واکسن های مورد استفاده در درمان و پیش گیری عمدتا دارای آنتی ژن های غیر ضروری می باشند که حجم زیادی از فعالیت سیستم ایمنی را به خود مشغول می نمایند. این آنتی ژن ها در افزایش ایمنی میزبان نقشی نداشته و می توانند جهت بالا بردن ظرفیت تولید آنتی بادی بر علیه آنتی ژن اصلی حذف شوند. در این راستا تولید آنتی ژن های خالص و یا نوترکیب می تواند دررسیدن به افزایش ایمنی و بالا بردن سطح مقاومت میزبان موثر باشند اما تولید پروتئین خالص عمدتا با هزینه بالائی همراه است و امکان استفاده آن در سطح وسیع مقدورنمی باشد . از طرفی در زمانی که چندین آنتی ژن نیاز است که در یک زمان به حیوان تزریق شود استفاده از یک پرو تئین نوترکیب، مقرون به صرفه نمی باشد. در این راستا تهیه بخشی از پروتئین و یا اپی توپ آنتی ژن که بیشترین تحریک کنندگی را در میزبان ایجاد نماید می تواند در کنار چندین اپیتوپ دیگر از چند آنتی ژن مختلف بشکل یک پپتید ترکیبی (fusion protein) از کارآئی بالائی برای ایجاد ایمنی در میزبان بکار گرفته شود.از این روشناسایی اپیتوپ های آنتی ژن ها از اهمیت ویژه ای برخوردار است. جنس باکتری کلستریدیوم و از جمله ، باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس از مواردی است که در ایجاد بیماری در انسان و دام بسیار خطرناک می باشد.بر این اساس در تحقیقات صورت گرفته در این پایان نامه سعی در شناسائی اپی توپ های توکسین اپسیلون این باکتری می باشد. در این پروژه ابتدا پرایمرهای مختلف از ژن توکسین اپسیلون طراحی و قطعات مختلف بوسیله pcr تهیه گردید. سپس قطعات تهیه شده، در پلاسمید ptz57r/t و در نهایت به پلاسمید بیانی pet 21a وارد شده و پپتید های نوترکیب تولیدشده بوسیله روش های مختلف eliza و western blot مورد ارزیابی قرار گرفت. این نتایج نشان داد که بخش های خاصی از توکسین می تواند در واکنش به آنتی بادی اختصاصی واکنشی مشابه با توکسین طبیعی داشته باشد. استفاده از این نتایج و بکار گیری آن در تولید پروتئین های ترکیبی می تواند در بکار گیری تولید واکسن و همچنین ایجاد ایمنی در میزبان برای چند پروتئین با حداقل هزینه مورد استفاده قرار گیرد. واژه های کلیدی: کلستریدیوم پرفرنژنس، توکسین اپسیلون، شاخص های آنتی ژنیک (اپی توپ)، پروتئین های ترکیبی

این مطالعه با هدف همسانه سازی و بیان آنتی ژن سطحی ncsrs2 از انگل نئوسپورا کانینوم در دو سامانه بیانی پروکاریوتی و یوکاریوتی انجام گرفت. پس از تکثیر جایگاه ژنی ncsrs2 و تعیین توالی آن با استفاده از روش ta cloning درناقل ptz57r/t، توالی به دست آمده با توالی سایر سویه های نئوسپورا کانینوم از نظر فیلوژنتیکی مقایسه شدند. نتیجه توالی یابی تحت شماره دسترسی jq410454 دربانک جهانی ژن ثبت شد. آنالیز توالی ژن ncsrs2 بین 98 تا 100 درصد همسانی با توالی های ثبت شده نئوسپورا کانینوم نشان داد. جهت همسانه سازی در باکتری، جایگاه ژنی ncsrs2 با آغازگرهای دارای سایت برشی آنزیم های ecori و sali تکثیر شد و به درون ناقل بیانی pet32a (+) الحاق گردید و پلاسمید نوترکیب حاصل (pet32-ncsrs2) ابتدا جهت تکثیر به باکتری اشرشیا کلی سویه dh5? و سپس جهت بیان پروتئین نوترکیب به باکتری اشرشیا کلی سویه bl21(de3) انتقال داده شد. القای بیان با استفاده از iptg انجام شد. برای همسانه سازی در مخمر pichia pastoris، از آغازگرهای دارای سایت برشی آنزیم های kpni و xbai جهت تکثیر جایگاه ژنی ncsrs2 استفاده شد و فرآورده pcr به درون ناقل بیانی ppicz-b الحاق گردید. پلاسمید نوترکیب حاصل (ppiczb-ncsrs2) به باکتری اشرشیا کلی سویه dh5? انتقال داده شد. پس از غربالگری و تائید صحت همسانه سازی، پلاسمید ppiczb-ncsrs2 با آنزیم pmei خطی شد و با روش الکتروپوریشن به مخمر انتقال داده شد. مخمر نوترکیب در محیط mmh کشت داده شد و بیان پروتئین به کمک متانول تحریک شد. وضعیت بیان پروتئین ncsrs2 در هر دو سامانه بیانی به روش های sds-page، دات بلات و وسترن بلات بررسی گردید. پروتئین های تولید شده استخراج و خالص سازی شدند و فعالیت آنها در محیط آزمایشگاه با آزمون الایزای غیرمستقیم بررسی شد. نتایج این پژوهش نشان داد که ژن ncsrs2 در ناقلین pet32a (+) (باکتری) و ppicz-b (مخمر) به درستی همسانه شده است. ورود ژن ncsrs2 به باکتری bl21(de3) به روش-های کلنی pcr و هضم آنزیمی تأیید شد. ورود ژن ncsrs2 به داخل ژنوم مخمر پیشیا پاستوریس با روش نوترکیبی همولوگ با استخراج dna ژنومی مخمر و انجام pcr تائید شد. بیان پروتئین ncsrs2 در باکتری و مخمر به روش وسترن بلات با مشاهده باند اختصاصی پروتئین هدف تأیید شد. با توجه به انجام واکنش بین پروتئین های تولید شده در این سامانه های بیانی و آنتی بادی اختصاصی نئوسپورا کانینوم در محیط آزمایشگاه می توان گفت احتمالاً این پروتئین ها توانایی ایجاد ایمنی حفاظتی علیه انگل نئوسپورا کانینوم را خواهند داشت. به طور کلی می توان گفت که در این تحقیق ژن ncsrs2 با موفقیت در سامانه-های بیانی پروکاریوتی و یوکاریوتی همسانه و بیان شد به نحوی که پروتئین های تولید شده احتمالاً قادر به تحریک سیستم ایمنی علیه انگل نئوسپورا کانینوم و پیشگیری از انتقال آلودگی می باشند.

نتایج نشان داد که تمامی نمونه های فلفل قرمز مورد بررسی در این مطالعه به گونه های قارچی و باکتریایی آلوده بودند. فلور کپکی نمونه، براساس روشهای مبتنی بر کشت، در محدودهcfu/g 103×4/2 تا cfu/g 106×6/4 شمارش گردید. مطالعات میکروسکوپی کلنی های کپکی نشان داد که 91 در صد از نمونه های فلفل قرمز آلوده به جنس آسپرژیلوس، 58 درصد آلوده به جنس پنی سیلیوم، 33 درصد آلوده به جنس رایزوپوس و33 درصد آلوده به جنس آلترناریا بودند. با استفاده از روش pcr و انجام عمل توالی یابی بر روی dna کلنی های آسپرژیلوس و پنی سیلیوم ایزوله شده از نمونه ها، گونه های aspergillus flavus، aspergillus tubingensis و penicillium chrysogenum شناسایی گردید. نتایج حاصل از انجام کروماتوگرافی tlc نشان داد که در بین سوش های ایزوله شده، 80% از سوش های aspergillus flavus قادر به تولید آفلاتوکسین b1 و 5% از سوش های aspergillus tubingensis قادر به تولید اکراتوکسین a بودند و سایر گونه های آسپرژیلوس و همچنین جنس های پنی سیلیوم، آلترناریا و رایزوپوس توانایی تولید آفلاتوکسین b1 یا اکراتوکسین a را نداشتند. 4/69 و 7/16 درصد از نمونه های فلفل قرمز به ترتیب توسط آفلا توکسین b1 و اکراتوکسین a در سطوح مقادیر 6/15-4/0 میکروگرم بر کیلوگرم و 17/2-74/0 میکروگرم بر کیلوگرم آلوده بودند. بین روش elisa و hplc در تعیین میزان آفلاتوکسین b1 و اکراتوکسین a ، همبستگی خوبی مشاهده گردید ( r2=0/979 و r2=0/947 ). بررسی تاثیر شرایط دمایی و رطوبتی در دوره نگهداری نشان داد که دمای 25 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 95 درصد، بهترین شرایط برای تولید آفلاتوکسین b1 و اکراتوکسین a می باشد و با کاهش رطوبت نسبی و دمای نگهداری به پایین تر از 75 درصد و 10 درجه سانتی گراد، می توان به جلوگیری از تولید این سموم و آلودگی محصول به آنها در دوره نگهداری کمک کرد. مقایسه نتایج بدست آمده در زمینه تاثیر روشهای مختلف آلودگی زدایی بر میزان مایکوتوکسین ها، ویژگی های فیزیکوشیمیایی و ویژگی های میکروبی نشان می دهد که در روش پرتودهی گاما، علاوه بر اینکه میزان آلودگی میکروبی و میزان آفلاتوکسین b1 و اکراتوکسین a بطور محسوسی در محصول کاهش پیدا می کند، کمترین تاثیر منفی در ویژگیهای فیزیکو شیمیایی محصول مشاهده می گردد.

در بعضی موارد پاسخ های ایمنی القا شده توسط نواحی اپی توپی یک آنتی ژن نسبت به کل آن آنتی ژن قوی تر عمل می کند زیرا از اتلاف انرژی سیستم ایمنی روی نواحی غیرضروری جلوگیری کرده و عمدتا بر روی نواحی آنتی ژنیک آنتی ژن متمرکز می شود. از این رو تهیه بخشی از پروتئین و یا اپی توپ آنتی ژن که بیشترین تحریک کنندگی را در میزبان ایجاد می نماید، می تواند در کنار چندین اپی توپ دیگر از آنتی ژن های مختلف بشکل یک پپتید ترکیبی (fusion protein) با کارآئی بالا برای ایجاد ایمنی سریع و چندگانه در میزبان به کار گرفته شود. کلستریدیوم پرفرنژنس عامل بیماری های مهلکی از جمله انتریت نکروتیک، انتروتوکسمی، قانقاریا و... در انسان و دام است، از این رو مطالعه ی آنتی ژن های آن از اهمیت زیادی برخوردار است. هدف از این پروژه نیز تهیه ی فیوژن پروتئینی متشکل از نواحی با آنتی ژنیسیته ی بالا از توکسین بتا و اپسیلون کلستریدیوم پرفرنژنس و بررسی خواص آنتی ژنیک آن می باشد. برای این منظور ابتدا قطعات اپی توپی دو توکسین تکثیر یافته و پس از برش با آنزیم های مناسب، توسط لینکری که طراحی شد به یکدیگر متصل شدند. فیوژن ژن حاصل در وکتور ptz57r و pet21a(+) کلون گردید. وکتور pet21a(+) حاوی قطعه ی فیوژن، به سلول بیانی e.coli bl21(de3) منتقل و پروتئین نوترکیب بیان گردید. بیان پپتید نوترکیب و ویژگی های آنتی ژنیک آن با استفاده از روش های elisa و وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد که فیوژن پروتئین نوترکیب قادر است به خوبی با آنتی بادی های ضد توکسین بتا و اپسیلون واکنش دهد. فیوژن پروتئین توسط کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل بصورت نیمه خالص تهیه و جهت تولید آنتی بادی پلی کلونال علیه آن، به موش تزریق شد. نتایج نشان داد که آنتی بادی نوترکیب ضد فیوژن پروتئین قادر است واکنش مناسبی با توکسین های بتا و اپسیلون برقرار نموده و نسبت به آنتی بادی طبیعی از حساسیت بالاتری برخوردار می باشد. بنابراین آنتی بادی نوترکیب ضد فیوژن پروتئین می تواند جایگزین مناسبی برای آنتی بادی طبیعی ضد دو توکسین باشد و در طراحی کیت های تشخیصی برای تشخیص کلینیکی توکسین بتا و اپسیلون به کار گرفته شود. همچنین در صورت بهینه نمودن تولید و واکنش های نهائی بعنوان کاندید واکسن نیز پیشنهاد گردد.

باکتری clostridium novyi سیتو توکسینی به نام آلفا توکسین تولید می کند که با وزن مولکولی حدود 250-200 کیلو دالتون دارای فعالیت آنزیمی بوده و بر روی گیرنده های rho سلول های پستانداران تاثیر می گذارد و عامل خونریزی رگ ها و گرد شدن سلول ها در محیط کشت است. بررسی های ایمونولوژیکی نشان می دهد که قسمت کوچک از یک آنتی ژن می تواند سیستم ایمنی را علیه کل آنتی ژن تحریک کند به همین دلیل همسانه سازی (کلون) ناحیه از پروتئین که آنتی ژنسیته ی بالا دارد ، امکان جدیدی برای ایمنی علیه توکسین های کشنده است. مرحله ی کلیدی این روش شامل شناسایی و انتخاب ناحیه ی آنتی ژنیک توکسین می باشد. هدف از این مطالعه به کارگیری ترکیبی از روش های بیوانفورماتیک، زیست شناسی مولکولی و تهیه پروتئین نوترکیب به منظور تولید پروتئین با آنتی ژنسیته ی بالا می باشد. ابتدا قطعات با آنتی ژنسیته ی بالا براساس مطالعات بیوانفورماتیکی و ساختار دوم پروتئین انتخاب و پرایمرهای اختصاصی به منظور تکثیر این قطعات طراحی گردید. قطعات تکثیر شده در وکتور کلونینگ ptz57rt وارد و سپس در وکتور بیانی pet21a(+) کلون گردید. پلاسمید حاوی قطعه به وسیله ی pcr تایید گردید. پس از بیان پروتئین نوترکیب، با استفاده از سولفات آمونیوم پروتئین رسوب داده شد و به وسیله کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی نیمه خالص گردید و خصوصیات آ نتی ژنیک پروتئین با تست های (د ات بلات ، وسترن بلات و الایزا) تایید گردید. سپس به منظور بررسی ایمونوژنسیته پروتئین به موش تزریق گردید و سرم حیوان با هدف انجام واکنش متقاطع با توکسین و پروتئین نوترکیب جمع آوری گردید. نتیجه ی تست های ایمونولوژی آنتی بادی تولید شده بر علیه پروتئین نوترکیب، میل ترکیبی بالایی را در مقایسه با توکسین طبیعی نشان داد. به نظر می رسد، روش های بر پایه ی بیوانفورماتیک می تواند احتمال انتخاب قطعاتی با پتانسیل بالای ایمونوژنسیته را افزایش دهند. این استراتژی روشی برای تولید پپتید واکسن و آنتی بادی برای تست تشخیصی و یا تولید لیگاند برای خالص سازی آنتی بادی ها یا پروتئین ها طبیعی به روش کروماتوگرافی میل ترکیبی می باشد

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

بروسلوزیس یکی از بیماری های مهم مشترک بین انسان وحیوان است که عامل آن گونه های مختلف جنس بروسلا می باشند. بروسلاها باکتری های گرم منفی اختیاری درون سلولی هستند که طیف وسیعی از حیوانات و هم چنین انسان را آلوده می کنند، لذا این بیماری، ضررهای اقتصادی و بهداشتی زیادی به بار می آورد. از آن جا که واکسن های قبلی بروسلا، بازدهی ایده آل نداشته اند، ساخت نسل جدیدی از واکسن ها که فاقد معایب پیشین بوده و در عین حال موثر وایمن باشند، اهمیتی ویژه می یابد. واکسن های dna یا واکسن های نسل سوم به دلیل مزیت های فراوانی که نسبت به واکسن های سنتی نشان داده اند، به نحوی گسترده مورد مطالعه قرار گرفته اند. از جمله ویژگی های منحصر به فرد این واکسن ها که آنها را بسیار مورد توجه قرار داده است ایمن و بی خطر بودن آنها، کوتاه بودن روند طراحی و هزینه های پایین تولید وهم چنین توانایی ایجاد پاسخ های ایمنی سلولی و هومورال توسط این نوع واکسن ها می باشد. در این بررسی، ژن omp31 بروسلا ملی تنسیس که به دلیل توانایی اثبات شده آن در القای پاسخ ایمنی، به عنوان کاندیدایی مناسب جهت ساخت واکسن dna شناخته شده است، در وکتور بیانی مناسب pcdna3.1 قرار گرفته و باکتری های e .coli سویه top10 با این وکتور ترانس فورم شدند. سپس باکتری های ترانس فورم شده که بر روی پلیت آگار محتوی آمپی سیلین رشد کرده بودند انتخاب شده و خالص سازی پلاسمید جهت بررسی کارایی بیان آن صورت گرفت. بررسی استخراج rna بافتی پس ازتزریق این پلاسمید نوترکیب به موش، نشان دادکه بیان ژن omp31 با موفقیت انجام شده است. از آن جا که هدف نهایی این طرح، ساخت واکسن اسیدنوکلئیکی می باشد در مطالعات بعدی باید بیان پروتئین و هم چنین توانایی این واکسن در القای پاسخ های ایمنی مصونیت زا مورد بررسی قرار بگیرد.