امروزه ترکیبات زیستی فعال سطحی که توسط میکرو ارگانیسم ها تولید می شوند به دلیل سمیت پایین، زیست سازگاری و قابلیت تولید با استفاده از مواد تجدیدپذیر و بستر های ارزان قیمت، از اهمیت ویژه ای برخوردار می باشند. در تحقیق حاضر ارزیابی تولید ترکیب زیست فعال سطحی با ساختار لیپوپروتئینی، سورفکتین، که جایگزین مناسبی برای ترکیبات فعال سطحی شیمیایی است و توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس تولید می شود، مورد بررسی قرار گرفت. سویه باکتری مورد استفاده از شرکت dsmz آلمان خریداری شده است. بررسی محیط کشت بهینه درون فلاسک با استفاده شیکر انکوباتور در دمای 30درجه سانتیگراد انجام شد. در ابتدا یک محیط کشت سنتز شده مناسب برای رشد باکتری و همچنین تلقیح شناسایی شد. سپس مشخص شد که وجود پپتون وعصاره مخمر در محیط کشت سبب افزایش رشد باکتری و تولید سورفکتین می شود. با استفاده از طراحی آزمایش ها به روش تاگوچی، غلظت بهینه آنها در محیط کشت بررسی شد. این آزمایش ها نشان داد استفاده از غلظت پپتون g/l 5 در محیط کشت پایه، تولید سورفکتین را از 1287به ppm 2427 افزایش می دهد. استفاده از مواد ارزان قیمت در محیط کشت باعث کاهش هزینه تولید سورفکتین می شود. آب پنیر یک منبع کربنی سرشار از لاکتوز است که جایگزین منبع کربنی گلوکز در محیط کشت پایه شد. سپس محیط کشت بر پایه آب پنیر با استفاده از عوامل موثر در تولید سورفکتین شامل پپتون، عصاره مخمر، نمک های معدنی، سولفات منیزیم، ونمک های پتاسیم هیدروژن فسفات غنی سازی شد. برای این کار با کمک طراحی آزمایش ها به روش تاگوچی تاثیر هر کدام از عوامل موثر بررسی ونقاط بهینه تولیدسورفکتین بدست می آمد. نتایج بدست آمده نشان داد که با استفاده از محیط کشت بر پایه آب پنیر در غلظت های بهینه اجزای محیط کشت، تولید سورفکتین به میزان ppm 1926 می رسد این مقدار حدود 80 درصد میزان تولید در محیط کشت بر پایه گلوکز بود.

مایکوفنولیک اسید یکی از متابولیت های ثانویه گونه های مختلف قارچ پنی سیلیوم، به ویژه پنی سیلیوم بروی کامپکتوم می باشد که دارای خواص آنتی بیوتیکی، ضد ویروسی، ضد باکتریایی، ضد توموری و بازدارندگی سیستم ایمنی بدن است. یکی از مشکلات موجود بر سر راه تولید میکربی مایکوفنولیک اسید، بازدهی پایین سویه های تولید کننده این ترکیب می باشد. برای حل این مشکل می توان از روش های مهندسی متابولیک برای شناسایی و دستکاری ژن های کدکننده ی آنزیم های تعیین کننده در مسیر بیوسنتز مایکوفنولیک اسید استفاده نمود. مایکوفنولیک اسید یک مروترپنوئید می باشد که بخش پلی کتیدی این مولکول از مسیر بیوسنتز پلی کتیدها و دنباله ی فارنسیلی آن از مسیر بیوسنتز ایزوپرنوئیدها منشأ می گیرد. تحقیقات قبلی نشان داده که در مسیر بیوسنتز بخش ایزوپرنوئیدی مایکوفنولیک اسید، آنزیم های موالونات دی فسفات دکربوکسیلاز (mdd)، ایزوپنتنیل پیروفسفات ایزومراز (ipi) و فارنسیل دی فسفات سنتاز(fds) دارای نقش تعیین کننده هستند. لذا پیش بینی می شود با تغییر بیان ژن های کدکننده ی این آنزیم ها از طریق فنون مهندسی ژنتیک میزان تولید مایکوفنولیک اسید افزایش یابد. این امر مستلزم در اختیار داشتن اطلاعات مربوط به توالی هر یک از این ژن ها می باشد. در این تحقیق به منظور شناسایی سه ژن mdd، ipi و fds در قارچ پنی سیلیوم بروی کامپکتوم mucl 19011 ، ابتدا با روش همسانه سازی بر اساس شباهت توالی ژن های شناخته شده در گونه های قارچی دیگر، قطعاتی از این سه ژن به دست آمد. سپس با استفاده از روش pcr ترکیبی نامتقارن دمایی نواحی بالادست و پائین دست این قطعات ژنی شناسایی شد. در مرحله بعد چیدمان قطعات ژنی با استفاده از نرم افزار bioedit انجام شد و سپس با استفاده از نرم افزارهای تحت شبکه blast و fgenesh به تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی توالی های به دست آمده و پیش بینی توالی پروتئینی و تعیین ساختار ژنی آن ها پرداخته شد. توالی mrna سه ژنmdd ، ipiو fds به ترتیب دارای 1293، 1329 و 1350 جفت باز می باشد. توالی آمینواسیدی پیش بینی شده برای پروتئین های کد شده توسط این ژن ها نیز به ترتیب دارای 360، 270 و 315 اسید آمینه می باشد. ساختار ژنی پیش بینی شده برای ژن mdd وجود دو اگزون را در ساختار این ژن نشان می دهد. ژن های ipi و fds نیز دارای سه اگزون در ساختار ژنی خود می باشند. به منظور تأیید بیشتر، توالی های پروتئینی پیش بینی شده به وسیله ی blastp مورد بررسی قرار گرفتند. مقایسه توالی های به دست آمده از قارچ پنی سیلیوم بروی کامپکتوم mucl 19011 با قارچ های دیگر نظیر پنی سیلیوم مارنفی و اکثر آسپرژیلوس ها، بین 100-96 درصد شباهت را نشان داد.

مایکوفنولیک اسید، یکی از متابولیت های ثانویه است که توسط بعضی از گونه های قارچی تولید می شود. این دارو که دارای خاصیت آنتی بیوتیکی و بازدارنده ی سیستم ایمنی می باشد توسط چندین سویه پنی سیلیوم تولید می شوند که در این میان پنی سیلیوم بروی کامپکتوم بیشترین تولید را نشان داده است. قارچ های تولیدکننده ی متابولیت های ثانویه، به فراوانی در خاک یافت می شوند. حضور قارچ های تولید کننده ی این آنتی بیوتیک نیز در خاک گلخانه ها، جنگل های بارانی گرمسیری و زمین های کشاورزی و نیز مواد غذایی، میوه و لبنیات فاسد گزارش شده است. در این تحقیق به منظور جداسازی سویه پنی سیلیوم بومی مولد مایکوفنولیک اسید، از خاک مناطق مختلف و نیز مواد فاسد ذکر شده نمونه برداری انجام شد. پس از کشت نمونه ها روی محیط کشت اختصاصی، 140 سویه پنی سیلیوم جداسازی گردید. تمامی این سویه ها در محیط کشت مایع (czapek-dox) و به مدت 12 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند. سپس از محلول رویی کشت نمونه-برداری و از نظر تولید این آنتی بیوتیک با hplc آنالیز شدند. 3 سویه پنی سیلیوم بومی تولیدکننده ی مایکوفنولیک اسید جداسازی شد و سویه ی با بالاترین تولید از نظر مورفولوژیکی(ماکروسکوپی و میکروسکوپی) و ملکولی(توالی s rdna18) شناسایی شد. نتایج نشان داد که این سویه پنی سیلیوم گلابروم می باشد که تاکنون تولید این آنتی بیوتیک توسط آن گزارش نشده است. همچنین حضور دو ژن hmg و mddاز ژن های اصلی مسیر بیوسنتز این آنتی بیوتیک، در سویه تولیدکننده شناسایی شد. برای این کار از پرایمرهای طراحی شده قبل استفاده شد. این پرایمرها پس از انجام همردیفی چندگانه توالی بر اساس توالی-های آمینواسیدی کد شده توسط این ژن ها در گونه های قارچی دیگر، از نواحی حفاظت شده ی بین توالی ها طراحی شدند. قطعات به دست آمده از این ژن ها درون وکتور کلون و تعیین توالی شدند. همچنین برای اثبات بیان این ژن ها، ابتدا استخراج rna و سپس rt-pcr انجام و حضور mrna ی این ژنها اثبات شد. قطعات dna حاصل از rt-pcr کلون و تعیین توالی شدند. در آخر توالی نوکلئوتیدی به دست آمده از ژن و cdna آنها مقایسه شدند

فرآیند ناپیوسته، اشرشیاکلی نوترکیب، پروتئین هورمون رشد انسانی، ضریب انتقال جرم، مدلسازی، شبیه سازی

لیپازها (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولازها ec 3.1.1.3 ) هیدرولیز تری آسیل گلیسرول به اسیدهای چرب و گلیسرول را در حد فاصل لایه چربی و آب کاتالیز می کند.این آنزیم ها کاربردهای فراوانی در صنایع غذایی، کشاورزی، روغن، چوب و کاغذ، پزشکی و دارویی دارند. از مهمترین کاربردهای لیپاز استفاده در شوینده های خانگی برای از بین بردن لکه های چربی می باشد. لیپازهای باکتریایی نوترکیب بخش مهمی از تجارت آنزیم ها هستند. در این تحقیق لیپاز باکتریایی که قبلا" از یک باسیلوس پامیلوس( bacillus pumilus) بومی از خاک جداسازی و ژن مربوط به آن توالی یابی شده بود، در میزبان مخمری پیکیا پاستوریس(( pichia pastoris کلون و بیان شد. پس از تکثیر ژن لیپاز دارای توالی راهنمای باسیلوسی وبدون توالی راهنمای باسیلوسی (لیپاز بالغ) با روش pcr ، محصول pcr در وکتور pgem5zf کلون گردید. سپس ژن لیپاز از حامل کلونینگ خارج ودر حامل بیانی تحت کنترل دو پروموتر الکل اکسیداز و گلیسرآلدهیدفسفات دهیدروژناز کلون شده وسازه حاصل پس از تأیید کلونینک با روش های ملکولی و آنزیمی با روش الکتروپوریشن به درون مخمر بیانی پیکیا پاستوریس( pichia pastoris ) انتقال داده شد. بیان آنزیم لیپاز در محیط کشت بیانی تأیید آن با تست پارانیتروفنیل پالمیتات(pnpp ) و روش sds-page انجام شد. سپس برای بیان بهتر و بالای این آنزیم در مخمر، بهینه سازی قابلیت ترجمه پذیری کدون های ژن باسیلوسی براساس میزبان مخمری انجام و ژن بهینه به صورت مصنوعی ساخته شد و در درون ژنوم مخمر میزبان کلون وبیان شد.در نهایت میزان بیان این دو با هم مقایسه شد.

در این تحقیق شبکه متابولیکی ژنوم-مقیاس باکتری باسیلوس لیکنی فرمیس با الگوبرداری از مدل شبکه متابولیکی باکتری باسیلوس سابتیلیس و همچنین داده های پایگاه kegg، مدل سازی شد. مدل ایجاد شده نهایی دارای 1324 متابولیت و 1277 واکنش است. به منظور ارزیابی مدل ساخته شده، ابتدا شرایط کشت باکتری باسیلوس لیکنی فرمیس بر مبنای محیط حداقلی m9 در مقیاس فلاسک با استفاده از روش آماری تاگوچی بهینه سازی شد. سپس در شرایط بهینه میزان رشد باکتری با غلظت های مختلف گلوکز به عنوان منبع کربن اندازه گیری شد. در ادامه نتایج حاصل از پیش بینی مدل ساخته شده درخصوص شار واکنش تولید زیست توده با نتایج آزمایشگاهی نرخ رشد باکتری باسیلوس لیکنی فرمیس مقایسه شدند. برای اندازه گیری میزان شار قند مصرفی، ابتدا فرایند کشت پیوسته باکتری باسیلوس لیکنی فرمیس با استفاده از یک فرمانتور 2 لیتری برقرار شد. سپس در سرعت های رقیق سازی مختلف، از طریق اندازه گیری میزان گلوکز باقی مانده در خروجی و مقدار اولیه آن در ورودی فرمانتور شارهای مصرف گلوکز به ازای گرم وزن خشک سلول تولید شده محاسبه شد. از مقایسه نتایج به دست آمده در آزمایشگاه برای نسبت قند مصرفی به میزان رشد و مقایسه این نتایج با پیش بینی های مدل شباهت قابل توجهی بین این مقادیر مشاهده شد که نشان می دهد مدل ساخته شده با دقت نسبتا مناسبی میزان رشد باکتری باسیلوس لیکنی فرمیس را در غلظت های مختلف گلوکز به عنوان منبع کربن پیش بینی می کند. در ادامه با استفاده از آنالیز optknock از مدل ساخته شده، برای پیشنهاد ژن های کاندیدا جهت حذف و افزایش تولید 2و3 بوتان د ی اُل استفاده شد. در این آنالیز 2 ژن جهت حذف پیشنهاد شد که در صورت حذف آن ها میزان شار ورودی به مسیر تولید 2و3 بوتان د ی اُل 31% افزایش خواهد یافت.

پژوهش حاضر با هدف شناسایی توالی ژن laea، که یکی از اجزای کمپلکس ولوت می باشد، در قارچ p. brevicompactum انجام می شود. ابتدا ژن پروتئین laea با استفاده از روش tail-pcr شناسایی شده، سپس بررسی های بیوانفورماتیکی با استفاده از نرم افزارهای موجود در داده پایگاه های مختلف بر روی توالی بدست آمده انجام می گردد.