نام پژوهشگر: حسین صفرپور

تهیه آنتی بادی های نوترکیب منوکلونال علیه شبه قارچ polymyxa betae
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه شاهد 1390
  حسین صفرپور   محمدرضا صفرنژاد

بیماری رایزومانیا یکی از مخربترین بیماری های ویروسی چغندر قند است. در این بیماری عملکرد کمی و کیفی چغندرقند تحت تاثیر قرار می گیرد. انتقال طبیعی عامل این بیماری توسط شبه قارچ polymyxa betaeصورت می پذیرد. اسپورهای استراحتی این شبه قارچ سال های زیادی می توانند در مزرعه آلوده زنده بمانند. به منظور ارزیابی کمی شبه قارچ p.betae در خاک و بافت آلوده، تهیه آنتی بادی های اختصاصی ضروری می باشد. پروتئین گلوتاتیون- اِس- ترانسفراز که در تمامی حالت های مورفولوژیکی p. betae وجود دارد می تواند به عنوان یک گزینه مناسب برای شناسایی این شبه قارچ در روش سرولوژیکی باشد.به این منظور ابتدا باکتری اشریشیاکلی توسط ناقل بیانی حاوی ژن gst تراریخته و بیان پروتئین به صورت انبوه انجام شد. خالص سازی پروتئین نوترکیب gst با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. پروتئین خالص gst در ایمونوتیوب ثابت گردید و پس از بلوکه شدن فضاهای خالی توسط شیر بدون چربی2% ، ذرات فاژ به لوله افزوده و فاژهای غیر اختصاصی آنها حذف شدند. فاژهای اختصاصی متصل به تیوب، جداسازی شده و برای تکثیر وارد سلول های در حال رشد باکتری اشریشیاکلی سویه tg1 شدند. فاژهای تکثیر یافته دوباره جدا سازی شده و برای افزایش ذرات اختصاصی دارای قابلیت اتصال به پروتئین gst سیکل فوق تکرار می شود. پس از انجام سه دور چرخه فوق، در حدود 100 عدد تک کلونی دارای فاژهای جداسازی شده انتخاب و به صورت جداگانه کشت شده و جهت تولید scfv مربوطه با iptg تحریک شدند. scfv تولید شده در باکتری وارد محیط کشت گردیده و پس از جداسازی با سانتریفیوژ برای تست الیزا و شناسایی کلون های اختصاصی مورد استفاده قرار گرفتند. کلون های مولد scfv اختصاصی جداسازی و برای تعیین تنوع با روش های rflp و تعیین ترادف مورد بررسی قرار گرفتند. آنالیزهای تکمیلی وسترن بلاتینگ و الیزا بر روی scfv های اختصاصی منفرد و با استفاده از عصاره های سالم و آلوده چغندرقند انجام شدند. برای خالص سازی و تولید انبوه آنتی بادی های نوترکیب، سویه باکتریایی hb2151 و یا bl21-de3 با پلاسمیدهای phen حامل ژن های scfv اختصاصی تراریخته شدند. باکتری تراریخته در محیط کشت lb حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین در 37 درجه سانتیگراد رشد یافته و هنگامی که od محیط کشت به عدد یک رسید، iptg استریل به کشت باکتریایی تا غلظت یک میلی مولار افزوده شد و کشت در دمای30 درجه سانتیگراد ادامه یافت. پس از سه ساعت سلول های باکتریایی با سانتریفیوژ جداسازی و scfv تجمع یافته در فضای پیش پلاسمایی با روش شوک اسمزی جدا گردید. در این تحقیق در نهایت آنتی بادی مونوکلونالی تولید شد که بر اساس نتایج آزمون های الیزا، وسترن بلاتینگ و دیبا به خوبی قادر به شناسایی و تفکیک نمونه های سالم و آلوده به شبه قارچ p. betae هستند.