش چرخه زندگی c-parvum را در موش به وسیله میکروسکوپی contrast – interference namarski شناسایی کردند.در سال 1995 lxiao و همکارانش بر اساس لوکوس ژن زیررا حد کوچک rrna تحلیل فیلوژنتیکی از انگل های کریپتوسپوردیوم انجام دادند و گوناگونی ژنیتیکی در c-parvum و گونه های مرتبط را شناسایی کردند. ت – روش اجرای طرح: نوع تحقیق و جمع آوری نمونه ها: این تحقیق از نوع تجربی (experimental) بوده و با رعایت مفروضات و در طول شانزده ماه انجام میشود. در مرحله اول با اعزام اکیپهای نمونه گیری به مراکز بهداشتی درمانی مخصوص کودکان و افراد با نقص ایمنی و دامداریها، نمونه های مدفوع موارد مشکوک انسانی و حیوانی دارای گاستروآنتریت جمع آوری میشوند. نمونه ها پس از ثبت کد مخصوص و ضمیمه کردن فرم اطلاعاتی مربوطه به آزمایشگاه انگل شناسی منتقل می گردند. پس از آزمایش مستقیم و استفاده از روش تغلیظ(concentration) بر روی قسمتی از نمونه، با روشهای مختلف اختصاصی برای تشخیص کریپتوسپوریدیوم مورد آزمایش قرار میگیرند. تثبیت نمونه ها، تغلیظ و تهیه گسترش پس از ملاحظه وضعیت فیزیکی و قوام مدفوع و ثبت مشخصات آن، حجمی به اندازه یک فندق از آنرا برداشته و در بافر مخصوص فیکساسیون (فرمل-بافر-گلیسیرین) بصورت محلول درآورده تا آماده عمل تغلیظ شود .(gardner et al., 1991) پس از انکوباسیون در بافر فوق که برای غیر فعال شدن ارگانیزمهای پاتوژن صورت میگیرد، سوسپانسیون حاصله یا بوسیله(dia sys co.) paraseb مورد آزمایش قرار میگیرد و یا از چهار لایه تنزیب گذرانده و در لوله سانتریفیوژ ریخته و با دور 2000 بمدت دو دقیقه سانتریفیوژ می نمائیم مایع رویی را دور ریخته و از رسوب حاصله جهت تهیه گسترشهای لازمه استفاده میکنیم. مقدار کمی از رسوب جهت تشخیص کیست تک یاختگان و لارو کرمها مورد بررسی قرار می گیرند. برای هر نمونه یک گسترش تهیه نموده و سپس در حرارت آزمایشگاه خشک کرده و بعد بوسیله متانول آنها را فیکس میکنیم. درگسترش فوق را با روش رنگ آمیزی اسید فاست (afs) به جستجوی انگل کریپتوسپوریدیوم می پرزیم (شجاعی, 1371، صراف, 1371، نهروانیان, 1372) و پس از اثبات آلودگی به کریپتوسپوریدیوز، انگلهای نمونه اولیه (بدون فیکساتور) شسته، جداسازی و شمارش میشوند. روش رنگ آمیزی اسید فاست acid fast staining گسترشهای مدفوع را با متانول فیکس کرده سپس رنگ آمیزی با کرمول فوشین با استفاده از حرارت انجام تا اضافه رنگ بخار شود. شستشو با آب و رنگبری با اسید الکل تا ناپدید شدن رنگ قرمز فوشین صورت پذیرفته و در مرحله بعدی پس از رنگ آمیزی با مالاشیت گرین، لامها را با آب شیر شستشو داده، در حرارت آزمایشگاه خشک نموده و در پایان, با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار می گیرند. سرکوب ایمنی در موشهای balb/c و c57 نقش سرکوبگر دگزامتازون (dex) بر سیستم ایمنی مورد تایید قرار گرفته است 1992) et al., 1994; rasmussen et al., .(verdon موشهای ماده balb/c و c57 4 تا 6 هفته و به وزن 15 تا 20 گرم برای این مطالعه در نظر گرفته شده اند. دگزامتازون (sigma, chemical co. uk) بعنوان داروی سرکوب کننده ایمنی با دوز تزریقیµg/day 125 بصورت داخل صفاقی (i.p.) به مدت 14 روز بکار برده میشود. پس از تایید سرکوب ایمنی با روشهای اختصاصی، ااسیستهای کریپتوسپوریدیوم بصورت خوراکی توسط گاواژ به تعداد 106 × 2 تلقیح میشوند1992) et al., 1994; rasmussen et al., .(verdon همچنین به موشهای سالم (naive) نیز ااسیستهای کریپتوسپوریدیوم به تعداد فوق الذکر تلقیح میشوند، این گروه برای ارزیابی بیماری در میزبان با سیستم ایمنی کامل و برای اثبات عدم نقص ایمنی بکار میروند تلقیح انگل در حیوانات با ایمنی سرکوب شده تعداد 106? 2 ااسیست در هر تلقیح بصورت خوارکی بکار برده میشود. نمونه های مدفوع حیوانات آزمایشگاهی 6 تا 9 روز پس از آلودگی آزمایش و از نظر وجود ااسیت انگل مورد آزمایش قرار میگیرند. پس از انجام پاساژهای مکرر و اثبات آلودگی ایزوله های پایدار در حیوانات مورد نظر، آنها را با روشهای انسانی کشته و کلیه اجزاء دستگاه گوارش جدا میشوند، بطوریکه محتویات lumen در pbs بصورت سوسپانسیون درآمده و از یک سری توریهای فلزی که حداقل منافذ آنها µm 100 می باشند عبور داده شده تا اجزاء درشت آن جدا شوند. سپس محلول بدست آمده را بمدت 30 دقیقه در g 1000 سانتریفیوژ نموده و در دمای ?c 4 در محلو ل k2cr2o تازه نگهداری می شود. قبل از استفاده، ااسیستها در محلول 5/0% nonidet p-40 دوبار شسته شده و با روش فلوتاسیون سوکروز تغلیظ میشوند. ااسیستها از بقیه مواد زاید با روش سانتریفیوژ دانسیته گرادیان با استفاده از گرادیان cscl جداسازی شده و در pbs در دمای ?c4 برای 2 هفته نگهداری میشوند. اندازه گیری میزان تکثیر انگل در میزبان: ده گرم مدفوع حیوانات در 5 میلی لیتر فیکساتور بصورت سوسپانسیون درآمده و با استفاده از paraseb و پس از 5 دقیقه در g 3000 سانتریفیوژ رسوب برای شمارش ااسیستها مورد استفاده قرار میگیرد. بطوریکه پس از تهیه گسترش، آنها را با متانول فیکس کرده سپس رنگ آمیزی با روش اسید فاست acid fast staining بر روی آنها انجام میشود و در مرحله بعدی، لامها را با آب شیر شستشو داده، در حرارت آزمایشگاه خشک نموده و در پایان, با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار می گیرند. در هر نمونه تعداد ده فیلد میکروسکوپی با عدسی 100 بصورت تصادفی انتخاب و از نظر تعداد ااسیستها مورد شمارش قرار گرفته و میانگین آن بصورت درصد بیان می شود. بررسی وجود اشکال خارج گوارشی انگل: اندامهای هدف چون کبد، طحال و ریه را جدا نموده و از هر کدام گسترشهایی بصورت impression smear (گسترش فشاری) تهیه نموده و پس از انجام رنگ آمیزی با روش اسید فاست از نظر وجود ااسیستهای انگل مورد بررسی و تایید قرار می گیرند. بررسی پاتولوژیک انگل در اندامهای هدف موشهای balb/c و c57bl/6 بافتهای روده، کبد، طحال و ریه را جدا نموده و پس از تهیه مقاطع بافتی بوسیله میکروتوم با رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین he ، پاتولوژی کریپتوسپوریدیوزیس مورد بررسی و مقایسه قرار می گیرد.