کشاورزی مولکولی شاخه جدیدی از بیوتکنولوژی گیاهی است که در آن گیاهان برای تولید پروتئین های نوترکیب دارویی و صنعتی در حجم زیاد مهندسی می شوند. یکی از تکنیک های مورد استفاده در کشاورزی مولکولی انتقال ژن به کلروپلاست به جای هسته در گیاهان می باشد که موجب شده است عملکرد و کیفیت پروتئین های تولید شده در گیاهان بهبود یابد و سیستم گیاهی را به یک سیستم تولید کم هزینه و کم خطر تبدیل نماید. استفاده از این تکنیک به دلیل مزایای زیاد احتمالا جوابگوی نیاز روز افزون به پروتئین های دارویی به ویژه در کشور های در حال توسعه خواهد بود. در این تحقیق، هدف امکان سنجی بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در کلروپلاست گیاه توتون بود. اینترفرون گاما یکی از پروتئین های دارویی با ارزش در علم پزشکی است و در درمان سرطان ها و بیماری های عفونی کاربرد دارد. به منظور تولید این پروتئین در کلروپلاست، ژن اینترفرون گاما در ناقل کلروپلاستی pkcz ، بین پیشبرنده prrn و نشانگر گزینشی aada همسانه سازی شد. سپس برگهای توتون در شرایط استریل به وسیله ناقل حاوی اینترفرون گاما متصل به ذرات طلای 0/6 میکرونی با استفاده از سیستم بایولیستیک بمباران شدند. ریز نمونه های بمباران شده به محیط کشت rmop حاوی mg/l500 اسپکتینومایسین منتقل شدند. بعد از گذشت چند هفته گیاهچه های مقاوم به آنتی بیوتیک باززا شدند. این گیاهچه ها بعد از اینکه به حد کافی رشد کردند در محیط کشت ms حاوی اسپکتینومایسین ریشه دار شدند. گیاهان مقاوم در سطح dna، rna و پروتئین آنالیز شدند. نتایج آنالیزها در سطح dna نشان داد که ژن اینترفرون گاما در جایگاه صحیح در ژنوم کلروپلاست درج شده است سپس هموپلاسمی در گیاهان تراریخت کلروپلاستی با آزمون سادرن بلات تایید شد. رونویسی ژن اینترفرون گاما به وسیله تکنیک rt-pcr اثبات شد و بررسی بیان اینترفرون گاما به وسیله sds-page، آزمون دات بلات و وسترن بلات، تولید پروتئین اینترفرون گاما را در کلروپلاست نشان داد. نهایتا اندازه گیری میزان پروتئین اینترفرون گاما در برگ گیاهان تراریخت با آزمون elisa نشان داد که میزان بیان آن تقریبا 0/2% از کل پروتئین محلول در برگ می باشد که در مقایسه با تراریخت های هسته ای بسیار بالاتر می باشد اما به دلیل نیمه عمر پایین و تجزیه آن در کلروپلاست، میزان آن کمتر از تراریخت های کلروپلاستی می باشد.

پلاستیدها اندامکهای گیاهی همراه با kb 120-150 ژنوم و تعداد 1،000-10،000 نسخه در هر سلول می باشند. کلروپلاست اندامک محوری و شناخته شده در سلول های گیاهی و جلبک های یوکاریوتی است و امکان انجام فتوسنتز را ، فراهم می کند که منبع اولیه غذایی در جهان محسوب می شود، انتقال ژن های خارجی به کلروپلاست گیاهان دارای مزایای زیادی است که می توان به بیان بالا و پایدار پروتئین های خارجی و عدم آلودگی زیست محیطی اشاره کرد، همچنین سکوت ژنی در پلاستیدها گزارش نشده است. کلروپلاست گیاهان یک میزبان مناسب برای بیان ژن های خارجی می باشد. با توجه به طراحی نقاط همولوژی در ناقل اختصاصی گیاه مورد نظر جهت نوترکیبی در ژنوم کلروپلاست، ژنهای خارجی را به ژنوم ها منتقل می کنند. برای بیان بیشتر ژن از قطعات اختصاصی تشدید کننده بیان ژن و جهت بالا بردن میزان نوترکیبی از ژن های reca می توان استفاده کرد، که در طراحی و تهیه ناقل، آنها را مد نظر قرار می دهند. در طراحی وکتور پلاستیدی دو جایگاه دارای همولوژی کامل با کلروپلاست لازم و ضروری است که از 14 جایگاه دوتایی استفاده می نمایند. شیگلا دیسانتری به عنوان علت اصلی اپیدمی اسهال، در صد سال اخیر گزارش شده است. شیگلوز یک بیماری عفونی است که توسط شیگلا ایجاد می شود. بیشتر علائم عفونی شیگلوز شامل اسهال، تب، حالت تهوع، استفراغ، درد شکمی، خون و مخاط یا چرک در مدفوع می باشد. محل اصلی هجوم شیگلاها و ضایعات ایجاد شده در انتهای روده کوچک و سرتاسر کولون است. باکتری پس از رشد، توکسینی تولید می کند که به سلول های اپیتلیال روده حمله و سبب اسهال خونی می شود. که عامل آن آنتروتوکسین شیگلا می باشد. انتروتوکسین شیگلا shigella toxin (st) سالیان زیادی است که شیگا توکسین یا stx بعنوان یکی از عوامل ویرولانس شیگلا دیسانتری در ایجاد اسهال خونی ودسانتری مطرح است. شیگا توکسین ها خانواده ای از سموم دو زیر واحدی ab را تشکیل می دهند . توکسین شیگا stx یک پروتئین هگزامر با وزن مولکولی 70.5 kda کیلودالتون بوده که از یک زیرواحد منومریک سمی و آنزیماتیک به نام stxa و از یک زیرواحد متصل شونده به رسپتور هموپنتامریک به نام stxb تشکیل شده است. قسمت غیر سمی stxb برای ورود و عملکرد قسمت سمی یا stxa ضروری می باشد. ناحیه stxa دارای وزن مولکولی در حدود 32 kda کیلو دالتون بوده که خود از دو قطعه که با پیوند کووالانس به هم متصل شده اند: قطعه اول a1 نام دارد که وزن آن در حدود 28 kda بوده و قطعه دوم بنام a2 دارای وزنی در حدود 4 kda می باشد. ناحیه انتهایی c از قطعه a2 ) c ترمینال a2 ( مسئول برهمکنش زیر واحد stxa با قسمت stxb این توکسین می باشد. قسمت a1 از stxa ناحیه سمی و آنزیماتیک محسوب می شود و سبب مهار سنتز پروتین می گردد. stxb ساختار هموپنتامریک ( 5 زیر واحد ) دارد که از 5 utr منومر کاملا یکسان تشکیل شده است. این ناحیه به کمک قسمت c ترمینال a2 به قسمت stxa با پیوند غیرکووالان متصل می گردد، و باعث ورود این ناحیه به درون سلول می شود. stxb به گیرنده سطح سلولی خود به نام gb3 متصل می گردد که روی اکثر سلولهای بدن بیان می شود. ورود شیگا توکسین به درون سلول میزبان از طریق مکانیسمretrograde system صورت می گیرد. ناحیه a1 از قسمت stxa قسمت سمی محسوب می شود.stxa1 باعث دپورینه شدن آدنوزین در 28s rrna در زیر واحد 60s ریبوزوم می گردد. این تغییر در ریبوزوم باعث می شود که trna نتواند به کمپلکس پروتئین سازی متصل شود و در نتیجه پروتئین سازی در سلول هدف مهار می گردد. با عدم اتصال آن به ریبوزوم یک سری از پروتئین کیناز ها مثل (jun-n terminal kinase) jnk و پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن p38 (mapk) فعال می شود که خود منجر به تغییرات در مسیر پیام رسانی در کیناز های تنظیم کننده ای مثل (extracellular signal regulated kinase)erk-1 ,2 می گردد که در نهایت بسته به نوع سلول هدف میتوژن و سایتوکاین های مختلفی تولید می گردد که در فعالیت های مختلفی از سلول تاثیر می گذارد. نکته مهم در فعالیت آنزیماتیک قسمت a1 تجزیه پروتئولیتیکی در باند های دی سولفیدی a1-a2 است که در دستگاه گلژی رخ می دهد. در واقع stxa یک n galactosidase است که با اثر بر 28srrna ریبوزم، سنتز پروتئین را در ریبوزوم مهار می کند. در این مطالعه با بررسی اثرات مهلک سم شیگلا یا شیگا توکسین در ایجاد سندروم اورمیک و اسهال خونی کشنده و شایع بودن آن در اکثر آلودگی ها و با توجه به امکان استفاده از آن در جنگ های بیولوژیک و استفاده های نامتعارف از سوی بشر، طراحی و ساخت وکتور پلاستیدی حاوی ژن stxb همراه با ژن ctbبه منظور تقویت پاسخ ایمنی علیه stxb جهت انتقال به کلروپلاست گیاه کاهو علیه stxb وسم stxa انجام شد.

دیابت بیماری است که در اثر آن بدن نمی تواند انسولین تولید و یا به طور موثر از آن استفاده کند. اگرچه انسولین نوترکیب به¬طور تجاری در باکتری و یا مخمر تولید می شود، ولی نیاز به توسعه سیستم های جایگزین برای تولید انسولین وجود دارد. استفاده از قارچ های خوراکی برای تولید داروهای زیستی، که با پیشرفت های اخیر در زمینه بیولوژی مولکولی امکان پذیر شده است، دارای تمام مزیت های سیستم های مبتنی بر گیاه (نظیر هزینه پائین تولید) به همراه ویژگی های منحصر به فرد قارچ ها می باشد. این ویژگی های منحصر به فرد از بیولوژی قارچ ها و ماهیت سیستم تولید آن ها نشأت می گیرد. برای این منظور ناقل دوتاییpcambctb-ins حاوی زیر واحد b سم وبا که به ژن پروانسولین انسانی الحاق شده بود، تحت کنترل پیشبرنده gpd ساخته شد و با استفاده از روش انتقال ژن مبتنی بر اگروباکتریوم به بافت ژیل قارچ صدفی (pleurotus ostreatus) منتقل گردید. شرایط تراریختی قارچ صدفی جدایه ایرانی (iran1649c) از جنبه های مختلفی نظیر سویه agrobacterium tumefaciens ، غلظت سوسپانسیون باکتری و دمای هم کشتی قارچ و باکتری بهینه سازی شد. پس از هم کشتی قارچ و باکتری، بافت های ژیل در محیط گزینشگر حاوی هیگرومایسین و سفوتاکسیم کشت شدند. اگروباکتریوم سویه gv3101 در غلظت 0/8(od600nm) و دمای °c25 در هم کشتی قارچ و باکتری بیشترین کارایی تراریختی (تقریبا 40%) را نشان داد. پس از تایید قارچ های تراریخت با استفاده از آزمون pcr با آغازگرهای اختصاصی، درج پایدار ژن ترکیبی ctb و پروانسولین در ژنوم قارچ صدفی با آزمون لکه گذاری سادرن تایید شد. بیان این ژن ترکیبی در سطح رونویسی و پروتئین با روش هایی نظیر rt-pcr، elisa و ایمونوبلاتینگ تایید شد و در میسلیوم قارچ های تراریخت میزان پروتئین ترکیبی ctb و پروانسولین انسانی 0/04% پروتئین محلول کل بود. با توجه به نتایج این تحقیق و بیان موفق ژن های خارجی در قارچ تراریخت، می¬توان به توسعه و تولید داروهای زیستی در قارچ های خوراکی امیدوار بود.

چکیده ندارد.