چکیده: آنزیم tissue-type plasminogen activator که به اختصار t-pa نامیده می شود، یک فرآورده ترومبولیتیک است که جهت درمان وقایع ترومبوتیک قلبی و مغزی مورد استفاده قرار می گیرد، مشتقی از این فرآورده به صورت نوترکیب در سلول پروکاریوتی اشرشیاکلی با استفاده از تکنیک dna نوترکیب تولید می شود اما بیان بالای t-pa در e. coli باعث تولید این فرآورده بصورت اگریگیت های غیرمحلول اینکلوژن بادی می شود زیرا باکتری ها فاقد سیستم لازم برای فولدینگ پروتئین در شکل طبیعی هستند و لذا لازم است پروتئین تولید شده در شرایط آزمایشگاهی رفولد گردد. مطالعه حاضر به بررسی اثر تعدادی از کمک حلال ها در فولدینگ خارج سلولی t-pa نوترکیب اختصاص دارد. سلول های e. coli بیان کننده t-pa نوترکیب از طریق حل کردن در بافر لیز و سونیکاسون، لیز گردیده و اینکلوژن بادی جداسازی و تخلیص گردید.اینکلوژن بادی پس از دناتوراسیون در بافر حاوی غلظت های بالای اوره و گوانیدین، با روش رقیق سازی رفولد گردیده و اثر کمک حلال های مختلف از جمله آرژنین و گلوتاتیون اکسید و احیا بصورت منفرد و ترکیبی در ph های مختلف بر میزان حلالیت اینکلوژن بادی و فعالیت بیولوژیک تعیین گردید.نتایج مطالعه نشان می دهد که آرژنین در غلظت های 250 تا1000 میلی مولار اثر مثبت بارزی در حلالیت اینکلوژن بادی دارد. همچنین گلوتاتیون در غلظت 2 الی 20 میلی مولار اثر فزاینده ای بر میزان رفولدینگ t-pa نوترکیب داشته افزودن سوکروز در غلظت 500 میلی مولار به مخلوط رفولدینگ باعث بهبود میزان رفولدینگ می گردد.

اشریشیاکلی یکی از میزبان هایی است که به طور گسترده جهت تولید پروتئین های نوترکیب استفاده می شود. تولید پروتئین نوترکیب به شکل اینکلوژن بادی به عنوان مانعی بر سر راه تولید انبوه پروتئین های نوترکیب بوده است. یکی از راه حل های این مشکل ترشح پروتئین های نوترکیب به واسطه توالی های سیگنالی اختصاصی به فضای پری پلاسمیک است. تا فرصت برای تا خوردن صحیح پروتئین نوترکیب و به دنبال آن تولید پروتئین به صورت محلول فراهم آید. کارائی این سیگنال پپتیدها بسته به نوع پروتئین متفاوت بوده است. پروتئین p-4 لیشمانیا اینفانتوم یکی از کاندید واکسن های مهم بر علیه بیماری لیشمانیوز است که هنگام بیان در e. coli به صورت اینکلوژن بادی بیان می گردد. هدف این تحقیق کلونینگ ژن p-4 لیشمانیا اینفانتوم در وکتورهای paes30 و paes31 تحت سیگنال پپتیدهای dsba و ompa جهت کاربردهای بعدی آن در تولید پروتئین p4 نوترکیب به صورت محلول بوده است. برای این منظور ژن p4 باpcr تکثیر گردیده و در وکتور pgem-teasy کلون گردید. سپس ژن کلون شده با روش هضم آنزیمی از این وکتور جدا شده و در وکتور های paes30 و paes31 کلون گردید. به منظور تایید کلونینگ از روش هضم آنزیمی و pcr استفاده شد که در هر دو وکتور باندی در محدوده bp860 مشاهده گردید که تاییدی بر انجام کلونینگ بود. نتایج حاصل از بررسی بیان پروتئین p4 به روش sds-page نشان داد که توالی سیگنالی dsba باعث تولید پروتئین نوترکیب به حالت محلول شده اما توالی سیگنالی ompa هیچ اثری در بیان محلول پروتئین نداشته است.

گیرنده فاکتور رشد اپیدرمال (egfr) یک پروتئین 170 کیلو دالتونی است که با اتصال به لیگاندهای فاکتور رشد اپیدرمی (egf) و فاکتور رشد تمایز دهندهtgf?) ) باعث القا تکثیر سلولی می شود. فعالسازی مسیر پیامدهی egfr در سلول های سرطانی منجر به تکثیر سلولی، آنژیوژنز، متاستاز و کاهش آپوپتوز می شود. جهت درمان سرطان نیاز به عوامل ضد سرطان جدیدی است که بتواند میان سلول های بدخیم و سلول های نرمال تمایز قائل شود. گیرنده ی فاکتور رشد اپیدرمی با وجود بیان در سلول های نرمال، در انواع تومورها در سطح بسیار بالایی بیان می شود (4،5و6). شواهد مبنی بر نقش egfr در ایجاد انواع سرطان ها منجر به طراحی و تهیه عواملی شده است که به طور کاملا انتخابی این گیرنده را مورد هدف قرار می دهند. نشان داده شده است که درمان های ضد egfr نظیر آنتی بادی های منوکلونال علیه egfr تکثیر سلول های با بیان بالای egfr را هم در شرایط خارج سلول و هم در داخل سلول مهار می کنند (4و5). سایز بزرگ و نیمه عمر در گردش خون طولانی آنتی بادی های کامل مانعی برای نفوذ و توزیع آنها در تومور است و یکی از موارد محدودیت کاربرد آنها جهت مقاصد درمانی و تشخیصی می باشد. این مسئله اهمیت آنتی بادی های تک زنجیره ای را در درمان و تشخیص سرطان ها روشن می سازد (6 و7). آنتی بادی های تک زنجیره (scfv) از متداول ترین انواع آنتی بادی های نوترکیب هستند که به راحتی در انواع سیستم های بیانی تولید می شوند. این آنتی بادی ها دارای محل کامل اتصال آنتی ژن است که شامل نواحی متغیر زنجیره های سنگین(vh) و سبک (vl) بوده که در آنها دمین vh توسط یک قطعه اتصال دهنده یا لینکر قابل انعطاف به دمینvl متصل می شود. لینکر ها پلی پپتیدهایی با طول 10 تا 25 آمینو اسید هیدروفیلیک می باشد که از رایج ترین آنها لینکر دکاپنتا یا پانزده تایی(gly4ser)3 است. این نوع آنتی بادی عمدتا از ژنهای جدا شده از رده سلولی هیبریدومای موشی مشتق میشود و توانایی اتصال به آنتی ژن در آن مشابه آنتی بادی منوکلونالی است که از آن مشتق شده است (8).

سودوموناس آئروژینوزا عامل مهم عفونت بیمارستانی بوده که سپتی سمی ناشی از آن باعث مرگ ومیر زیادی می شود. این باکتری دارای تعداد زیادی از فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی با واسطه پلاسمیدوکروموزوم بوده و آنتی بیوتیکهای جدید نیز مرگ و میر ناشی از آن را کاهش نداده اند. به دلیل مقاومت بالا، ایمونوپروفیلاکسی و ایمونوتراپی ممکن است راه موثری برای کنترل و درمان عفونتهای سودوموناس آئروژینوزا در بیماران بستری در بیمارستان، بیماران سوخته و بیماران سیستیک فیبروزیس باشند. فاکتورهای ویرولانس و آنتی ژنیک مختلف نظیر پروتئین های غشای خارجی، توکسین ها، فلاژل، پیلی پلی ساکاریدهای با وزن مولکولی بالا برای طراحی واکسن و واکسیناسیون مورد بررسی قرار گرفته اند. هدف این مطالعه تولید و تخلیص فیوژن پروتئین نوترکیب اگزوتوکسین a- فلاژلین و ارزیابی خواص ایمنی زایی آن بعنوان کاندید واکسن جدید بوده است. ابتدا ژنهای اگزوتوکسین aو فلاژلین تکثیر ، کلون و در باکتری e. coli بیان گردید. فیوژن پروتئین نوترکیب با روش افینیتی کروماتوگرافی نیکل تخلیص گردیده و کیفیت و ساختار آن با روشهای sds-page و وسترن بلات ارزیابی گردید. آلودگی فیوژن پروتئین نوترکیب به لیپوپلی ساکارید بوسیله تست limulus amoebocyte lysate وتوکسیسیته آن در مدل حیوانی مورد بررسی قرار گرفت. جهت ارزیابی ایمونوژنیسیته، گروههای موشی در روزهای 0-21-42 و 72 با اگزوتوکسینa (دومین i,ii) ، فلاژلین ، اگزوتوکسینa (دومین i,ii)- فلاژلین، اگزوتوکسینa (دومین i,ii) + فلاژلین و pbs بصورت زیر جلدی واکسینه شدند. یک هفته بعد از آخرین تزریق، تولید آنتی بادی در گروههای موشی بوسیله الایزا بررسی گردید و در نهایت میزان محافظت موشهای ایمن وغیر ایمن با تزریق (2x ld50 (7.5 x 107 cfu یک سویه بالینی بصورت داخل صفاقی بررسی گردید. براساس نتایج الایزا تولید آنتی بادی در تمامی گروههای موشی ایمن در مقایسه با گروه شاهد معنی دار بود(p=.00001). محافظت موشها در مقابل تزریق داخل صفاقی (2x ld50 (7.5 x 107 cfu یک سویه بالینی در گروه دریافت کننده اگزوتوکسینa (دومین i,ii)- فلاژلین معنی دار بود(p=0.05). نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند که اگزوتوکسینa (دومین i,ii)- فلاژلین یک ایمونوژن قوی بوده و می تواند بعنوان کاندید واکسن جدید در مطالعات واکسن ضد سودوموناسی مورد استفاده قرار گیرد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.