مقدمه: امروزه تولید انواع واکنش پذیر اکسیژن(ros) در سیستم تولید مثلی مردان، به یک موضوع قابل توجه تبدیل شده است. این امر به علت اثراتی است که می تواند بر روی کیفیت و عملکرد اسپرم و در نتیجه آن بر روی نرخ ivf و تکوین جنین ها گذارد. از طرف دیگر نظریه رادیکال های آزاد در تکوین بیان می دارد که ros می تواند سبب تغییر در الگوهای متیلاسیون شود. از این رو در این مطالعه اثر ros برروی حرکت و تعداد اسپرم ها مورد بررسی قرارگرفته و ارتباط آن با نرخ ivf و تکوین جنین ها در محیط in vitro نیز بررسی شده است. همچنین سطح متیلاسیون اسپرم در لوکوس های ژنی h19، igf2 و mest و متیلاسیون کلی ژنوم اسپرمی نیز مورد بررسی قرار گرفته است. روش ها: رت ها در دو گروه کنترل(متشکل از 11 نمونه) و آزمون(متشکل از 16 نمونه) دسته بندی شدند. پس از تعیین دوزکشنده 50 درصد(ld50)، جهت القاء ros مقادیر مناسبی از tbhp به مدت 14 روز به رت های نر آزمون، به صورت درون صفاقی تزریق شد. سپس ros القاء شده در اسپرم به کمک فلوسایتومتر اندازه گیری شد. پس از شمارش و تعیین وضعیت حرکت در اسپرم ها، از آن ها برای انجام ivf و بررسی های مولکولی استفاده شد. وضعیت پیش روی جنین های حاصل از ivf نیز تا مرحله هشت سلولی مورد بررسی قرارگرفت. بررسی های مولکولی شامل: بررسی وضعیت بیانی و تعیین الگوهای متیلاسیون نواحی cpg مربوط به ژن های h19، igf2 و mest در اسپرم و همچنین وضعیت متیلاسیون کلی ژنوم بود. برای بررسی وضعیت متیلاسیون و بیان کمی این ژن ها به ترتیب، روش تعیین توالی بی سولفیت و real-time rt-pcr مورد استفاده قرارگرفت. وضعیت متیلاسیون کلی ژنوم نیز براساس واکنش آنتی ژن-آنتی بادی و با کمک فلوسایتومتر اندازه گیری شد. یافته ها: پس از تزریق مقادیر مناسبی از tbhp، میزان ros در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل افزایش معناداری را نشان می داد. تعداد و تحرک اسپرم ها، نرخ لقاح و وضعیت پیش روی جنین ها در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل به طور معناداری کاهش یافته بود و بین افزایش ros و کاهش یافتن تعداد و تحرک اسپرم ها و نرخ لقاح در گروه آزمون، ارتباط معناداری وجود داشت. بررسی الگوهای متیلاسیون نیز نشان می داد که سطح متیلاسیون cpgها در ناحیه تنظیمی ژن mest و سطح متیلاسیون کلی ژنوم در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل به طور معنادار افزایش یافته است. همچنین بین افزایش ros و هایپرمتیله شدن کلی ژنوم و ژن mest نیز در گروه آزمون ارتباط معنادار وجود دارد. نتیجه گیری: این مطالعه نشان می دهد که القاء ros در اسپرم رت ها برروی تحرک و تعداد اسپرم ها اثر منفی می گذارد. همچنین نرخ لقاح را کاهش داده و بر روی وضعیت پیش روی جنین های حاصل از ivf نیز اثر منفی دارد. به علاوه به نظر می رسد که سبب هایپرمتیله شدن ناحیه تنظیمی ژن mest و افزایش سطح متیلاسیون کلی ژنومی نیز می شود.

نارسایی زودرس تخمدانی (pof) به عنوان توقف عملکرد تخمدان به همراه افزایش سطح گونادوتروپین و کاهش سطح استروژن خون قبل از سن 40 سالگی تعریف می شود. این بیماری 1 % زنان زیر 40 سال را درگیر می کند. به همراه ایجاد نارسایی زودرس تخمدانی، باروری نیز از دست می رود که در بیشتر موارد به علت نبود فولیکول و در دیگر موارد به دلیل ناتوانی پاسخ فولیکول های موجود به تحریک کننده ها می باشد. یکی دیگر از بیماری های ناباروری در زنان کاهش ذخیره تخمدانی (dor) نام دارد. این بیماری با کاهش تعداد و یا کیفیت اووسیت، کاهش تعداد فولیکول های آنترال تخمدان و سطوح بالای هورمون تحریک کننده فولیکولی مشخص می شود. از آنجا که این بیماری ها در بنیان های خانواده دیده می شود مانند بسیاری از بیماری ها می تواند یک پایه ی ژنتیکی داشته باشد. از جمله ژن های کاندیدای ایجاد این بیماری، ژن گیرنده هورمون تحریک کننده فولیکولی (fshr) می باشد. هنگامی که هورمون تحریک کننده ی فولیکولی بر روی گیرنده ی خود می نشیند، یک آبشار سیگنال دهی را درون سلول های گرانولوزا به راه می اندازد که منجر به بلوغ فولیکول ها و در نتیجه تخمک گذاری می گردد. جهش ها و پلی مورفیسم های غیرفعال کننده می توانند عملکرد این گیرنده را مختل کنند و در نتیجه با بلوکه شدن مسیر سیگنال دهی درون سلولی، بلوغ فولیکول ها کامل نمی گردد. هدف از این مطالعه بررسی پلی مورفیسم ها و جهش های غیرفعال کننده ی ژن fshr در بین سه گروه کنترل بارور (40 نفر)، بیماران با نارسایی زودرس تخمدانی (43 نفر) و بیماران با کاهش ذخیره تخمدانی (27 نفر) می باشد. برای مطالعه جهش ها و پلی مورفیسم های مورد نظر ابتدا برای اگزون 7 و 10 پرایمر تهیه و pcr انجام شد. سپس برای بررسی جهش 566c>t که در اگزون 7 واقع است از روشrflp و برای بررسی جهش های 1555c>aو 1043c>g و پلی مورفیسم های 1572c>g و 1993a>g که همگی در اگزون 10 واقع شده اند از روش sscp و به دنبال آن sequencing استفاده شد. تمامی نمونه ها در هر سه گروه دارای ژنوتیپ نرمال بودند. البته قابل ذکر است که پلی مورفیسم شایع 919g>a در هر سه گروه مورد مطالعه به صورت هتروزیگوت، نرمال و پلی مورفیسم کامل مشاهده گردید، اما تفاوت معناداری میان آن ها وجود نداشت. با وجودی که این جهش ها و پلی مورفیسم ها، بخصوص جهش 566c>t در بعضی از جمعیت های دیگر مشاهده شده است، اما این جهش های غیر فعال کننده و پلی مورفیسم ها در زنان pof و dor ایرانی مشاهده نشد. البته برای اطمینان کامل از دخیل نبودن ژن fshr در ایجاد این دو بیماری باید جهش های غیر فعال کننده ی دیگر موجود در این ژن و پروموتور آن نیز بررسی شوند.

پرتوانی به عنوان ظرفیت سلول ها در تمایز به همه ی لایه های جنینی تعریف شده و سلول های بنیادی جنینی، سلول های پرتوانی هستند که از توده سلولِ درونیِ (icm) بلاستوسیست تولید می شوند. سلول های بنیادی جنینی موشی بطور متعارف روی فیبروبلاست های جنین موشی (mef) و در حضور سرمِ گاوی (fbs) کِشت می شدند. مطالعات نشان داده که با مهار دو مسیر پیام رسانیِ mapk و gsk3 ، سلول های بنیادی جنینی از نژادهای مختلف موشی تولید شدندکه این محیط کشت را“2i” نامیدند. با هدف کشف مسیرهای جایگزین و بهینه کردن محیط کشت سلول های بنیادی، تاثیر تعداد زیادی از ریز مولکول ها مطالعه شده است. به تازگی پژوهشگران پژوهشگاه رویان محیط کشت “r2i” را معرفی کرده اند که با بکارگیری دو کوچک مولکول sb431542 و pd0325901 (مهارکننده های مسیر tgfβ و mapk) نه تنها قادر به تولید سلول های بنیادی جنینی با کارایی حدود 100% هستند، بلکه در مقایسه با محیط کشت شناخته شده ی “2i” ، قدرت حفظ پایداری ژنومی بیشتری دارد. در مطالعه پیش رو، بررسی مکانیسم عملکردی تولید و حفظ پرتوانی سلول ها در حضور r2i انجام شده است. بدین منظور در فاز اول، پروفایل بیان ژن در دو رده سلول بنیادی جنینیِ کشت شده در محیط r2i و 2i بررسی شد که ضرورت فعال بودن مسیر پیام رسانی bmp4 در محیط کشت r2i نتیجه گیری شد. ضرورت نقش مسیر آبشاری bmp4 در حفظ وضعیت پایه پرتوانی در محیط کشت r2i با مهار گیرنده bmp4 اثبات شد که باعث تمایز و مرگ سلولی می شود کارایی بالای محیط r2i در تولید رده سلول بنیادی جنینی، این امکان را فراهم می کند که به بررسی مکانیسم این فرایند پرداخته شود. بنابراین در فاز دوم، پروفایل بیان ژنی و متیلاسیون dna در نمونه های جنینِ کشت شده در روند تولید سلول های بنیادی بررسی شد. ما الگوی بیان متفاوتی را در شبکه تنظیمی ژن های مرتبط به پرتوانی، متابولیسم انرژی، و تنظیم کننده های مورفولوژی سلولی از قبیل آبشار اتصالات اپی تلیالی مشاهده کردیم. نتایج متیلاسیون dna ، وضعیت هیپرمتیلاسیون را در سلول های icm به نسبت سلول های es نشان می دهد. در این آزمایش متیلاسیون dna بخصوص در نواحی line1، msat و iap بررسی شده است. این مطاله درک بهتری از مکانیسم مولکولی و مدار تنظیمی تولید سلول های پرتوان جنینی ارائه می دهد. مطالعات مراحل اولیه ی جنینی نشان می دهد که سلول های icm اپی تلیالی شکل بوده و در روند تکوین و تمایز، به سلول های مزانشیمی تبدیل می شوند. بیشتر بافت ها و ارگان ها از تبدیل سلول های اپی تلیالی به مزانشیمی بوجود می آیند. این فرایند تکوینی را emt و تبدیل سلول مزانشیمی به اپی تلیالی را met می نامند. در طرح حاضر، فرضیه ای مطرح شد که انسداد فرایند emt را برای تولید سلول بنیادی جنینی موشی لازم می دانست. به منظور اثبات این فرضیه، بیان ژن های cdh1، snail، و klf4 در روند تولید سلول های es مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین با القاء emt با tgf-β1 و activin در دو محیط کشت 2i و r2i این فرضیه ارزیابی شد که در نهایت منجر به تایید فرضیه "لزوم انسداد فرایند emt" در روند تولید سلول های بنیادی جنینی موشی شد.استفاده از سلول های بنیادی به دلیل توانایی نامحدود در تمایز به سلول های جدید، از مهمترین چشم اندازهای طب ترمیمی تلقی می شود. بنابراین بالا بردن کارایی تولید و کشف مکانیسم های مولکولی درگیر در سلول های بنیادی جنینی موشی، راه کاری برای افزایش دانش تولید و نگهداری سلول های بنیادی انسانی (hescs) نیز خواهد بود.

کلامیدیاها باکتری های اجباری داخل سلولی اند که برای تکثیر خود به سلول های زنده نیاز دارند. به طور میانگین 50% از مردان و 75 % از زنان آلوده به کلامیدیا تراکوماتیس (chlamydia trachomatis : ct) بدون علامت هستند. عفونت ct میتواند تا 4 سال در زوجین حفظ شده و بر باروری آنها تاثیر گذار باشد. وجود ارتباط بین ct و ناباروری از اهمیت زیادی بر خوردار است. از آنجایی که اکثر بیماران بدون علامت بوده و تحت درمان قرار نمی گیرند، وجود پاسخ ایمنی مناسب در صورت عدم آنتی بیوتیک درمانی برای پاکسازی عامل بیماری زا ضروری است. کلامیدیا تراکوماتیس از جمله عفونت های باکتریایی داخل سلولی اند که توسط سلول های nk تشخیص داده می شود. سیگنال های فعال سازیnk از طریق تقابل گیرنده هایی همچون (nkg2d)با ملکول های شبه mhc کلاسi (micab) آغاز می شود.mica ژنی به شدت پلی مورف است که 53 آلل از آن شناسایی شده است. از میان بیماران مراجعه کننده به پژوهشکده رویان، 800 بیمار با پارامترهای نامناسب اسپرم به منظور غربالگری اولیه و تشخیص حضور کلامیدیا مورد بررسی قرار گرفتند. آزمون الایزا به منظور وجود iga بر ضد کلامیدیا تراکوماتیس در پلاسمای مایع منی این افراد انجام شد. سپس dna اسپرم آنها جهت تائید حضور کلامیدیا استخراج و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، بخشی از ژنوم کلامیدیا تکثیر شد. در این بین 62 بیمار مبتلا به عفونت کلامیدیا بودند که 32 نفر آن ها دارای علامت (مانند سوزش در هنگام دفع ادرار، مورفولوژی نامناسب اسپرم ها یا وجود گلبول سفید در مایع منی) و 30 بیمار بدون علامت (ناقلین مخفی) بودند. همچنین 34 نفر با اسپرموگرام نرمال و بدون هیچ گونه سابقه عفونت ct در گذشته به عنوان گروه شاهد انتخاب شدند. روش pcr-ssp نیز توسط 8 پرایمر برای شناسایی آلل-های 008* mica مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی نشان می دهد فراوانی آلل 8 ژن mica در گروه شاهد به طور معناداری بیشتر از گروه کل بیماران و همچنین ناقلین مخفی است(05/0>p). از طرفی فراوانی آلل 8 هیچ گونه اختلاف معناداری در بین گروه کنترل و بیماران با علامت مشاهده نشد(193/0=p). این پلی مورفیسم در بیماران با علامت، اختلاف معناداری با ناقلین مخفی داشت(010/0=p). فراوانی این آلل خاص در گروه شاهد نسبت به مردان نابارور با عفونت کلامیدیا تراکوماتیس نشان می دهد که پروتئین 008*mica می تواند آسیب پذیری میزبان را به عفونت کلامیدیا تراکوماتیس کاهش دهد. همچنین افراد دارای این پروتئین، مقاومت بیشتری نسبت به عفونت کلامیدیایی نشان می دهند. بنابراین نتایج، ژن mica می تواند به عنوان کاندیدای ژنتیکی مناسبی جهت تعیین پتانسیل میزان قدرت سیستم ایمنی میزبان محسوب شود.