نام پژوهشگر: علی قربانی کهریزسنگی

جداسازی پلاسمید از چند گونه باکتری گیاهی
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه صنعتی اصفهان 1368
  علی قربانی کهریزسنگی   حشمت الله رحیمیان

وجود پلاسمید در باکتریهای p.syringae pv.syringae , psedomonas avenae erwinia ananas , agrobacterium tumefaciens , p.solanacearum salmonella sp,esherichia coli xanthomonas campestris pv. hedereبه کمک چند روش جداسازی پلاسمید مورد مطالعه قرار گرفت .استرین های باکتریائی برروی محیط کشت مناسب خود بمدت 24-48 ساعت رشد داده شدند. سلولهای باکتری در بافر te سوسپانسیون گردیده تا جذب نوری آنها در طول موج 600 نانومتر برابر با 5ˆ1 شد. سدیم دو دسیل سولفات (sds) به غلظت نهائی 1 درصد اضافه و لایزت 3بار ازسرنگ شماره 18 عبور داده شد. ph لایزت محتوی قطعات dna کروموزومی با اضافه کردن سود 3 نرمال به 2ˆ12 و بدنبال آن با اضافه کردن تریس 2 مولار، 7 = ph به -9 5ˆ8 رسانده شد. سپس کلرورسدیم 3 درصد و بدنبال آن یک حجم فنی اشباع از کلرورسدیم 3 درصداضافه گردید و به آرامی به هم زده شده و سانتریفوژ گردید. لایزت سانتریفوژ شده و فازروئی جداگردید . کلرور منیزیم و بافر فسفات سدیم 15ˆ0 مولار، 7 = ph و بدنبال آن 7ˆ0 حجم اتانول خنک (سرد) اضافه و لوله ها بمدت 12 ساعت در -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از سانتریفوژ در دور پائین و بدنبال آن حل رسوب حاصل در edta، بمدت 24 ساعت در بافر tes دیالیز شدند. سوسپانسیونهای مرحله نهائی، برروی صفحه افقی ژل 8ˆ0 درصد آگارز در ولتاژ 80 ولت بمدت 8 ساعت الکتروفورز شدند. سپس ژل در اتیدیوم بروماید(4ˆ0 میکروگرم در میلی لیتر) قرار داده شد . باندهای پلاسمیدی در زیر یک دستگاه uv-transilluminator آشکار گردیدند. از بین استرین های باکتریائی مورد مطالعه، erwinia ananas دارای 2 پلاسمید به اندازه 83 و 2ˆ12 مگادالتون و xanthomonas campestris pv.hederaeدارای یک پلاسمید با وزن مولکولی 100 مگادالتون بودند . وزن مولکولی این پلاسمیدها با استفاده از پلاسمیدهائی با وزن مولکولی مشخص از باکتریهای agrobaeterium radiobacter 84 (8ˆ29 و 124 مگادالتون) و pseudomonas glumae ku 8121 (8 و 85 و 124 مگادالتون) تعیین شد. در آزمایش مقاومت به آنتی بیوتیکها xanthomonas campestris pv.hederae و erwinia ananas به پنی سیلین و آمپی سیلین مقاوم بودند. هیچکدام از پلاسمیدها با آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید حذف نشدند.