اشریشیاکلی سویه o157:h7 یکی از مهمترین پاتوژن های غذایی تولید کننده بیماری کولیت خونریزی دهنده و ادرار خونی در انسان می باشد. دام های اهلی اصلی ترین مخزن این باکتری بوده و بکارگیری واکسن بر علیه آن یکی از مهمترین را ههای پیشگیری این باکتری می باشد. پروتئین های intimin، tir و espa مهمترین فاکتورهای بیماریزایی این باکتری به حساب می آیند که توسط ژن های حاضر در جزیره پاتوژنسیته lee تولید می شوند. پروتئین espa بخش اصلی از پروتئین هایی است که در ساخت کانال ارتباطی در سیستم ترشحی نوع iii نقش داشته و مانند یک رابط سبب انتقال پروتئین tir به سلول میزبان می شود ( در اینجا انسان) و در نهایت پروتئین intimin با اتصال به tir اتصال باکتری به سلول میزبان را سبب می شود. این اتصال باعث ایجاد ضایعه تخریب دیواره سلول یا ae میزبان می گردد. فرضیه انجام تحقیق بر این اصل است که تولید این 3 عامل بیماریزا به صورت کایمریک و به عنوان یک واکسن خوراکی و همچنین تزریقی در مدل موشی می تواند مانع کلونیزاسیون باکتری e. coli o157:h7 در حیوان شود. برای این منظور یک سازه ژنی حاوی قسمتهای ایمونوژن espa (e) ، eae (i) وtir (t) را با استفاده از یک رابط پپتیدی با ساختار ?- هلیکس به یکدیگر متصل و ژن آن به طور مصنوعی ساخته شد. این ژن مصنوعی براساس کدون های میزبان e. coli و گیاه بهینه سازی و سپس با استفاده از پروموتر t7 درون وکتور بیانیe. coli و دو پروموتر camv35s و fae جهت بیان درون گیاه کامل تنباکو و بذر کلزا درون ناقلین بیانی گیاه کلون شد. با استفاده از پروتئین نوترکیب خالص شده از باکتری، الایزای کمی انجام گرفت و بر اساس آن آنالیز های بعدی در مورد گیاهان تراریخت نشان داد که پروتئین کایمریک درون برگ گیاه تنباکو و دانه کلزا به طور متوسط 3/0 درصد از پروتئین محلول گیاه (tsp) را تشکیل می دهد. گروه های مختلف موشی به صورت زیر پوستی با استفاده از پروتئین کایمر تولید شده در e. coli یا به صورت خوراکی با استفاده از دانه نوترکیب کلزا یا ترکیبی از دو روش (تزریقی- خوراکی) ایمن سازی شدند. بررسی ایمونولوژیک بر روی موشهای ایمن شده به صورت خوراکی و خوراکی/تزریقی نشان داد که ایمنی هومورال به ویژه مخاطی در این حیوانات به خوبی تحریک شده است. موشهای ایمن شده با استفاده از باکتری بیماریزایe. coli o157:h7 مورد چالش قرار گرفتند. نتایج میکروب شناسی کاهش باکتری در مدفوع موشهای ایمن شده را نشان داد. کاربرد گیاهان ترانسژن حاوی این ایمونوژن سه گانه می تواند ابزار مناسبی برای محافظت در برابر حضور و بیماریزایی باکتری e. coli o157:h7 در مدل موشی باشد.

چکیده تراریختی کلروپلاست دارای پتانسیل مطلوبی برای بیان سطوح بالا و مقرون به صرفه پروتئین های نوترکیب در سلو ل های گیاهی است. باکتری اشریشاکلی سویه o157:h7 یکی از پاتوژن های مهم جانوری است که در انسان باعث بیماری اسهال خونی و در برخی از موارد منجر به بیماری مرگبار سندروم خونریزی در ادرار می-شود. شیوع این بیماری در سال های اخیر باعث افزایش تلاش هایی برای تولیدآنتی ژن های ایمنی زا مقرون به صرفه جهت مقابله با این باکتری شده است. پروتئین های espa، intimin وtir از فاکتور های بیماری زایی مهمی هستند که توسط مکان ژنی lee اشریشاکلی سویه o157:h7 بیان می شوند. در این مطالعه، ما فرض کردیم بیان سطوح بالایی از این پروتئین ها به صورت ترکیبی در کلروپلاست گیاه و کاربرد گیاهان ترانس-پلاستوم به عنوان واکسن خوراکی، می تواند سیستم ایمنی را تحریک و از اتصال باکتری به سلول روده و بیماری زایی آن ممانعت نماید. بنابراین پروتئین کایمریک espa: intimin: tir (eit) که کدون های آن برای میزبان پروکاریوتیک بهینه شده بود، در کلروپلاست از طریق تراریختی کلروپلاست بیان شد. گیاهان ترانس-پلاستوم فرضی با استفاده از روش pcr و دورگه سازی سادرن آنالیز شده و الحاق سازه ژنی حاوی eit در کلروپلاست و هموپلاست بودن گیاهان ترانس پلاستوم تایید شد. همچنین آنالیز های elisa و دورگه سازی وسترن ثابت کرد که پروتئین کایمریک eit در کلروپلاست بیان می شود و میزان بیان آن 4/1% کل پروتئین محلول برگ می باشد. در آزمایش های بررسی ایمنی زایی، موش هایی که با روش خوراکی با گیاهان ترانس-پلاستوم ایمن شده بودند، سطوح بالایی از پاسخ ایمنی(آنتی بادی های igg و iga) در سرم و مدفوع نشان دادند که دلیل بر ایمنوژن بودن آنتی ژن eit بیان شده در کلروپلاست گیاه می باشد. بعد از ایمنی زایی، مواجهه موش های ایمن و غیر ایمن با باکتری اشریشاکلی سویه o157:h7، نشان داد که در موش های ایمن تعداد باکتری های دفع شده از روز دوم بعد از چالش به تدریج کاهش می یابد؛ به طوریکه بعد از یک هفته از چالش تقریبا به صفر رسید. در حالی که، در موش های غیر ایمن تعداد باکتری دفع شده کاهش نیافت. نهایتا نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئین eit بیان شده در کلروپلاست ، کاملا ایمنوژنیک بوده و دارای پتانسیل مناسبی برای توسعه یک آنتی ژن ایمنوژنیک خوراکی بر علیه باکتری اشریشاکلی سویه o157:h7 را دارد. کلمات کلیدی: ایمنی زایی، باکتری اشریشاکلی هموراژیک، بیان کلروپلاستی، پروتئین ترکیبی سه تایی