هدف از این مطالعه، داخل کردن کاست بیانی آنتی سنس درون کروموزوم باکتریایی جهت کاهش بیان طولانی مدت ژن هدف، و استفاده از کاست بیانی آنتی سنس (ابزار اصلی ناک داون ژنی) برای انجام حذف ژنی (ناک اوت) در سیستم باکتریایی، بود. لذا این روش برای حذف همزمان ژن کدکننده آنزیم پروزامین سنتتاز (per) و کاهش بیانی ژن virb1 در باکتری بروسلا ملی تنسیس سویه rev1 برای دستیابی به سویه جهش یافته ضعیف شده ای از آن بکار برده شد. در این مطالعه، کاست حذف متشکل از کاست بیانی آنتی سنس virb1 و کاست بیانی ژن مقاومت کانامایسین (kanr)، با انجام نوترکیبی هم ساخت بوسیله وکتور خودکشی جایگزین ژن per شد. حذف ژن per با انجام واکنشهای pcr و تعیین توالی قطعه تکثیر یافته، و حذف عملکرد ژن per با انجام واکنش rt-pcr، مورد تأیید قرار گرفت. عملکرد کاست بیانی آنتی سنس virb1 با انجام واکنش rt-pcr تأیید شد و ارزیابی بیان ژن هدف virb1 نسبت به ژن مرجع groel در سویه والد و جهش یافته بوسیله real-time rt-qpcr با استفاده از پرایمرهای اختصاصی صورت گرفت. میانگین بیان mrna ژن virb1 در سویه جهش یافته نسبت به سویه والد به طور متوسط 10 برابر کمتر بود. در نهایت، میزان ماندگاری سویه جهش یافته با تعیین cfu باکتری در رده سلولی j774 و در مدل موشی balb/c، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل، کاهش معنی داری را در توانایی ورود، تکثیر و ماندگاری سویه جهش یافته در درون سلول های میزبان نشان داد. همچنین مقایسه و مشاهده اختلاف معنی دار در میزان ماندگاری سویه جهش یافته فوق نسبت به سویه جهش یافته کنترل (حذف ژن per تنها با کاست بیانی kanr) در سلول های طحال موشی، بیانگر کاهش عملکرد اپرون virb از طریق اثر مهاری کاست بیانی آنتی سنس virb1، بود. بدین ترتیب نتایج ما نشان داد که سویه حاصل یک سویه جهش یافته دارای نقص در ساختار lps و کاهش در عملکرد سیستم ترشحی خود بوده و در نتیجه علاوه بر کاهش خطا در تمایز ما بین حیوان واکسینه شده و حیوان آلوده در تست های تشخیصی، می تواند با انجام تست های ایمنولوژیکی بعنوان یک سویه کاندید واکسن مورد بررسی قرار بگیرد.

فاکتور محرکه کلنی گرانولوسیت انسانی ‏‎(hg-csf)‎‏ یکی ازفاکتورهای رشد خونساز می باشد که تکثیر و تمایز سلول های پیش ساز گرانولوسیت نوتروفیلی و تشکیل کلنی نوتروفیلی سلولهای مغز استخوان را تحریک می کند. این فاکتور همچنین تمایز نهایی بعضی از سلول های لوسمی میلوئیدی را القا می کند. ‏‎hg-csf‎‏ در منوسیت ها و ماکروفاژهای انسانی در پاسخ به آندوتوکسین باکتریایی، و همچنین در رده های سلولی انسانی نظیر کارسینوهای حفره دهانی ‏‎chu-2‎‏ و کارسینومای مثانه 5637، تولید می شود.هدف از انجام این پژوهش، استخراج ‏‎rna‎‏ کل از سلول های منوسیت انسانی تحریک شده، سنتز ‏‎hg-csf dscdna‎‏ و در نهایت کلون کردن ‏‎cdna‎‏ سنتز شده در یک ناقل کلونینگ مناسب می باشد. در ابتدا، سلول های منوسیت از خون محیطی فرد طبیعی جداسازی شد. این سلول ها کشت داده شده و به طو همزمان به وسیله محرکهای لیپوپلی ساکارید باکتریایی ‏‎(lps)‎‏ و اینترفرون گامای انسانی (لاندا ‏‎hifn-‎‏ )تحریک شد. ‏‎rna‎‏ کل از سلول ها استخراج شد و به دنبال آن ‏‎cdna‎‏ دارای ترادف راهنما (کدکننده پروتئین اولیه) و ‏‎cdna‎‏ فاقد ترادف راهنمایی (کد کننده پروتئین بالغ) ‏‎hg-csf‎‏ با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و بر اساس روش ‏‎rt-pcr‎‏ سنتز شد. همچنین هر دو ‏‎cdna‎‏ مذکور به طور همزمان از ‏‎rna‎‏ کل استخراج شده ازسلول های کارسینو مای مثانه انسانی 5637 سنتز شد. در مرحله بعدی هر دو ‏‎cnda‎‏ منوسیتی فاقد و دارای ترادف راهنما با استفاده از آنزیم محدودگر ‏‎styi‎‏ که بر روی ژل الکتروفورز تشکیل سه قطعه مجزا می دهد، مورد تایید قرار گرفت. سپس ‏‎cdna‎‏ دارای ترادف راهنما درون ناقل کلونینگ ‏‎pbluescriptiisk‎‏ داخل و در باکتری ‏‎e.coli‎‏ (سویه ‏‎(top10f‎‏ کلون شد. به دنبال غربالگری، کلنی های صحیح انتخاب شد و ناقل نوترکیب از باکتری های ترانسفورم شده، استخراج شد و با استفاده از آنزیم های محدودگر ‏‎bamhi, ecori, styi, ncoi‎‏ تایید شد. برای تایید نهایی، ناقل نوترکیب واجد اینسرت صحیح انتخاب و تعیین توالی ‏‎(sequencing)‎‏ شد. بعد از تایید ترادف نوکلئوتیدی ‏‎cdna‎‏ کلون شده، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ناقل نوترکیب به عنوان الگو، و با کمک ‏‎cdna, pcr‎‏ فاقد ترادف راهنما سنتز و در ناقل کلونینگ ‏‎‏‎‏‎pbluescriptiisk‎‏ داخل و در باکتری ‏‎e.coli‎‏ (سویه ‏‎top10f‎‏) کلون شد. به دنبال غربالگری، کلنی های صحیح انتخاب شد و ناقل نوترکیب از باکتری ها ترانسفورم شده، استخراج شد و با استفاده از آنزیم های محدودگر ‏‎bamhi, ecori, styi, ncoi‎‏ تایید شد. تایید نهایی، ناقل نوترکیب واجد اینسرت صحیح انتخاب و تعیین توالی ‏‎(sequencing)‎‏ شد. بعد ازتایید ترادف نوکلئوتیدی ‏‎cdna‎‏ کلون شده، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ناقل نوترکیب به عنوان الگو، و با کمک ‏‎cdna, pcr‎‏ فاقد ترادف راهنما سنتز و در ناقل کلونینگ ‏‎pbluescriptiisk‎‏ داخل و در باکتری ‏‎top10f‎‏ کلون شد. در نهایت کلون صحیح انتخاب و با استفاده از آنزیم محدودگر مورد تایید قرار گرفت.