یونجه (medicago sativa l.) یکی از گیاهان علوفهای مهم است که به خاطر داشتن پروتئین و ارزش غذایی بالا نقش بسزایی در تغذیه دام دارد. علیرغم فعالیت های مدیریتی بهتر، امروزه آفات بخش قابل توجهی از محصولات کشاورزی (13%) را از بین برده و باعث کاهش کیفیت محصول می شوند. علاوه بر این، سموم مورد استفاده برای کنترل آفات دارای اثرات نامطلوبی بر سلامت انسان و محیط زیست هستند. سرخرطومی یونجه (hypera postica gyll.) آفت مهم یونجه در ایران و جهان است و در ایران خسارت ناشی از این آفت 33% برآورد شده است. این تحقیق به منظور انتقال ژن cry3a به یونجه برای ایجاد مقاومت به آفت سرخرطومی صورت گرفت. با توجه به اینکه اولین گام برای دستکاری ژنتیکی این گیاه، بهینه سازی یک سیستم موثر باززایی درون شیشه ای و بدست آوردن ژنوتیپ هایی با قابلیت باززایی بالا است، ابتدا پاسخ جنین زایی دو جداکشت برگ و دمبرگ پنج رقم یونجه ایرانی با استفاده از شش پروتکل مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت. با دو پروتکل iv و vi هر دو جداکشت برگ و دمبرگ کالوس های حاوی جنین سوماتیکی تولید کردند. درصد جنین زایی و تعداد جنین در جداکشت بسته به ژنوتیپ، پروتکل و جداکشت مورد استفاده به ترتیب از صفر تا 12 درصد و صفر تا 5/16 عدد متغیر بود. به منظور گزینش ژنوتیپ های دارای قابلیت جنین زایی بالا، پاسخ جنین زایی 29-21 ژنوتیپ (گیاه) از هر پنج رقم بااستفاده از پروتکل vi مورد ارزیابی قرار گرفت. به طور کلی، 5/10 درصد از ژنوتیپ های مورد ارزیابی قابلیت جنین زایی سوماتیکی را داشتند و سه ژنوتیپ قره یونجه-مراغه-27 (km-27)، قره یونجه-قره قزلو-14 (kk-14) و سینتتیک-18 (syn-18) که قابلیت باززایی بالایی نسبت به بقیه داشتند برای مطالعه بیشتر و بهینه سازی انتقال ژن انتخاب شدند. در این تحقیق، ژن cry3a با استفاده از فناوری dna نوترکیب در ناقل بیانی گیاهی pbi121 تحت راه انداز camv 35s و خاتمه دهنده nos قرار گرفت و برای انتقال به ژنوتیپ های گزینش شده یونجه مورد استفاده قرار گرفت. برای این منظور پاسخ تراریختی دو جداکشت برگ و دمبرگ سه ژنوتیپ گزینش شده به سه سویه اگروباکتری lba4404، agl01 و gv3101 با زمان های مختلف هم کشتی و حضور استوسیرینگون در سوسپانسیون تلقیح مورد ارزیابی قرار گرفت. تعداد 21 جداکشت از جداکشت های مربوط به چهار و هشت روز هم کشتی، جنین های سوماتیکی مقاوم به کانامایسین تولید کردند که همه این جداکشت ها متعلق به ژنوتیپ های km-27 و kk-14 تلقیح شده با سویه های lba4404 و agl01 بودند. متوسط کارایی تراریختی دو جداکشت از دو ژنوتیپkm-27 و kk-14 با سویه های lba4404 و agl01 بر اساس تعداد گیاهان مقاوم به کانامایسین برابر 21/1 درصد بود. کارآیی تراریختی سویه های اگروباکتریوم مورد استفاده متفاوت و فراوانی تراریختی (درصد جداکشت های حاوی جنین های سوماتیکی مقاوم به کانامایسین) حاصل از سویه lba4404 بیشتر از دو سویه دیگر بود. تجزیه pcr با آغازگرهای اختصاصی ژن cry3a، حضور تراژن در 85% گیاهان مقاوم به کانامایسین را نشان داد. بررسی دورگ سازی سادرن در یکی از لاین های تراریخت نیز نشان داد که ژن cry3a در ژنوم این لاین در سه جایگاه مختلف تلفیق شده است. تجزیه لاین های تراریخت با استفاده از روش داس الایزا، بیان پروتئین cry3a در برگ گیاهان تراریخت را نشان داد. زیست سنجی گیاهان تراریخت با آفت سرخرطومی یونجه نشان داد که مقاومت لاین های تراریخت در برابر این آفت افزایش یافته است.

با توجه به میزان خسارت ناشی از بیماری های قارچی، استفاده از تکنیک های بیوتکنولوژی برای تولید گیاهان مقاوم، از اهمیت ویژه ای برخوردار است. بیان ترکیبی از پروتئین های مرتبط با بیماری زایی منجر به القاء مقاومت چندژنی می شود که از یک سو پایداری مقاومت را به همراه داشته و از سویی دیگر باعث مقاومت به طیف وسیعی از قارچ های بیماری زا می گردد. لذا این تحقیق با هدف جداسازی ژن و ساخت سازه های پلاسمیدی چندگانه، حاوی سه گروه مهم از پروتئین های مرتبط با بیماری زایی pr1، pr2 و pr3، انجام گردید. در این تحقیق، پس از طراحی آغازگرهای اختصاصی، ابتدا دو ژن با ویژگی های متفاوت از خانواده pr1، از ژنوم گیاه توتون جداسازی گردیدند و پس از آنالیزهای مربوط به صحت جداسازی ژن، طی مراحلی تحت پیشبر 35s و پایان دهنده nos در پلاسمید دوگانه pbi121 کلون سازی شدند. در مرحله بعد، کلون سازی دو ژن ضدقارچی مهم دیگر، pr2 (β-1 و 3-گلوکاناز) و pr3 (کیتیناز)، تحت کنترل نواحی تنظیمی مستقل در ناحیه t-dnaی ناقل مذکور، به دو صورت همسو و نا همسو به همراه pr1، طی چندین مرحله انجام شد. به منظور انتقال ژن های مذکور به گیاهان تک لپه از ناقل pipkb010 استفاده شد. پس از افزودن قطعه کوزاک به ابتدای ژن prp-1، کاست کامل ژن مذکور در ناقل ptz57r/t ساخته شد. ژن های کیتیناز و گلوکاناز در ناقلpipubi قرار گرفتند و پس از آن ژن kprp-1 در حد واسط کاست ژن های مذکور قرار گرفت. انتظار می رود که ناقل های سه گانه حاصل از این تحقیق، علاوه بر ایجاد مقاومت پایدار به طیف وسیعی از عوامل بیماری زای قارچی در گیاهان تک لپه و دو لپه، دارای پتانسیل ایجاد مقاومت به باکتری و سایر تنش های زنده و غیر زنده نیز باشند. در نهایت ناقل های مذکور را می توان برای انتقال ژن به گیاهان مختلف با روش اگروباکتریوم و تفنگ ژنی مورد استفاده قرار داد. در نهایت یکی از ناقل های مربوط به تراریخت گیاهان تک لپه به گیاه گوجه فرنگی انتقال یافت و پس از آنالیزهای مربوط به حضور ژن، حضور سه ژن کیتیناز، گلوکاناز و prp-1 در گیاه مذکور تأیید شد.

تولید واریته های مقاوم با استفاده از تکنیک های مهندسی ژنتیک می تواند با عث افزایش عملکرد در گیاهان شود. از ژن های منتقل شده به گیاه پنبه (gosssypium hirsutum) ژن های chi و glu است که باعث ایجاد مقاومت به بیماری پژمردگی ورتیسیلیوزی می شود. در زمان تولید گیاهان تراریخته، اولین مرحله در تعیین خصوصیات آنها، تخمین این است که چه تعداد نسخه از ژن انتقالی به ژنوم گیاه وارد شده، زیرا این امر میزان بیان و میزان پایداری بیان ژن انتقالی را شدیداً تحت تأثیر قرار می دهد. این کار معمولاً توسط آنالیز سادرن بلات انجام می شود، که به مقدار مواد گیاهی نسبتاً زیادی نیاز داشته و پرهزینه و پرزحمت است. به علاوه، برآوردها غالباً به طور صحیح منعکس کننده حضور نسخه های باز آرایی شده ژن انتقالی نیستند. رویکردهای جدید به این مسئله می تواند کمک بزرگی برای بیوتکنولوژیست های گیاهی باشد. از real-time pcr می توان به منظور تعیین تعداد نسخه ژن انتقالی در گیاهان تراریخته استفاده کرد. تعداد نسخه ژن های chi و glu در نسل های t0 و t2 پنبه تراریخته با مقایسه نتایج real-time pcr کمی مربوط به این ژن ها با ژن کنترل داخلی مربوطه (ترهالوز 6-فسفات سنتاز) محاسبه گردید. با بهینه سازی شرایط pcr، برآورد بسیار دقیقی با تعداد 2 نسخه در نسل t0 و 4،3 و 6 نسخه در نسل t2 گیاهان تراریخته کسب شد. به علاوه، با استفاده از تخمین تعداد نسخه ژن هدف و ژن کنترل داخلی، مشاهده شد که بازآرایی ژن های انتقالی احتمالاً بیش از چیزی که شناخته شده اتفاق می افتد. پس به منظور تعیین تعداد نسخه کامل ژن در طی ترانسفورماسیون ژنتیکی از یک روش سریع و قابل اعتماد استفاده شد. انعطاف پذیری این روش مناسب شرایطی است که در آن بهینه سازی دقیق تمام اجزای واکنش غیر ممکن و نشدنی است. در نهایت، کیفیت اطلاعات بدست آمده بالاتر از چیزی است که توسط آنالیز سادرن بلات می تواند حاصل شود.

چکیده ارزیابی ایمنی محصولات تراریخته قبل از اینکه وارد زنجیره غذایی انسان شود، لازم است. fao/who راهکارهایی تحت قوانین و مقررات مختلف برای ارزیابی پتانسیل ایجاد بیماری های آلرژی توسط پروتئین های القاء شده به داخل محصولات تراریخته که از طریق مهندسی ژنتیکی ایجاد شده اند، ارائه دادند. بر طبق قوانین ارزیابی آلرژی زایی غذاهای مشتق شده از بیوتکنولوژی یک پروتئین زمانی آلرژی زا است که در قطعات 6 الی 8 اسید آمینه یکسان بهم پیوسته مشابه آلرژن ها و در پنجره های 80 اسید آمینه بیش از 35% با آلرژن ها تشابه داشته باشد و روش سوم شباهت همردیفی کامل توالی است. در این مطالعه با استفاده از سه روش ذکر شده بالا و 4 بانک اطلاعاتی allergenonline، allermatch، adfs و sdap برای پروتئین های glucanase، cry3،cry1ab ، cry1ac، chitinaseو pr1 که به طور وسیعی در محصولات تراریخته استفاده شده است، بهره گرفته شد. هضم آنزیمی در شرایط in silico با استفاده از peptidecutter و peptidemass روی پروتئین های که آلرژی زایی را نشان می دادند، انجام گرفت. نتایج داده ها نشان داد که پروتئین های cry3،cry1ab و cry1ac با آلرژن ها شباهت ندارند اما پروتئین های chitinase، glucanase و pr1 در همه بانک ها با آلرژن ها شباهت نشان دادند. بررسی پتانسیل اپی توپی با نرم افزار پیشگویی پتانسیل اپی توپی در مورد پروتئین pr1 و گلوکاناز هیچ نوع پتانسیل اتصال به ige نشان نداد اما در مورد پروتئین کتیناز در ناحیه sqwgwc پتانسیل اتصال به ige را نشان داد. کلمات کلیدی: آلرژن، ایمنی، اپی توپ، بیوانفورماتیک، پایگاه داده

با توجه به میزان خسارت ناشی از بیماری های قارچی، استفاده از تکنیک های بیوتکنولوژی برای تولید گیاهان مقاوم از اهمیت ویژه ای برخوردار است. این تحقیق با هدف کلون سازی ژن ap24 در ناقل pbi121 انجام گردید. در این تحقیق، پس از طراحی آغازگرهای اختصاصی، ابتدا ژن ap24 از ژنوم گیاه توتون توسط pcr جداسازی و در ناقل واسط ptz57r/t کلون گردید. پس از آنالیزهای مربوط به صحت جداسازی ژن، با کمک آنزیم های برشی ژن مجدداً از ناقل خارج و تحت پیشبر 35s و پایان دهنده nos در ناقل pbi121 کلون سازی شد. در نهایت ناقل مذکور را می توان برای انتقال ژن به گیاهان مختلف مورد استفاده قرار داد.

تولید گیاهچه تراریخته گندم triticum aestivum)) با استفاده از روش های انتقال ژن به واسطه اگروباکتریوم و تفنگ ژنی و نیز پلاسمید pbi121 نوترکیب حاوی ژن نشانگر انتخابی نئومایسین فسفوترانسفراز تحت کنترل پیشبر nos و همچنین کیتیناز و گلوکاناز به عنوان ژن های هدف که هر کدام به طور جداگانه تحت کنترل پیشبرcamv35s قرار دارند، بررسی شد. در تراریزش با تفنگ ژنی، ریز نمونه های جنین نارس ارقام ( لاین a، مغان، آرتا، سایسون و گاسکوژن ) پس از جداسازی، بر روی محیط کالوس دهی تولید کالوس جنین زا نمودند. سپس کالوس های جنین زا، با ذرات طلای اندود شده با پلاسمید نوترکیب بمباران شده و به محیط کالوس دهی انتخابی حاوی 50 میلی گرم بر لیترکانامایسین منتقل شدند. پس از آن جهت تولید شاخه و ریشه به محیط باززایی انتخابی حاوی ?? میلی گرم بر لیترکانامایسین منتقل شدند. بیشترین درصد تراریزش با تفنگ ژنی 8/4 درصد مربوط به رقم لاین a و بعد از آن 3/0 درصد مربوط به رقم مغان بود. در سایر ارقام هیچ گیاه تراریخته ای حاصل نشد و درصد تراریزش آن ها صفر درصد بود. تراریزش به واسطه اگروباکتریوم با استفاده از سویه های, lba4404, c58 eha101, agl1 حاوی پلاسمید pbi121 نوترکیب فوق بررسی شد. ریز نمونه های جنین نارس پس از جداسازی، با سوسپانسیون باکتری دارای پلاسمید نوترکیب هم کشت شده، سپس در محیط کالوس دهی انتخابی حاوی ?? میلی گرم بر لیتر کانامایسین قرار گرفتند. پس از آن کالوس های جنین زا انتخاب و به محیط باززایی حاوی ?? میلی گرم بر لیتر کانامایسین جهت تولید شاخه و ریشه منتقل شدند. بیشترین درصد تراریزش با اگروباکتریوم 31/0 درصد مربوط به رقم آرتا تلقیح شده با سویه c58 و پس از آن رقم آرتا تلقیح شده با سویه lba4404 با درصد تراریزش 14/0 درصد بود. در سایر ارقام و سویه ها هیچ گیاه تراریخته ای حاصل نشد و درصد تراریزش آن ها صفر درصد بود. در این تحقیق 18 گیاه تراریخته شامل 3 گیاه حاصل از روش اگروباکتریوم و 15 گیاه حاصل از روش تفنگ ژنی بدست آمد. واکنش زنجیره ای پلیمراز و آنالیز لکه گذاری dna نشان دادند که گیاهان فرضی تراریخته در مقایسه با شاهد حداقل یک نسخه از ژن های کیتیناز و گلوکاناز و نیز نئومایسین فسفوترانسفراز را در ژنوم خود دارا هستند.

تولید پروتئینهای نوترکیب در بذر گیاهان به دلایل متعددی از جمله هزینه پائین تولید، پایداری بیشتر پروتئین، تخلیص راحت تر، ایمنی بیشتر به عنوان یک جایگزین مناسب مورد توجه قرار گرفته است. یکی از مهمترین فاکتورها جهت مقرون به صرفه شدن این تکنولوژی، بالا بردن بیان پروتئین نوترکیب است. ازراهکارهای افزایش تظاهر و تجمع پروتئین نوترکیب ، طراحی و تهیه سازه مناسب است به نحوی که همزمان با بیان پروتئین در بافت مناسب گیاه با استفاده از توالی های تعبیه شده در سازه افزایش بیان را نیز به همراه داشته باشد. در این تحقیق جهت تهیه سازه اختصاصی بذر از وکتور بیانی pbi121 که در آن پروموتر اختصاصی بذر napin جایگزین پروموتر عمومی camv35s شده بود، استفاده گردید. توالی های signal sequence (ss) و kdel جهت هدایت و نگهداری پروتئین به شبکه آندوپلاسمی، توالی mar به عنوان توالی که از خاموشی ژن منتقل شده ممانعت می کند،در سازه فوق تعبیه شد. برای این منظور ابتدا با طراحی آغازگرهای اختصاصی و واکنش pcr توالی ss در بالادست ژن gus و توالیهای mar و kdel در پائین دست آن قرار گرفتند. قطعه حاصله در وکتور کلونینگ ta همسانه سازی و سپس با روش pcr colony، هضم آنزیمی و توالی یابی تائید شد. در مرحله بعد با ساب کلونینگ این قطعه در وکتور گیاهی pbi121 سازه نهایی تهیه شد.

از مهمترین فاکتورهای محدود کننده تولید پروتئنیهای نوترکیب در گیاهان، پائین بودن سطح بیان ژنهای وارد شده است. انتخاب بافت مناسب گیاه جهت بیان و نیز بهبود تظاهر قطعه ژنی از جمله راههای افزایش بیان ژن منتقل شده به گیاه می باشد. در این پژوهش با طراحی و تهیه سازه اختصاصی بذر به همراه قطعات افزاینده بیان ژن (omeg و sar) سعی شده است تا ضمن بیان اختصاصی ژن مدنظر در بذر گیاه، افزایش بیان قطعه ژنی را نیز شاهد باشیم. توالی omega مورد استفاده به عنوان یک تنظیم کننده ترجمه عمل می کند و کارایی ترجمه را بالا می برد و توالی sar با مکانیزم های مختلف می تواند از خاموشی ژن منتقل شده ممانعت بعمل آورد. در این تحقیق از قطعه ای به نام ps206-1 به عنوان sar استفاده گردید. در ابتدا با طراحی آغازگرهای اختصاصی وانجام واکنش pcr قطعه omega به ابتدای ژن gus متصل شد. قطعه ی sar (ps206-1) نیز از ژنوم گیاه توتون جداسازی گردید. سپس دو قطعه با استفاده از روش soeing pcr به هم متصل شدند به نحوی که توالی omega در بالادست ژن gus و توالی sar در پائین دست آن قرار گرفت. قطعه ی ترکیبی حاصله با سایز مورد انتظار، در ناقل ta همسانه سازی شد و صحت انجام کار با استفاده از روش های کلنی pcr، هضم آنزیمی و توالی یابی مورد تایید قرار گرفت. در مرحله بعد ساب کلونینگ در وکتور گیاهی pbi121 که در آن پیشبر camv35s با پیشبر اختصاصی بذر جایگزین شده بود، انجام شد.

یکی از جنبه های ارزیابی ایمنی زیستی گیاهان تراریخته، بررسی متابولیکی است. در پژوهش حاضر ضمن ارزیابی مولکولی پنبه های تراریخته حاوی ژن های cry1ab و کیتیناز و اطمینان از انتقال ژن در گیاهان مورد بررسی و بیان تراژن، تجزیه های متابولیکی نیز انجام گرفت. در ارزیابی اسیدهای چرب پنبه های bt فقط در یک لاین نسبت به شاهد اختلاف در میزان استئاریک اسید مشاهده شد؛ درحالیکه در پنبه های حاوی ژن کیتیناز مریستیک اسید، لینولئیک اسید، اولئیک اسید و استئاریک اسید در تمام لاین ها با شاهد اختلاف معنی دار نشان دادند. در میان آنیون های اندازه گیری شده نیترات در لاین bt 53/61 و فسفات، سولفات و استات در برخی لاین های کیتیناز نسبت به شاهد اختلاف داشتند. در میزان کاتیون های سدیم و آمونیوم در برخی لاین های bt و کاتیون های سدیم، پتاسیم و منیزیم در برخی لاینهای کیتیناز نسبت به شاهد اختلاف معنی دار مشاهده شد. آنالیز آمینواسیدها حاکی از اختلاف در مقادیر آسپاراژین، آسپاراتیک اسید، گلوتامین، آلفاآمینوبوتیریک اسید، گلایسین، گلوتامیک اسید، سیترولین، تائورین، آلانین و تیروزین در برخی لاین های حاوی ژن cry1ab نسبت به شاهد بود. در گیاهان حاوی ژن کیتیناز فقط لاین 10/11/1 در میزان آمینواسیدهای آسپاراژین، گلوتامین، آرژنین و آلفاآمینوبوتیریک اسید با شاهد اختلاف نشان داد. در مورد قندهای اندازه گیری شده نیز در میزان فروکتوز و گلوکز در برخی لاین های bt و برخی لاین های کیتیناز با شاهد اختلاف مشاهده شد. لاین bt11/29/61 در هیچ کدام از موارد اندازه گیری شده با شاهد اختلاف معنی دار نداشت. در نتیجه این لاین، می تواند به عنوان یک لاین امیدبخش جهت انجام سایر آزمون های ایمنی زیستی مورد استفاده قرار گیرد.

مهندسی ژنتیک کلروپلاست چندین مزیت منحصر به فرد نسبت به انتقال ژن به هسته ارائه می دهد. بیان بسیار بالای پروتئین های نوترکیب، درون سیستم های مهندسی شده پلاستیدی، روشی موثر و ارزشمند را برای استفاده از گیاه به عنوان بیورآکتور مطرح می کند. در این تحقیق با طراحی و ساخت ناقل های مناسب عمومی و اختصاصی برای انتقال ژن به کلروپلاست گیاهان، تلاش شد تا گام موثری به عنوان گزینه ای جایگزین برای تراریزش هسته ای برداشته شود. لذا با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی ژنوم های پلاستیدی موجود در بانک های اطلاعاتی، قسمتی از توالی پلاستوم به عنوان توالی هدف گیری کننده ژن خارجی به ژنوم کلروپلاستی انتخاب گردید که دارای طول مناسب برای ایجاد نوترکیبی همولوگ و الحاق در پلاستوم، ناحیه آغاز همانندسازی اختصاصی پلاستوم، هدف گیری ژن در ناحیه تکرار معکوس پلاستیدی و جایگاه های آنزیمی منحصر به فرد در مرکز توالی برای الحاق ژن خارجی باشد. توالی های مجاور یا هدف گیری کننده با طراحی یک جفت پرایمر از نواحی حفاظت شده مورد نظر از پلاستوم های توتون و 7 گیاه دیگر، جداسازی و کلون سازی شد. سپس با افزودن نواحی تنظیمی مختلف شامل پیشبرها و پایانبرهای دائمی کلروپلاستی و القایی، نواحی بدون ترجمه یا utrهای مناسب، نواحی اتصال ریبوزوم پلاستیدی، جایگاه های آنزیمی مناسب ورود ژن برای بیان انفرادی و یا پلی سیسترونی، ژن گزارش گر، ژن های نشانگر انتخابی آنتی بیوتیکی و غیرآنتی بیوتیکی و توالی هایی برای حذف ژن نشانگر پس از انتقال ژن، تلاش شد تا انواع مختلفی از حامل های کلروپلاستی ساخته شوند تا بتوان بیان هر ژن خارجی را به طور دلخواه در ژنوم های پلاستیدی گیاهان مختلف به صورت کارا امکان پذیر نمود. صحت ساخت ناقل های کلروپلاستی توسط آنالیزهای ملکولی مختلف تایید گردید. از سویی دیگر جداسازی و ساخت کاست بیانی برای گروه ژنی (اُپران) پلی هیدروکسی بوتیرات (phb) و کلون سازی آن در ناقل بیانی و ناقل های کلروپلاستی به منظور انتقال آن به ژنوم پلاستیدی برای دستیابی به تولید ارزان پلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات به عنوان پلاستیک زیست تخریب پذیر که دارای بسیاری از ویژگی های پلاستیک های نفتی بوده و دارای کاربردهای صنعتی مهمی نیز نظیر ساخت کپسول های قابل تجزیه زیستی برای رهاسازی دارو در دراز مدت، نخ بخیه، بیوپلیمر جایگزین استخوان و غیره، می باشد، انجام گرفت. صحت جداسازی و کلون سازی و بیان هر سه ژن اُپران phb توسط آنالیزهای مختلف pcr، هضم آنزیمی و کروماتوگرافی گازی تایید گردید و در نهایت پلیمر مذکور توسط باکتری های نوترکیب ساخته شده در این تحقیق تولید و استخراج گردید. از سویی دیگر سیستمی با قرار دادن پیشبر شوک حرارتی e. coli (groe) در ناقل پلاستیدی و ساخت سیگما فاکتور هیبرید گیاه- باکتری تحت یک پیشبر مختص بافت طراحی گردید تا بتوان بر مشکل کاهش رشد و یا باروری گیاه در انتقال ژن به پلاستید که اغلب به دلیل اثرات تولید دائمی محصول تراژن ایجاد می گردد نیز غلبه نمود. به طوری که با ترکیب موتیف های قسمت n-ترمینال شبه سیگما فاکتور توتون که علاوه بر توالی نشانه برای ورود به کلروپلاست دارای موتیف برهمکنش با پلیمراز کلروپلاستی می باشد با موتیف های قسمت c-ترمینال فاکتور سیگما 32ی e. coli که قدرت تشخیص و اتصال به پروموتر groe را دارد، یک فاکتور سیگمای هیبرید گیاه e. coli طراحی گردید. این موتیف ها با طراحی پرایمر از توالی نوکلئوتیدی فاکتور سیگمای باکتری و گیاه تکثیر شد و اتصال آنها به هم با استفاده از soeing pcr طوری انجام گرفت که چهارچوب باز خواندنی (orf) اصلی در فاکتور سیگمای هیبرید حاصل حفظ گردد. سپس این ژن هیبرید موسوم به hsig طی مراحلی به منظور اختصاصی کردن بیان ژن در پلاستیدهای گیاهی با افزودن نواحی تنظیمی در وکتور اگروباکتریومی پس از حذف ژن نشانگر انتخابی کلون سازی شد. از وکتور نوترکیب حاصل برای انتقال ژن به رقم ایرانی توتون استفاده گردید و ردیابی گیاهان تراریخته باززاشده روی محیط غیرانتخابی توسط آنالیز pcr انجام شد. الحاق ژن hsig و کپی شمار آن در ژنوم گیاه تراریخته به ترتیب توسط آنالیزهای سادرن بلات و real time pcr تعیین شد. بیان ژن hsig و هدف گیری آن به پلاستید توسط بیان ومشاهده پروتئین فلورسنت سبز (gfp) پس از انتقال کاست بیانی طراحی شده برای gfp تحت پیشبر groe در ناقل pfngi به کلروپلاست توتون توسط تفنگ ژنی اثبات شد. سپس سه ژن اُپران phb جایگزین gfp در ناقل کلروپلاستی گردید و توسط دو ناقل pfnpi و pfnp به پلاستید توتون منتقل شد. آنالیز pcr حضور اُپران را در گیاهان ترانسپلاستومی حاصل تایید نمود. سیستمی که برای بیان phb در ژنوم کلروپلاستی طراحی و ساخته شد این قابلیت را خواهد داشت که با جایگزینی هر ژن دلخواه دیگری به جای phb استفاده و به عنوان زمینهای کارا و سازگار با مسائل زیست محیطی و برای ایجاد صفات مطلوب زراعی و نیز تولید پروتئینهای درمانی، واکسنها و مواد زیستی، به کار رود.

گوجه‏فرنگی یک محصول تجاری مهم در سراسر دنیاست. یکی از محدودیت‏های اصلی در کاشت گوجه‏فرنگی بیماری پژمردگی فوزاریومی است که باعث از دست رفتن تولیدات گوجه فرنگی در سراسر جهان می‎شود. به منظور افزایش مقاومت در گوجه‏فرنگی سازه سه گانه حاوی ژن‏های 1pr، کیتیناز و گلوکاناز تحت پیشبرهای مستقل camv35s به گوجه‏فرنگی منتقل گردید. در این پژوهش از 4 ژنوتیپ یواس‏اگری‏سید، شف فلات، ارلی اوربانا 111 و سی‏اچ فلات با دو ریز نمونه برگ لپه‏ای و محور زیر لپه استفاده گردید. ابتدا ترکیب هورمونی مناسب حاوی زئاتین mg l?1 5/0و ایندول استیک اسید mg l?15/0جهت ساقه‏زایی مشخص شد. سپس ریزنمونه‏های برگ‏لپه‏ای و محور زیر لپه، پس از قرارگیری بر روی محیط پیش کشت، به وسیله اگروباکتریوم سویه lba4404 حاوی ناقل مورد نظر تلقیح شد. ریزنمونه‏های حاصل به محیط هم‏کشتی و پس از آن به محیط ساقه‏زایی منتقل شدند. گیاهچه‏های باززا شده پس از این‏که طول آن‏ها به 2 تا 3 سانتیمتر رسید به محیط کشت ریشه‏زایی برده شدند . پس از ریشه‏زایی، گیاهچه‏های حاصل به گلدان‏هایی با ترکیب خاکی مناسب انتقال یافتند. صحت انتقال و ادغام ژن‏ها توسط آزمون pcr تأیید و نسخه برداری از ژن‏های انتقالی نیز با روش rt-pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن‏های مذکور اثبات شد. عصاره پروتئینی گیاهان دارای ژن‏های کیتیناز، گلوکاناز وpr1 توانست رشد قارچ بیماری‏زای گیاهی fusarium oxysporum را کنترل کند.

آفت سرخرطومی برگ یونجه از آفات مهم یونجه در کشور است. فعالیت این آفت در اکثر موارد با انهدام علوفه چین اول همراه است و حدود 1200000 تن علوفه خشک چین اول یونجه در ایران تنها توسط این آفت از بین می رود که از لحاظ اقتصادی 33% محصول یونجه را شامل می شود. به منظور کاهش خسارت و مصرف سموم شیمیایی رقم قره یونجه-مراغه-27 با استفاده از سویه های غیربیماری زا آگروباکتریوم lba4404 و agl01 حاوی پلاسمید pbi121-cry3a مورد تراریزش قرار گرفت و ژن سنتتیک cry3a به گیاه یونجه منتقل شد. تحقیق حاضر به منظور بررسی گیاهان یونجه تراریخته حاوی ژن سنتتیک cry3a باکتری bacillus.turengensis.var.tenebrionis انجام شد. در مرحله اول گیاهان تراریخته ای که در محیط باززایی ms بدون هورمون، رشد کرده و ریشه دادند به گلدان منتقل شدند و آنالیزهای مولکولی، حضور و بیان ژن cry3a را به ترتیب از طریق آزمایشات pcr و لکه گذاری سادرن تایید کرد. همچنین تجزیه گیاهان تراریخته با استفاده از تکنیک الیزا نشان داد که انتقال ژن موفقیت آمیز بوده و ژن در جای مناسبی از ژنوم قرارگرفته و پدیده خاموشی برای ژن رخ نداده است و پروتئین cry3a به میزان بالایی تولید می شود. آزمایشات زیست سنجی با استفاده از لاروهای سرخرطومی بر روی گیاهان تراریخته یونجه انجام شد و درصد مرگ و میر لاروهای سرخرطومی در گیاهان تراریخته تا 90 درصد مشاهده شد. میانگین میزان خسارت وارده به برگ گیاه تراریخته 60 درصد کمتر از خسارت در گیاهان شاهد بود. میانگین وزن لاروهای زنده در گیاهان شاهد 2/20 میلی گرم بوده که این میزان در گیاه تراریخته به 23/1 میلی گرم کاهش یافته است. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که گیاهان تراریخته حاوی ژن cry3a به طور معنی داری نسبت به لارو های سرخرطومی مقاومت داشتند.

استفاده از گیاهان تراریخته در سال های اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است. ا جمله این گیاهان می توان به پنته-های تراریخته مقاوم به کرم قوزه پنبه و قارچ ورتیسلیوم اشاره کرد. طبق قانون ایمنی زیستی، صدور مجوز به منظور رهاسازی گیاهان تراریخته و استفاده از آن ها به عنوان غذا در قبال ارزیابی مخاطرات احتمالی از جمله این همانی، امکان-پذیر می باشد. استفاده از پروتئومیکس، راهی برای نشان دادن اثرات نا خواسته از الحاق تصادفی t-dna در گیاهان تراریخته می شود. بدین منظور، پنبه های تراریخته حاوی ژن های bt و کیتیناز و هم چنین پنبه شاهد با نام رقم کوکر و رقمی که بیشتر در منطقه کشت می شود با نام ساحل را برای آنالیز انتخاب کردیم. 3 تکرار از هر کدام از ارقام انتخاب شدند و کل پروتئین از برگ استخراج شده و روی ژل اکریلامید آنالیز شد. پس از اتمام مراحل رنگ آمیزی و سپس آنالیز لکه ها با نرم افزار melanie 6 ، 812 لکه پروتئینی تکرار پذیر روی ژل ها علامت گذاری شد. 51 لکه بین bt و کوکر و 35 لکه بین ساحل و کوکر و 42 لکه بین کیتیناز و کوکر متفاوت بود،6 لکه هم بین هر سه رقم دارای تفاوت معنی دار بودند. از این بین، تعدادی لکه را به عنوان کاندید برای انجام طیف سنجی جرمی انتخاب کردیم.

در آزمایش اول، یک روش کارآمد برای تکثیر درون شیشه ای ارقام انار ملس ساوه و یوسف خانی با استفاده از قطعات گره ای و نوک شاخساره توسعه داده شد. محیط wpm در مقایسه با ms کارآمدتر تشخیص داده شد. بهترین غلظت کینتین برای رقم ملس ساوه 7/4 و برای یوسف خانی 2/9 میکرومولار بود که منجر به بیشترین تعداد شاخساره در ریزنمونه، طول شاخساره و تعداد برگ شد. برای هر دو رقم، محیط نصف غلظت wpm حاوی 4/5 میکرومولار نفتالن استیک اسید موثرترین محیط برای ریشه زایی بود. گیاهچه های ریشه دار شده به طور موفقیت آمیزی سازگار شده و به خاک منتقل گردیدند. در آزمایش دوم، یک روش کارآمد تراریختگی با واسطه آگروباکتریوم برای ارقام انار ملس ساوه و یوسف خانی توسعه پیدا کرد. قطعات شاخساره درون شیشه ای با آگروباکتریوم تومفاسیئنس سویه lba4404 حاوی ناقل دوگانه pbi121 حامل ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (nptii) به عنوان نشانگر گزینشی و ژن بتاگلوکورونیداز (‏gus) به عنوان ژن گزارشگر آغشته و تلقیح شدند. بعد از 3 ماه از دوره گزینش روی محیط حاوی 50 میلی گرم در لیتر کانامایسین، 7 شاخساره تراریخته فرضی به دست آمد. وجود ژن های ‏ gusو nptii به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز و آنالیز سادرن بلات تأیید شد. علاوه بر این، آزمون هیستوشیمیایی gus بیان ژن gus را در برگ های گیاهان تراریخته مقاوم به کانامایسین نشان داد. در آزمایش سوم، قطعات شاخساره درون شیشه ای با آگروباکتریوم تومفاسیئنس سویه lba4404 حاوی ناقل دوگانه pbin19 حامل ژن ‏cry1ac و ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (nptii) به عنوان نشانگر گزینشی آغشته و تلقیح شدند. بعد از 6 ماه از دوره گزینش، 10 گیاه تراریخته به دست آمد. حضور ترانسژن در گیاهان تراریخته به وسیله آنالیز پی سی آر و سادرن بلات اثبات گردید. به علاوه بیان ترانسژن و تولید پروتئین توسط آنالیز وسترن بلات مشخص شد. این اولین بار است که تراریختگی انار با یک ژن غیرگزارشگر گزارش می شود.

جلبک به عنوان نسل سوم تولید کننده سوخت های زیستی علی الخصوص بیودیزل تمام پیش شرط های لازم به منظور تبدیل شدن به منبع پایدار تولید سوخت زیستی، از جمله توانایی رقابت با سوخت های فسیلی در زمینه هزینه تولید ، عدم نیاز به زمین کشاورزی مستعد، مصرف آب محدود و توانایی بالای ترسیب co2 اتمسفر را دارا است. در این تحقیق نخست از بین 11 گونه مختلف ریزجلبک انواع پربازده شناسایی شدند و معین شد که عملکرد تولید روغن، که خود مستقیماً از عملکرد تولید زیست توده تأثیر می پذیرد، خصوصیت مناسبی برای انتخاب و شناسایی گونه های پربازده می باشد. همچنین انواع تیمارهای بیوشیمیایی به منظور افزایش عملکرد تولید چربی بر روی گونه های موردنظر مطالعه شد. اعمال 200 میلی گرم در لیتر میواینوزیتول 50 درصد محتوی روغن سلولی را در گونه dunaliella salina افزایش داد اما از آنجائی که روش های معمول مثل کنترل شرایط رشد (دما، ph و شوری) و تأمین مواد غذایی در محیط رشد جلبک کارایی لازم برای افزایش تولید چربی در بیومس را ندارند، دستکاری¬ ژنتیکی آنزیم¬های کلیدی در سنتز اسیدهای چرب و افزایش بیان آن ها از طریق مهندسی کلروپلاست و هسته در دستور کار قرار گرفت. از جمله این ژن ها می توان me و accd را نام برد که در تحقیق حاضر بر روی سازه های ژنومی و کلروپلاستی ریزجلبک از جمله گونه d. salina، همسانه سازی شدند و نهایتاً ژن accd در ژنوم کلروپلاست این گونه با موفقیت الحاق شد. بیان موفق این ژن از راه اندازهای دائمی s16 اثرات محدودی بر روی میزان ونحوه تجمع چربی های سلولی در لاین های تراریخته را باعث شد اما بیان این تراژن خصوصیات کیفی بیودیزل تولیدی را بخوبی ارتقا داد. این نتیجه کارایی کاربرد رویکردهای ژنتیکی را در بهبود خصوصیات تولیدی روغن از منبع جلبک به تأیید رساند.

آنزیم ال-آسپاراژیناز به شکل موثری در درمان بیماری لوسمی لنفوبلاستیک حاد و سلول های توموری و همچنین در صنایع غذایی برای کاهش سطح اکریل آمید به کار می رود. بیماری لوسمی لنفوبلاستیک حاد یکی از بدخیمی های بسیار شایع در جهان و ایران به ویژه در کودکان است و در طول سی سال گذشته با استفاده از آنزیم های ال- آسپاراژیناز که به صورت تجاری ازe.coli و erwinia cherysanthemi تهیه می شود، قابل درمان است. آنزیم ال- آسپاراژیناز واکنش تبدیل ال- آسپاراژین که یک اسید آمینه غیر ضروری است را به ال- آسپارتیک اسید و آمونیاک کاتالیز می کند و بدین ترتیب این اسید آمینه، که برای رشد بی رویه سلول های سرطانی ضروری است را از دسترس آن ها خارج می کند

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.