مقدمه: استیل کولین استراز یکی از مهمترین آنزیم های سیستم عصبی مرکزی است که در فضای سیناپسی استیل کولین را هیدرولیز کرده باعث خاتمه پیام عصبی می شود. این آنزیم هدف برخی از قدرتمندترین سم ها قرار می گیرد و غیر فعال شدن آن می تواند برای سلامتی انسان خطر آفرین باشد. برای تشخیص این گونه سموم در محیط یا مواد غذایی، استیل کولین استراز می تواند در ساخت زیست گرها مورد استفاده قرار گیرد. برای این منظور، استیل کولین استرازهایی با پایداری بالا مورد نیاز است. روش تحقیق: به منظور افزایش پایداری ایجاد یک پیوند دی سولفید جدید در ساختار استیل کولین استراز دروزوفیلا ملانوگاستر، در توالی این آنزیم اسید آمینه های ایزولوسین 298 و آسپارتیک اسید 346، با اسید آمینه سیستئین جایگزین گردیدند. هر دو توالی طبیعی و جهش یافته بر اساس ترجیح کدونی این مخمر پیکیا پاستوریس طراحی و سنتز شدند. ژن های سنتز شده در مخمر پیکیا پاستوریس کلون و بیان شدند و پس از تخلیص با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی، پارامترهای سینتیکی و پایداری این دو آنزیم در دماهای مختلف و در برابر عوامل دناتوره کننده سنجیده شد. یافته ها: نیمه عمر آنزیم طبیعی بیان شده در مخمر در دمای 50 درجه سانتی گراد و در برابر اوره 4 مولار به ترتیب 11/9 و 5 برابر آنزیم طبیعی بیان شده در سلولهای sf9 است. نیمه عمر آنزیم جهش یافته بیان شده در مخمر در دمای 50 درجه سانتی گراد و در برابر استونیتریل % 20 و اوره 4 مولار به ترتیب 51/5 ، 76/2 و 4/1 برابر بیشتر از آنزیم جهش یافته بیان شده در سلول های sf9 می باشد نیمه عمر آنزیم جهش یافته بیان شده در مخمر نسبت به آنزیم طبیعی بیان شده در مخمر دمای60، 55،50 و 45 درجه سانتی گراد و در برابر استونیتریل % 20 و اوره 4 مولار به ترتیب 8/2، 93/1078،70/85، 75/1، 27/6 و 66/2 برابر بیشتر می باشد. نتیجه گیری: بیان آنزیم استیل کولین استراز دروزوفیلاملانوگاستر در مخمر پیکیا پاستوریس باعث افزایش پایداری این آنزیم می شود. به علاوه ایجاد جهش برای تشکیل باند دی سولفیدی c298-c346 نیز پایداری آنزیم را افزایش می دهد.

عنوان: طراحی وساخت وکتور بیانی جدید در مخمر pichia pastoris دارای پروموتر fmd سلول های مخمری با توجه به میزان بیان بالا و سرعت رشد مناسب، میزبان های ایده آلی برای تولید پروتئین های نوترکیب در صنعت محسوب می شوند. از مخمرهای صنعتی می توان به مخمر متیلوتروف pichia pastoris اشاره کرد. اغلب برای بیان پروتئین نوترکیب در مخمر p. pastoris از پروموتر قوی و القایی aox1 استفاده می شود. یکی از مشکلات استفاده از این پروموتر، اضافه کردن دائمی متانول به عنوان القاکننده در محیط کشت بیانی و افزایش خطر اشتعال و همچنین هزینه های تولید می باشد. در اینجا از پروموتر قوی و القایی fmd در ساختار وکتور بیانی مخمر استفاده شد؛ که این پروموتر در غلظت های پائین گلوکز القا شده و بیان ژن تحت کنترل خود را انجام خواهد داد. از وکتور بیانی ppink?-hc به عنوان وکتور پایه استفاده شد که دارای پروموتر aox1 و سیگنال پپتید ترشحی mf? در بالادست جایگاه کلونینگ و ترمیناتور cyc1 در پائین دست آن می باشد. پس از تعیین نمودن توالی پروموتری fmd و سیگنال پپتید ترشحی mf? و همچنین طراحی سایت های برشی، توالی نهایی در وکتور puc57 سنتز شد. هضم آنزیمی بر روی پلاسمید puc57-fmd-mf? با آنزیم های محدود کننده bamhi و kpni انجام شد و قطعه ژنی fmd-mf? با اندازه 1380 جفت باز از روی ژل آگاروز جدا گردید. در ادامه هضم آنزیمی وکتور بیانی مخمری ppink?-hc جهت حذف پروموتر aox1 با آنزیم های محدود کننده bglii و kpni انجام شد و کلونینگ قطعه fmd-mf? در وکتور ppink-aox1- انجام گردید. صحت ساختار وکتور جدید با تعیین توالی تایید شد.