آنزیم های α-آمیلاز کاربرد وسیعی در صنایع غذایی، داروسازی، نساجی و شوینده دارند. α-آمیلازهای تولیدشده توسط منابع میکروبی مختلف دارای خواص آنزیمی متفاوتی می باشند. آنزیم α-آمیلاز تولید شده توسط سویه bacillus sp.kr-8104 وابسته به یون کلسیم نمی باشد و همچنین بیشترین فعالیت آن درمحدوده ) ph6-4( گزارش شده است. با توجه به خواص ذکر شده، این آنزیم مورد توجه بسیاری از صنایع به ویژه صنعت نشاسته قرار دارد. در این پژوهش تولید آنزیم α-آمیلاز توسط سویه bacillus sp.kr-8104 بر روی سبوس گندم به عنوان سوبسترای ارزان قیمت در یک بیوراکتور بستر آکنده مقیاس آزمایشگاهی به روش تخمیر حالت جامد مورد بررسی قرار گرفت. در ابتدا جهت تعیین سطوح هوادهی، اثر مقادیر مختلف هوادهی بر میزان تولید آنزیم بررسی شد. سپس بهینه سازی میزان تولید آنزیم بر حسب متغیرهای عملیاتی (هوادهی، دما و رطوبت) به روش آماری سطح پاسخ انجام شد. تحت شرایط بهینه (شدت هوادهی 0/15 لیتر بر دقیقه، دما 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 72% وزنی) 9/53 ± 473/76واحد آنزیم بر گرم خشک ماده تخمیر شده تولید شد.

در مطالعات قبلی، آنزیمی به نام kra2-آمیلاز مستقل از کلسیم، از سویهbacillus sp. kra2 جداسازی شد. توالی نوکلئوتیدی ژن آنزیم kra2-آمیلاز و توالی اسید آمینه ای آن نشان داد که این آنزیم، به صورت پیش ساز آنزیمی سنتز می شود که دارای یک پپتید راهنما (33 اسید آمینه) و یک پروپپتید 11 اسید آمینه ای بعد از آن در قسمت n-ترمینال، آلفا آمیلازی بالغ در قسمت مرکزی (422 اسید آمینه، kda48) و یک پروپیتید طویل در قسمت –c ترمینال (193 اسید آمینه،kda 21) می باشد. براساس نتایج کریستالوگرافی که در مطالعه دیگر انجام شد، معلوم شد که آنزیم آمیلاز بدست آمده از منشأ باکتری kra2، دو قطعه ابتدایی (44 اسید آمینه) و قطعه انتهایی (193 اسیدآمینه) ترادف اسید آمینه ای استنتاج شده از ترادف نوکلئوتیدی ژن کد کننده این آنزیم را ندارد. بنابراین فرض بر این شد که آنزیم فاقد هر دو ناحیه مذکور تحت عنوان آنزیم بالغ و آنزیم دارای ناحیه انتهای کربوکسیل و فاقد قطعه آمینو (44 اسیدآمینه ابتدایی)، آنزیم نابالغ نامیده شود. جهت تعیین نقش قطعه c-ترمینال در عملکرد آنزیم، هر دو ژن کد کننده آنزیم بالغ و نابالغ، به طور جداگانه در ناقل بیانی pet28-a (+) و باکتری اشریشیاکولی bl-21، کلون و بیان شدند. پروتئین های نوترکیب، توسط ستون نیکل آگارز ni-nta، خالص سازی و خصوصیات بیوشیمیایی آن ها از قبیل پارامترهای سینتیکی، اثر یون کلسیم بر روی پایداری حرارتی آنزیم، اثر دما بر پایداری آنزیم، تعیین محصول نهایی عمل آنزیم با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک (tlc)، اثر ph و نیز مطالعات ساختاری cd و فلورسانس، بررسی شد. نتایج، ph بهینه و محصولات نهایی هیدرولیز نشاسته یکسانی را برای هردوی آنزیم های بالغ و نابالغ نشان داد، در حالیکه پارامترهای سینتیکی آنزیم های kra2-آمیلاز با یکدیگر متفاوت بود. مقایسه پارامترهای سینتیکی نشان داد که آنزیم kra2-آمیلاز نابالغ، دارای km کمتر و یا تمایل بیشتر برای هر دو سوبسترای نشاسته و سوبسترای کروموژن (eps) است، در حالیکه بازده کاتالیتیکی هر دو شکل آنزیمی، مشابه است. بعلاوه، فعالیت آنزیم kra2به وسیله edta مهار نشد، که نشان دهنده عدم وابستگی آنزیم kra2-آمیلاز به یون کلسیم است. مطالعات ساختاری طیف سنجی دو رنگ نمایی دورانی در ناحیه دور uv، درصد صفحات β ی بیشتر، و نیز مطالعات پایداری حرارتی آنزیم های بالغ و نابالغ، tm بیشتر برای آنزیم نابالغ را نشان داد. همچنین نشر ذاتی آنزیم های بالغ و نابالغ، آب گریزی آن ها در حضور ans و نیز پایداری حرارتی آن ها با استفاده از فلورسانس اندازه گیری و با یکدیگر مقایسه شدند.

آنزیم، فرآیند های آنزیمی و کاربرد آن در علوم مختلف، زیرمجموعه علوم زیستی یا بیوساینس می باشند. پس از مباحث میکروبیولوژی، بیولوژی، در سال های اخیر رشته نانوبیوتکنولوژی نیز به این مجموعه رشته ها در حوزه علوم زیستی اضافه گشته است. موارد کاربرد آنزیم ها بیشتر مرتبط با مبحث بیوشیمی می باشد. آنزیم ها نوعی از پروتئین تولید شده در سلول های موجودات زنده هستند که قابلیت تسریع واکنش های شیمیایی خاص و منحصر به فرد و دگرگونی در ترکیبات مشخص و تولید محصولات دیگر را دارند و البته خود آنزیم در پایان یک واکنش کاتالیزی دچار تغییر نمی گردد. این واکنش ها در شرایط معمولی رخ نمی دهند و نیاز به وجود شرایط آزمایشگاهی پایدار و ایجاد اسیدیته و دمای مناسب دارند. مهمترین کاربردی که آنزیمها در حوزه حفاظت و مرمت آثار تاریخی دارند و به بررسی آن پرداخته شده است شامل: تمیز کاری و حذف رزین های اکریلیکی از سطوح آثار نقاشی با استفاده از لیپاز، زدودن چسب های قدیمی از آثار و بازکردن تکیه گاههای اشیاء و آثار که دارای چسب های با ماهیت مرتبط با فرایند های آنزیمی و فعالیت آنزیم می باشند. آنزیم ها در هنگام واکنش آنزیمی و تمیز کاری در آثار تاریخی با مکانیزم تجزیه چرک تشکیل شده از مولکول بزرگ به مولکولهای کوچکتر قابل حل بر طبق فرضیه قفل و کلید، واکنش می دهند.مهمترین آنزیم هایی که در حوزه حفاظت و مرمت کاربرد داشته و دارد، الفا آمیلاز، پروتئاز و لیپاز می باشد. این مواد به عنوان کاتالیست های آبی سرعت واکنش های شیمیایی را به طور قابل توجهی( تا10 میلیون برابر) افزایش می دهند و با این عمل مواد چرکی را از سطح آثار پاک می کنند. البته هر آنزیمی قابلیت تاثیر بر مواد و چسب و رزین خاص و منحصر به فرد را دارد و بر طبق نوع ماده مورد نظر، آنزیم آن جهت واکنش انتخاب می گردد. مهمترین مواردی که در بررسی این موضوع با آن برخورد می کنیم شامل: حیطه کاربرد آنزیم ها در این حوزه، شرایط نگهداری آنزیم ها در حالت عادی، ایجاد شرایط آزمایشگاهی مناسب در حین کار با آنزیم ها، تاثیرات ثانویه استفاده از آنزیم بر آثار، حذف بقایای برجا مانده در آثار می باشد. اهداف این پروژه شامل موارد زیر می باشد: شناخت آنزیم ها و نحوه فعالیت آنها در یک واکنش آنزیمی شناسایی آنزیم های قابل استفاده در حفاظت و مرمت و نحوه عملکرد آنها در این آثار بررسی و مشاهده نتایج کار ازمایشگاهی جهت برداشتن چسب نشاسته ای از سطح اثار در این پروژه ما با این فرضیه شروع به بحث می کنیم که آنزیم ها به عنوان مواد پروتئینی قابلیت تاثیر بر برخی از واکنش ها را دارند و می توان از آنها در تمیزکاری که یکی از مراحل حفاظت و مرمت آثار تاریخی می باشد، استفاده کرد. در بخش پایانی این پروژه بر روی دو موضوع اساسی از فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز در حوزه مرمت بررسی هایی صورت گرفته است که یکی استفاده از کمترین میزان آنزیم آلفا آمیلاز که نتایج آن به شکل کیفی در جدول هایی ارائه شده است. و در بخش بررسی های دستگاهی در ابتدا با استفاده از روش atr ft-ir بررسی صورت گرفته ولی به دلیل کم بودن غلظت نشاسته تفاوت معنادار در طیف های به دست آمده دیده نمی شود که تحلیل آن ارائه شده است ولی در بررسی های با استفاده از sem در چهار مرحله تصویربرداری انجام شده است که نتایج به دست آمده نشان می دهد که موضوع بقایای آنزیمی که یکی از چالش های اساسی در مرمت آنزیم به شمار می رودف با این روش تا حدود زیادی مرتفع شده است و با یک مرحله شستشو با آب دیونیزه به حذف بخش اعظم این بقایای آنزیمی دست یافته شد.

در این پروژه، مطالعاتی جهت بررسی فعالیت و پایداری حرارتی بر روی دو نوع آنزیم گلیکوزیل هیدرولاز به انجام رسید. ابتدا ژن کد کننده آنزیم آلفا-آمیلاز حاصل از باکتری بومی باسیلوس مگاتریوم who جداسازی شد. سپس به منظور تبیین نقش اسیدهای آمینه متصل شونده به کلسیم در پایداری حرارتی این آنزیم پنج جهش نقطه ای طراحی شد و به انجام رسید. آنزیم های جهش یافته، فعالیت هیدرولازی خود را حفظ کردند. از طرفی در حضور یون کلسیم تمایل آنزیم (انواع وحشی و جهش یافته) نسبت به سوبسترای نشاسته افزایش یافت. در مقایسه با آنزیم وحشی، یون کلسیم اثر مثبتی بر روی بازده کاتالیتیک بیشتر آنزیم های جهش یافته داشت. در جهش یافته های a53s، n75d، s76p و h77e وابستگی نیمه عمر آنزیم به غلظت یون کلسیم نشان داد که بهبود پایداری حرارتی آنها به علت اتصال افزایش یافته یون کلسیم می باشد. در مقابل، جهش یافته h58i، بدون وابستگی به کلسیم در مقابل حرارت پایدار شده است. در پایدارترین جهش یافته، تبدیل his-77 به گلوتامات منجر به افزایش 4 برابری نیمه عمر در دمای 65 درجه سانتیگراد و نیز افزایش دمای گذار ظاهری (t50) و دمای بهینه عملکرد آن به مقدار 9 و 4 درجه سانتیگراد به ترتیب، در مقایسه با آنزیم وحشی شد. بعلاوه پارامترهای ترمودینامیکی واکنش آمیلولیتیک و واکنش غیر فعال سازی حرارتی، افزایش انرژی فعال سازی سیستم را به میزان 4/1 برابر نشان داد. در این مطالعه نشان داده شد که یک جهش نقطه ای می تواند آلفا-آمیلازی مزوفیل را به آنزیمی پایدار، بدون از دست دادن قدرت کاتالیتیک آن در دماهای ملایم تبدیل کند. در مطالعه دیگری، آمیلوپلولاناز l14-apu از منشأ یک باکتری گرمادوست بومی ایران خالص سازی شده و اثر اکاربوز، به عنوان بازدارنده عمومی آلفا-آمیلازها، بر روی هیدرولیز نشاسته و پلولان توسط آنزیم مذکور مورد بررسی قرار گرفت. این بازدارندگی از نوع رقابتی بوده و ثابت بازدارندگی آن برای سوبسترای پلولان و نشاسته به ترتیب، 99 و 72 میکرومولار اندازه گیری شد. بررسی سرعت واکنش در سیستمی شامل انواع سوبستراهای رقابتی و الگوی بازدارندگی رقابتی اکاربوز در حضور سوبستراهای متفاوت، وجود یک جایگاه فعال برای دو فعالیت کاتالیتیک را پیشنهاد می کند. آنالیز اثر یونهای فلزی و سایر واکنشگرها نشان می دهد که یونهای ca2+، mg2+، mn2 و +co2، هر دو فعالیت آنزیم را افزایش داد در حالیکه n-بروموسوکسینامید منجر به غیرفعال شدن آنزیم شد. همچنین فعالیت آنزیم در حضور غلظت های اندک sds نیز افزایش یافت.

آنزیم متیل گلی اکسال سنتاز (mgs) از گروه لیازها بوده و یک آنزیم متابولیسمی می باشد. این آنزیم با تبدیل دی هیدروکسی استون فسفات به متیل گلی اکسال گلیکولیز را از مسیر خویش منحرف می سازد. در این تحقیق ژن رمزدهی کننده mgs از گونه thermus sp. gh5 (tmgs) کلون، تعیین ترادف و بیان گردیده و سپس توسط کروماتوگرافی تعویض یونی و با استفاده از رزین q- سفاروز تخلیص گردید. ژن tmgs 399 جفت باز داشته و پلی پپتیدی با 132 آمینواسید و با وزن مولکولی 3/14 کیلو دالتون را رمزدهی می کند. km و kcat آنزیم tmgs به ترتیب 56/0 میلی مولار و (s-1) 325 می باشد که شبیه به آنزیم mgs از e. coli می باشد. ph بهینه و دمای بهینه برای فعالیت tmgs به ترتیب 6 و 75 درجه سانتیگراد می باشد. مقایسه ترادف آمینواسیدی و ضریب هیل mgs از e. coli و tmgs نشان می دهد که نبود آرژینین 150 در tmgs باعث کاهش در تعاونی بین زیر واحدها در حضور فسفات به عنوان مهار کننده آلوستریک شده است. نتایج فیلتراسیون ژلی نشان داد که tmgs آنزیم هوموهگزامر بوده و ساختار چهارم آن در حضور فسفات تغییر نمی یابد. تاثیر متابولیت های مختلف بر روی فعالیت آنزیم نشان داد که nadh با مهار tmgs می تواند نقشی در تنطیم شانت متیل گلی اکسال داشته باشد. عامل بروز رفتار آلوستریک در آنزیم tmgs آمینواسیدهای دخیل در مسیر انتقال تغییرات آلوستریک بین زیر واحدهای آنزیم یعنی 82 pro، 97 arg، 101 val و 101 asp می باشد. برای بررسی این مسیر با جهش زایی هدفمند، جهش یافته های k97r، s101v، i101v و a101v ساخته شد. تعیین خصوصیات سینتیکی نشان داد که همکاری بین زیر واحدها در حضور فسفات و بدون حضور فسفات در جهش یافته های k97r، s101v، i101v یکسان بوده و بنابراین در این جهش یافته ها تعاونی بین زیر واحدها در حضور فسفات از بین رفته اما در جهش یافته a101v دیده شد که تعاونی بین زیر واحدها باقی مانده است. همچنین در این جهش یافته ها دیده شد که به موازات کاهش لگاریتمی در کارایی کاتالیتیکی ضریب هیل (تعاونی بین زیر واحدها) افزایش می یابد.

حلال های آلی با کندن مولکول های آب از سطح پروتئین باعث تخریب نیروهای غیر کووالان و کاهش فعالیت و پایداری آنزیم می شوند. این آنزیم از یک باکتری هالوفیل ایرانی که از دریاچه نمک جداسازی شده است، بدست آمده است. بر اساس نتایج تکامل جهت دار و کریستالوگرافی در حضور حلال های آلی، جهش یافته های a195e و g203d برای افزایش قطبیت در نزدیکی جایگاه فعال طراحی شدند تا به حفظ لایه آب پوشی در این منطقه در برابر حلال های آلی dmf، متانول، ایزوپروپانول و پروپانول کمک کنند. a268p نیز برای پایدار سازی لوپ اطراف جایگاه فعال طراحی شد. جهش یافته a195e/a268p نیز برای بررسی این دو راهکار با هم طراحی گردید. نتایج نشان دادند که مقدار c50 (غلظتی از حلال آلی که در آن غلظت مقدار فعالیت آنزیمی به نصف کاهش یافته باشد) جهش یافته a195e به میزان 5 و 6 درصد در حضور حلال آلی dmf و متانول افزایش می یابد در حالی که در حضور ایزوپروپانول و پروپانول به میزان 3 درصد افزایش می یابد. شیب غیر فعال شدن دمایی برایa195e حدود (×10-3 min-1) 60 و 130در حضور dmf و پروپانول گزارش می شود، در حالی که شیب غیر فعال شدن در همین شرایط حدود(×10-3 min-1) 90 و 190 می باشد. جهش یافته های a268p و a195e/a268p شیب غیر فعال شدن دمایی آنزیم را به میزان قابل توجهی کاهش می دهند. از طرف دیگر کرامبین به عنوان پایدارترین پروتئین شناخنه شده در حلال های آلی و pst-01 نیز به عنوان کاراترین پروتئاز در حلال های آلی مطرح هستند. آنالیز آماری رزیدوهای سطحی کرامبین ما را به این نکته رهنمون ساخت که تعداد رزیدوهای هیدروفوب در بیرونی ترین سطح این پروتئین بیشتر از رزیدوهای قطبی و بار دار است. با توجه به این یافته ها، رزیدوهای قطبی و باردار بیرونی ترین لایه پروتئین svp با رزیدوهای هیدروفوب تر جایگزین شدند. برای تعیین نوع جایگزینی نیز از رزیدوهای هیدروفوب لایه های بیرونی این دو پروتئین مقاوم و کارا در حضور حلال های آلی (کرامبین و pst-01) استفاده شد. نتایج نشان دادند که حضور رزیدوی هیدروفوب در سطح پروتئین می تواند فعالیت، پایداری و کارایی کاتالیتیک آنزیم را در حضور حلال آلی افزایش دهد. در مقایسه با svp، جهش یافته های n248g، s134y و y23v، kcat و کارایی کاتالیتیک آنزیم را به میزان قابل توجهی افزایش داده و سرعت غیر فعال شدن دمایی آنزیم را نیز کاهش داده اند. این در حالی است که مطالعات ساختاری نشان می دهد این جهش یافته ها تغییرات ساختاری ایجاد نمی کنند. این نتایج آشکار می سازد که با افزایش هیدروفوبیسیته سطحی کارایی کاتالیتیک آنزیم با قدرت هیدروفوبیسیته حلال رابطه مستقیم دارد.

چکیده برخی سامانه های زیستی مانند باکتری ها، مخمرها و قارچ ها توانائی تولید انواع نانوذرات را دارند. استفاده از ریزسازواره هایی مانند قارچ فوزاریوم اکسیسپروم که نانوذرات را در خارج از سلول ، به صورت پایدار، با توزیع اندازه ی ذرات مناسب، عاری از آلودگی شیمیایی و ایمن از لحاظ زیست محیطی تولید می کنند، مورد توجه قرار گرفته است. در پژوهش هایی که تاکنون بر روی تولید نانوذرات نقره از قارچ فوزاریوم اکسیسپروم صورت گرفته، از نیترات نقره برای پیش ماده استفاده شده است. روشن شدن مسیر بیوشیمیایی سامانه های زیستی برای احیاء فلزات، به منظور توسعه فرآیند تولید زیستی نانوذرات ضروری به نظر می رسد. در این پژوهش آزمایش هایی برای بررسی مسیرهای بیوشیمیایی تولید نانوذرات توسط قارچ فوزاریوم اکسیزپروم انجام شده است. در منابع متعددی به نقش آنزیم نیترات رداکتاز در احیاء یون های نقره اشاره شده است، بنابراین نقش این آنزیم در تولید نانوذرات مورد بررسی قرار گرفته است. با توجه به اینکه قارچ فوزاریوم اکسیزپروم با بکارگیری سازوکار تنفس نیترات یک قارچ هوازی اختیاری محسوب می شود، با ایجاد شرایط نیترات زدایی در تولید نانوذرات، بازدهی تولید نانوذرات افزایش می یابد. با تولید نانوذرات از ترکیبات دیگر نقره مانند سولفات نقره و دی آمین نقره و هم چنین تولید نانوذرات در حضور بازدارنده ی آنزیم نیترات رداکتاز و تولید نانوذرات با صافیده سلولی، نتیجه گیری شد که مسیر آنزیم نیترات رداکتاز تنها سازوکار قارچ فوزاریوم اکسیزپروم برای تولید نانوذرات نمی باشد. در ادامه برای بررسی پروتئین های موثر در تولید نانوذرات، کلوئید نانوذرات حاصل با روش sds-page الکتروفورز شد . با توجه به نتایج آزمایش های الکتروفورز و تشکیل نانوذرات از صافیده سلولی به دست آمده از اولترافیلتراسیون، مشخص شد که مهم ترین پروتئین ها در احیاء یون های نقره و پایداری نانوذرات در محدوده وزن مولکولی 20-10 کیلودالتون قرار دارند.

چکیده: پایدار سازی پروتئین نسبت به حرارت توام با بهبود فعالیت، با در نظر گرفتن رابطه ی بین فعالیت و عملکرد تا حدی مشکل به نظر می رسد. zn-متالو پروتئازها از اعضای خانواده ی پروتئازهای همولوگ هستند که نسبت به مقاومت دربرابر حرارت وهضم خودبه خودی با یکدیگر متفاوت هستند. موتاسیون های (ala39? pro) و (thr63?phe)واقع بر سطح یک zn-متالوپروتئاز جدید از salinivibrio proteolyticus طراحی شد. دو جهش جدید توسط روش جهش زایی هدفمند ایجاد شده، سپس پارامتر ها ی بیوشیمیایی و سینتیکی، پایداری حرارتی و مقاومت در برابر autodegradation واریانت ها مورد بررسی قرار گرفت. واریانت ها در وکتور بیانی pqe-80l کلون شده بودند. حداکثر میزان بیان با دما ی ?c30، غلظت mm iptg1 و در محیط کشت lb به دست آمد. بعد از تخلیص آنزیم با ستون q-سفارز کروماتوگرافی، مقاومت در برابر حرارت و هضم خودبه خودی جهش یافته ها مورد بررسی قرار گرفت. جهت بررسی اثرات ساختاری موتاسیون ها، طیف سنجی فلورسانس ذاتی و دورنگ نمایی دورانی در محدوده ماورای بنفش دور، به ترتیب به عنوان شاخص های ردیابی ساختار ها ی سوم و دوم مورد استفاده قرار گرفت. در این جهش یافته ها مقاومت در برابر هضم خودبه خودی و پایداری حرارتی تا حدودی نسبت به آنزیم وحشی افزایش داشت. همچنین پارامتر های سینتیکی نیز نسبت به آنزیم وحشی تا حدودی تغییر یافته بودند. کلمات کلیدی: مهندسی پروتئین، هضم خود به خودی، متالو-پروتئاز ها و طیف سنجی

گونه های زانتوموناس کمپستریس به کمک غربالگری از خاک کرج، ایران جدا سازی شدند. این گونه های جدا شده به وسیله روش نیمه کمی از نظر توانایی تولید آمیلاز مقایسه شدند که سرانجام گونه زانتوموناس کمپستریس sam0302 انتخاب شد. آمیلاز به کمک روش رسوبدهی با آمونیوم سولفات و کروماتوگرافی تعویض آنیونی تخلیص شد. هموژنی بخش خالص شده توسط الکتروفورز ژل پلی اکریلامید بررسی شد و سپس وزن مولکولی آن 65 کیلو دالتون تعیین شد. دما و ph بهینه به ترتیب 47 درجه سانتیگراد و 1/6 مشخص شد. کاتیون های کلسیم پایداری دمایی آنزیم را که در 47 درجه سانتیگراد پایدار بود را افزایش داد، ولی حدود 90% فعالیت آن پس از 30 دقیقه در 1/6 = ph در 60 درجه سانتیگراد از بین رفت. به علاوه، مقادیر ثابت میکائیلیس و سرعت ماکزیمم آنزیم خالص شده در نشاسته محلول( دمای 45 درجه سانتیگراد، 1/6=ph ) به ترتیب 3/4 mg/mlو 2/4 µmol/min محاسبه گردید.

اکورین فوتوپروتئینی است که اولین بار از نوعی عروس دریایی بنام aequoera victoria کشف شد، که قادر است از خود نور آبی رنگ ساطع نماید. بدلیل حساسیت بالای اکورین به غلظت کلسیم و با توجه به اینکه در این پروتئین، درصد سیگنال نسبت به نویز پس زمینه، بسیار بالا است ، از این فوتوپروتئین در حوزه های مختلف زیست فناوری استفاده های زیادی می شود. در این پژوهش طی سه مرحله بر روی این پروتئین تحقیقات صورت گرفت: 1- فوتوپروتئین نوترکیب، در سیستم بیانی pet 21a(+) کلون و بیان گردید. پس از خالص سازی ، اکورین نوترکیب مورد آنالیز ساختاری ، سینتیکی ، پایداری حرارتی، خاموش کنندگی و پروتئازی در حضور چند پایدارکننده قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر افزایش پایداری و فعالیت اکورین تولیدی در حضور سوربیتول با کمترین تاثیر در هضم پروتئازی و خاموش کنندگی با آکریل آمید می باشد. 2- جهش های شیفت نوری و تغییر زمان تضعیف نشر نور در سه جهش y82f، w86f و d153g بصورت تک و دوتایی صورت گرفت. براین اساس شش پروتئین جهش یافته با نامهای aeq-82 ، aeq-86 ، aeq-153 ، aeq-82/86 ، aeq-82/153 و aeq-86/153 بدست آمد. در ادامه جهش های حاصله از نظر شیفت نوری، مدت زمان تضعیف نشر نور و پایداری حرارتی مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج بدست آمده نشان داد بیشترین طول موج نشر نوری از 457 نانومتر(aeq.) به 400 (aeq-82/86) و 478 (aeq-82 و aeq-82/153)نانومترتغییر یافته است. از سوی دیگر t1/2 یعنی مدت زمانی که فعالیت فوتوپروتئین، به 50 درصد اولیه می رسد، از 0.7 ثانیه(aeq.) به 3.7 (aeq-82)ثانیه افزایش یافته است. همچنین بنظر می رسد دو جهش aeq-86 و aeq-82/153 ، سبب افزایش پایداری حرارتی پروتئین در استرس دمایی 65 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه، شده است. 3- در بخش سوم از تحقیقات، از اکورین بعنوان آنزیم گزارشگر جهت شناسایی ترکیبات آروماتیک نظیر تولوئن و بنزن در قالب یک حسگر زیستی باکتریای استفاده شد. در این پژوهش از اجزاء اپرون xyl موجود در باکتری سودوموناس پوتیدا mt-2 استفاده گردید. به این صورت کهcdna فاکتور فعال کننده نسخه برداری یعنی xylr که در حضور ترکیبات آروماتیک فعال می شود و در دانشگاه مالک اشتر در داخل پلاسمید pgl2 کلون و با نام pgl2-px ثبت گردیده بود، مورد استفاده قرار گرفت. از سوی دیگر، بعد از پروموتور pu (که بوسیله پروتئین xylr فعال می شود) فوتوپروتئین اکورین همراه یا بدون حضور توالی شاین دالگارنو (sd) یا توالی ختم رونویسی rrnb)) در منطقه بالادستی آن کلون گردید. سپس پلاسمید طراحی شده در درون باکتری jm109 ،ترانسفورم گردید. به این ترتیب نوعی حسگر زیستی بر مبنای باکتری jm109 طراحی و بدست آمد. حسگر باکتریایی تولیدی در ادامه مورد آنالیز فعالیت براساس غلظت های متفاوت تولوئن و ترکیبات مشابه قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر مناسب بودن این حسگر باکتریایی جهت جایگزینی آن به جای روش های مرسوم شیمیایی نظیر کروماتوگرافی فشار بالا (hplc) می باشد.

چکیده گرمادوست ها موجوداتی هستند که در دمای بالاتر از 45 درجه رشد می کنند و از نظر احتیاجات حیاتی به ترکیبات گوگردی احیاء و محیط های گرم نیاز دارند. اکثر ارگانیزم های گرمادوست از خاک ها و آب های حاوی عنصر گوگردی جداسازی شده اند که در اثر فعالیت های طبیعی زمین گرم هستند. این ارگانیزم ها دارای آنزیم ها و مسیرهای متابولیکی خاصی هستند که کاربرد وسیعی در بیوتکنولوژی دارند، بنابراین مطالعه بر روی چگونگی زندگی این موجودات ضروری به نظر می رسد. در این مطالعه با استفاده از روش پروتئومیکس محتوای پروتئینی باکتری ترموس gh5 (جداسازی شده از چشمه های آب گرم زیست بوم ایران (اردبیل در شمال غربی ایران))رشد یافته در شرایط طبیعی (رشد در دمای c ° 75) و شوک سرمایی (رشد در دمای c ° 45 به مدت 2و 5و 8 ساعت) مورد مقایسه قرار گرفت. با توجه به تغییر محتوای پروتئینی باکتری پس از شوک سرمایی می توان تا حدودی شرایط فیزیولویکی سلول را حدس زد. . بطور کلی پس از شوک سرمایی اکثر فعالیت های سلولی و در نتیجه رشد سلولی متوقف می گردد و سلول مکانیزم های جدیدی را در پیش می گیرد که در نتیجه آن تعدادی از پروتئین-ها افزایش بیان یافته و نیز موجب بیان پروتئین های جدیدی می شود که در کاتابولیسم ترکیبات کربنی پر انرژی و سنتز اسیدهای آمینه و اسیدهای نوکلئیک نقش دارند. بنظر می رسد که در شرایط سرما ذخیره انرژی از مهمترین رویکردها برای سلول محسوب می شود. واژگان کلیدی: ترموسgh5، گرمادوست، شوک سرمایی، پروتئومیکس، استرس

لاکازها (1.10.3.2 ;ec پارا دی فنول دی اکسیژن اکسیدوردوکتاز) بدلیل قابلیت اکسیداسیون طیف گسترده ای از ترکیبات فنولی کاربردهای زیادی در صنایع بیوتکنولوژی دارد. در این تحقیق ژن لاکاز از bacillus sp. hr03 بوسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر و سپس محصولات pcr در ناقل بیانی (pet21a) کلون و به باکتری e.coli سویه bl21 انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت. ژن لاکاز حاوی 1542 نوکلئوتید بوده و 514 اسید آمینه را کد می کند. cota جدا شده از bacillus hr03 2/98% شباهت و 8/98% همسانی را با cota از باسیلوس سوبتیلیس نشان می دهد. بمنظور بدست آوردن مقادیر بالای پروتئین محلول بیان تحت شرایط میکروآئروبیک و در دمای پایین انجام گرفت. پروتئین نوترکیب بوسیله ستون q-sepharose تخلیص و وزن مولکولی آنزیم بوسیله sds-page 65 کیلو دالتون تعیین گردید. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم با استفاده از سه سوبسترای معمول لاکاز 2, 2?-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid) (abts)، syringaldazine (sgz) و2, 6-dimethoxyphenol (2, 6-dmp) انجام گرفت. km و kcat به ترتیب در هنگامیکه واکنشها در دمای اتاق انجام گرفت برای abts -µm 535 و s-1 127، برای µm 2, 6-dmp 53 و s-1 3 و برای sgz µm 5 و s-1 20 تعیین گردید. بعلاوه ما اثر nacl را بر فعالیت لاکاز بررسی کردیم که با افزایش غلظت nacl فعالیت کاهش پیدا می کند.

لیپاز ها خانواده ای از آنزیم های هیدرولاز می باشند، که عمل هیدرولیز تری گلیسریدها به دی-گلیسریدها، مونوگلیسرید ها و گلیسرول را کاتالیز می کنند. این آنزیم ها در بسیاری از صنایع تولید مواد غذایی، چرمسازی، تولید مواد شوینده، تولید مواد شیمیایی، تصفیه فاضلاب، پزشکی و داروسازی کاربرد دارند. دسته ای از آنزیم های لیپاز که از موجودات میکروسکپی استخراج می-شوند، لیپاز های میکروبی نام دارند. آنزیم لیپاز سودوموناس سپاسیا یک نوع از این لیپاز ها می-باشد، که از باکتری سودوموناس سپاسیا استخراج می شود. این آنزیم بدلیل قدرت انتخاب گری فضایی بالا و پایداری زیاد در برابر استرس های محیطی در صنعت تولید انواع خاص از اشکال فضایی مواد زیستی و شیمیایی کاربرد دارد. امروزه افزایش پایداری آنزیم بدون کاهش در فعالیت آن، هدف اصلی صنایع تولید کننده و کاربردی این آنزیم می باشد. در این تحقیق با استفاده از روش استفاده از افزودنی های پایدارکننده (سوربیتول و ترهالوز)، اثر این افزودنی ها در فعالیت و پایداری ساختاری آنزیم با استفاده از تکنیک های طیف سنجی فرابنفش-نور مرئی، فلورسانس و دورنگ نمایی دورانی بررسی شده است. نتایج این آزمایشات نشان داد که فعالیت سینتیکی آنزیم در حضور هر دو اسمولیت افزایش می یابد و این در حالی است که بر اساس نتایج حاصل از آزمایش دورنگ نمایی دورانی این دو اسمولیت ساختار دوم آنزیم را دستخوش تغییرات فاحشی نمی کنند. در حضور ترهالوزساختاردوم آنزیم به میزان اندکی فشرده تر شده است و شدت فلورسانس آنزیم نیز افزایش یافته است. در حضور سوربیتول نیز به میزان اندکی ساختارآنزیم باز شده و این در حالی است که شدت فلورسانس ذاتی آنزیم در حضور این اسمولیت افزایش یافته است. برای بررسی دقیق تر مکانیسم اثر این دو اسمولیت برروی ساختارآنزیم و حلال مجاور آن را، برای اولین بار در این تحقیق تغییرات ضریب دی الکتریک حلال با کمک تکنیک رزونانس پلاسمون های سطحی نانو ذرات طلا مورد مطالعه قرار گرفته است. این نتایج نشان داد که ظاهراً در مکانیسم اثر این دو نوع اسمولیت ها تفاوت هایی دیده می شود. ترهالوز بدون تغییر محسوسی در ضریب دی الکتریک حلال مجاور پروتئین بر طبق مکانیسم دور شدن ترجیحی با دور شدن از سطح آنزیم سبب افزایش کشش سطحی آب اطراف سطح آن شده و از این طریق سبب افزایش پایداری آنزیم می شود، در حالی که سوربیتول با کاهش ضریب دی الکتریک و برقراری پیوندهای هیدروژنی با سطح پروتئین باعث شده که در مکان هایی از سطح، ساختار آنزیم به میزان اندکی باز شود و شایدهمین امر سبب افزایش انعطاف پذیری آنزیم و در نتیجه افزایش فعالیت آن در حضور این اسمولیت می شود.

چکیده لیپازها به عنوان یک گروه آنزیمی مهم باعث هیدورلیز و سنتز استرها می شوند. لیپاز سودوموناس فلوئورسانس یک نوع گرمادوست از لیپازها است که وزن مولکولی آن در حدود 33 کیلودالتون می باشد. در این پایان نامه در ابتدا مطالعات انجام گرفته به تاثیر پرولین و سوربیتول بر روی تغییرات فعالیت آنزیم اختصاص داده شد. از طرف دیگر مطالعات ساختاری با استفاده از تکنیک های cd و فلوئورسانس انجام شد. این تحقیقات نشان داد که با افزایش تشکیل ساختارهای ?- هلیکس فعالیت هم افزایش می یابد. مطالعات سینتیکی ریفولدینگ لیپاز در حضور و عدم حضور پرولین وسوربیتول به وسیله ی تکنیک فلوئورسانس جریان متوقف انجام شد. این بررسی ها نشان داد که فرآیند ریفولدینگ از دو مسیر مجزا و موازی هم با ثابت سرعت های ?1 و 2? شروع می شوند. فشردگی اولیه به نوع و غلظت اسمولیت بستگی دارد به عبارت دیگر، دو شکل مولکولی در مراحل ابتدایی فولدینگ وجود دارد: شکل تکی و فرم دوتایی. این نتایج مشخص می کند که پرولین و سوربیتول اسمولیت های پایدارکننده می باشند. شاید تشکیل چندتایی پرولین و اثر اسموفوبی سوربیتول باعث ایجاد این تاثیرات می شوند.

آنزیم آلفا آمیلاز از سویه باکتریایی bacillus sp.kr8104 از 422 اسید آمینه تشکیل شده و 48 کیلو دالتون جرم دارد. این آنزیم یک آنزیم ترشحی میباشد که توسط این سویه به فضای خارج سلولی ترشح میشود. این آنزیم دارای دو فرم بالغ و نابالغ می باشد. آیا آنزیم آمیلاز به صورت نابالغ توسط باکتری ترشح میشود و سپس در محیط خارج سلولی بالغ میشود یا به صورت بالغ به خارج از سلول ترشح میشود؟ سوالی است که در مورد این آنزیم مطرح شده است. با تهی? آنتی بادی مونوکلونال علیه فرم های مختلف آلفا آمیلاز از سویه باکتریایی bacillus sp.kr8104 و استفاده از آن به عنوان ابزار تشخیص در تست های ایمیونولوژی نظیر elisa و immunoblot می توان به این سوال جواب داد. در این مطالعه پس از 3 نوبت تزریق زیر پوستی آلفا آمیلاز به 5 موش از نوع balb/c و تعیین تیتر آنتی بادی اختصاصی با روش الایزا، با به کارگیری پلی اتیلن گلیکول 1500، سلول های لنفوسیت موش های ایمن شده با سلول های میولما sp2/0 ادغام شدند. سپس سلول های به دست آمده از مرحله ی قبل، در محیط کشت حاویhat و سرم 20% کشت داده شدند و بعد از 2 هفته 117 کلون هیبریدوما به دست آمد. برای تشخیص و انتخاب هیبریدوماهای با توانایی ترشح آنتی بادی علیه قطعه یc-terminal موجود در آلفا آمیلاز از bacillus sp. kr-8104 و آنزیم بالغ آلفا آمیلاز bacillus sp. kr-8104 الایزا روی محیط کشت روی کلون های حاصل انجام شد، که بین کلون ها یک کلون با توانایی ترشح آنتی بادی علیه قطعه ی c-terminal موجود در آلفا آمیلاز از bacillus sp. kr-8104 و یک کلون با توانایی ترشح آنتی بادی علیه آنزیم بالغ انتخاب شد. با روش رقیق سازی محدود یک کلون پایدار در تولید آنتی بادی مونوکلونال مورد نظر به دست آمد. آن گاه سلولهای هیبریدوما برای بررسی های بیش تر تقسیم و فریز شد. کلمات کلیدی: قطعهc-terminal آنزیم آلفا آمیلاز، هیبریدوما، آنتی بادی مونوکلونال

چکیده: آکاربز یک داروی ضد دیابت است که هیدرولیز نشاسته توسط آلفا-آمیلاز را مهار می کند. بررسی مکانیسم مهار و اسیدهای آمینه درگیر در این مهار می تواند کمک شایانی به طراحی داروهای موثرتر مشتق از آکاربز کند. bacillus subtilis مقایسه توالی اسی دهای آمینه و ساختار کریستالوگرافی آنزیم آلفا- آمیلاز بدست آمده از مشخص م یکند که با وجود شباهت بسیار زیاد، مهار آنها در به bacillus kr-8104 (bka) و (bsua) انتخاب bka در جایگاه فعال tyr و 175 ser وسیله آکاربز متفاوت است. در این مطالعه دو اسید آمینه 105 شوند. (phe و 175 phe 105) bsua شد هاند تا به روش جه شزایی هدفمند تبدیل به معادل آنها در برای همه ic و 50 ki کاهش پیدا کرده است. همچنین ثابت مهار kcat و km پارامترهای سینتیکی از جمله آنزی مهای جهش یافته افزایش پیدا کرده که نشان دهنده اهمیت هر دو اسید آمینه در مهار توسط آکاربز است. با tyr با آکاربز و 175 ser نشان می دهد که با این تغییر پیوند های هیدروژنی که 105 docking مطالعات دیگر اسیدهای آمینه که در جایگاه فعال قرار دارند و ایجاد شبکه پیوند هیدروژنی می کنند از بین می رود و این دلیل اصلی کاهش حساسیت جهش یافته ها نسبت به آکاربز در مقایسه با آنزیم وحشی است.

سویه bacillus sp. kr8104 آلفا-آمیلازی غیر وابسته به کلسیم تحت نام bka تولید و با کارایی بالا به محیط کشت خود ترشح می‏کند. کریستالوگرافی آنزیم خالص‏شده از محیط کشت پروتئینی با سه دمین عمومی آلفا-آمیلازها متشکل از 422 آمینو اسید را نشان می‏دهد. ژن این آنزیم پروتئینی با 659 آمینو اسید کد می‏کند که علاوه بر ناحیه 422 آمینو اسیدی به دست آمده در کریستالوگرافی دارای دو پپتید دیگر یکی 44 آمینو اسیدی در انتهای آمین (با مشخصات پپتیدهای نشانه مسیر ترشحی sec) و دیگری 193 آمینو اسیدی در انتهای کربوکسیل است. آنزیم بدون پپتید انتهای کربوکسیل km و kcat بیشتری را در مقابل دو سوبسترای نشاسته و eps نشان می‏دهد. برای بررسی نقش این پپتید در ترشح آنزیم چهار فرم نوترکیب مختلف از bka با و بدون پپتیدهای انتهای آمین و انتهای کربوکسیل[bka, bka?(c193), bka?(n44) and bka?(n44c193)] در باکتری e. coli bl21 تولید شدند. آنزیم‏های با پپتید انتهای کربوکسیل بیشتر از دو فرم دیگر به محیط کشت ترشح می‏شدند که نشانه‏ای از نقش این قطعه در ترشح آنزیم است که در این مطالعه به تفصیل در مورد آن بحث می‏شود. به علاوه حضور فرم‏های آنزیمی فاقد پپتید نشانه انتهای آمین در محیط کشت ترشح غیر وابسته به پپتید نشانه را نشان می‏دهد که می‏تواند به علت تشکیل ساختار کره مذاب در محیط اسیدی اطراف فسفولیپیدهای غشایی باشد. تشکیل ساختار کره مذاب دو فرم آنزیمی bka?(n44) و bka?(n44c193) در محیط‏های اسیدی با فلورسانس ذاتی، و اتصال ans تایید شد.

als (amyotrophic lateral sclerosis) یک بیماری از بین برنده نورون ها است که نشانه های بالینی آن ضعف پیشرونده عضلانی ، آتروفی ، و اسپاسم است که منعکس کننده انحطاط و مرگ نورون های حرکتی درقشر ، ساقه مغز و طناب نخاعی می باشد. علل مرگ نورون های حرکتی در als هنوز ناشناخته است اما اختلالات میتوکندریایی ممکن است در پاتوژنز این بیماری نقش داشته باشند. بنابراین فعالیت کمپلکس i و نسبت atp/adp در لنفوسیت های این بیماران مورد بررسی قرار گرفت و با افراد سالم مقایسه شد. به علاوه تغییرات توالی ژن sod1 در یک فرد سالم ویک فرد بیمار نیز مورد مقایسه قرار گرفت و مشخص شد که نوکلئوتید شمار در 21ژن فرد مبتلا به als تغییر یافته که باعث تغییر کدون tgc به tgg می شود ودر نتیجه اسیدآمینه cys بهtrp تغییر یافته است و از ناحیه 72 تا 169( یعنی 97 نوکلئوتید) دچار حذف شده است. نکته قابل توجه این است که حذف از ابتدا تا انتهای دومین اگزون رخ داده است. از طرف دیگر فعالیت کمپلکس i (nadh- ferricyanide reductase)و مقدار درون سلولی atpوadp در لنفوسیت های 13 بیمار مبتلا به als و 25 فرد سالم مورد بررسی قرار گرفت. اندازه گیری atp با استفاده از لومینومترو آنزیم لوسیفراز (firefly luciferase) انجام شد واندازه گیری adp دردو مرحله آنزیمی انجام گرفت : (1) فسفوریلاسیون adp به atp توسط پیروات کیناز (2) و سپس اندازه گیری atp کل. در لنفوسیت های بیماران als فعالیت کمپلکس i و نسبت atp/adp در مقایسه با افراد سالم کاهش یافته بود. این مطالعه پیشنهاد می کند که هر گونه نقص در فعالیت کمپلکس i ویا تغییرنسبت atp/adp در سلول میتواند یک عامل مستعد کننده در پیشرفت بیماری als باشد.

لاکازها (بنزن دیول اکسیژن اکسیدوردوکتاز ها، ec 1.10.3.2 ) در خانواده اکسیدازهای چند مسی هستند و در بسیاری از فرآیندهای زیست فناوری از قبیل حذف پلی فنل ها در نوشیدنی ها، رنگزدایی ، آنالیز دارو، ساخت ترکیبات شیمیایی و زیست پالایی ترکیبات فنلی استفاده می شود. فعالیت آنزیم لاکاز جدا شده از bacillus hr03 در اثر تیمار دمایی در 70 درجه سانتی گراد در حضور سوبسترای sgz و abts افزایش پیدا می کند و به موازات آن پارامترهای سینتیکی هم بهبود می یابد. برای کسب اطلاعات بیشتر درباره این ویژگی منحصر به فرد آنزیم، دو نمونه آنزیمی قبل و بعد از تیمار در 70 درجه سانتی گراد با هم مقایسه شدند. مطالعات ساختاری نشان داد در اثر حرارت شکل فضائی (کنفورماسیونی) آنزیم تغییر کرده و فشردگی بیشتری در آن ایجاد م.....

ویژگی برجسته نانوذرات فلزی نجیب، دارا بودن خواص ساختاری، الکترونی، مغناطیسی و کاتالیستی منحصر بفرد و نیز قابلیت تنظیم خواص نوری با ایجاد تغییر در اندازه، شکل، ترکیب، ساختار و ناهمواری های سطحی می باشد. به همین دلیل ساخت هدفمند نانوذرات با شکل قابل کنترل، توجه ویژه محققان امروز را برانگیخته است. با بهره جستن از خواص نوری و گرمایی نانوذرات و ترکیب آن ها با زیست مولکول های گوناگون، می توان در جهت تولید عوامل درمانی غیر تخریبی و توسعه روش های نوین تشخیصی-درمانی گام برداشت. نانوساختارهای میله ای شکل طلا با ریخت شناسی و خواص ویژه خود افق جدیدی به روی کاربردهای نوین پزشکی و پیراپزشکی گشوده اند. هرچند کاربردهای بالقوه پیشنهاد شده برای این نانوساختارهای جالب امیدبخش است؛ اما ممکن است بر اثر جذب سطحی و میان کنش با زیست مولکول ها تغییرات نامطلوبی در ساختارشان پدید آید که پیامد آن، تغییر در میزان فعالیت و عملکرد پروتئین خواهد بود. بنابراین، در کنار طراحی هر گونه سامانه نانویی، انجام مطالعات بنیادین ضروری بنظر می رسد. پژوهش حاضر، با انتخاب یک زیست مولکول الگو به بررسی صورت بندی، فعالیت و پایداری سینتیکی آن پس از میان کنش با دو نوع نانوساختار طلا با طول میله متفاوت می پردازد. طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی، حفظ صورت بندی طبیعی پروتئین لیزوزیم و القای فشردگی ملایم در دومین آلفا و بتای آن را در حضور هر دو نانوساختار نشان می دهد. نتایج مطالعات سینتیکی حاکی از حفظ فعالیت آنزیم پس از جذب سطحی، افزایش تمایل آن نسبت به سوبسترا، و پایداری سینتیکی در دمای بالاست. مطالعات فلوئورسانس ذاتی نیز نشان داد که فرونشانی داخلی کمپلکس آنزیم و نانوساختار در حضور عامل واسرشتگی حفظ شده و پروتئین از پایداری بیشتری برخوردار گردیده است. اطلاعات به دست آمده در این پژوهش، نانومیله های طلا را یک انتخاب مناسب برای طراحی نسل جدیدی از سامانه های حمل ژن، دارو و زیست حسگرها معرفی می نماید.

با توجه به کاربرد فراوان آنزیمهای لیپولیتیک بخصوص لیپاز باکتریایی در صنایع غذایی، دارویی و بهداشتی از یک طرف و قیمت بالای آن از طرف دیگر، جهت رفع مشکل تولید آنزیم لیپاز باکتریایی، تولید این آنزیم از یک منبع در دسترس و ارزان قیمت مورد بررسی قرار گرفته است. به همین منظور سوش جدید pseudomonas aeruginosa hr59 با استفاده از روش مولکولی 16srdna از عفونت سوختگی جداسازی و با شماره بازیابی hq424906 در بانک ژنی به ثبت رسیده است. شرایط کشت این باکتری با استفاده ار روش سطح پاسخ برای چهار فاکتور غلظت کلسیم، غلظت توئین-80، غلظت روغن زیتون و زمان انکوباسیون بهینه سازی شده است. نتایج حاصل از این روش آماری نشان داده است که زمان انکوباسیون بیشترین تاثیر و غلظت روغن زیتون کمترین تاثیر مثبت را بر ترشح آنزیم دارند. در نتیجه اعمال شرایط بهینه شده در محیط کشت باکتری ترشح آنزیم به حداکثر مقدار خود می رسد. در این شرایط فعالیت آنزیم u/ml 36 اندازه گیری شده که به مقدار پیشگویی شده بسیار نزدیک است (u/ml 38). در مرحله بعد فعالیت و پایداری آنزیم در حضور یونهای فلزی دوظرفیتی کلسیم، منیزیوم، روی و آهن و نیز حلالهای آلی متانول، اتانول و پروپانول بررسی شده است. نتایج حاکی از آن است که این لیپاز قادر است در دمای اتاق، ph بین 8.5 تا 10 را تحمل کرده و فعالیت تقریبی u/ml 40 را حفظ کند. فعالیت این آنزیم نسبت به وجود یون فلزی اهن دو ظرفیتی حساس است و فعالیت ان در حضور این آنزیم تقریبا مهار می شود این مساله در مورد یون روی نیز تقریبا صادق است اما وجود یونهای منیزیوم و بخصوص کلسیم می تواند آنزیم را فعال نماید اما این دو یون آنزیم را نسبت به حرارت ناپایدار می کند. به نظر می رسد که علت اصلی تغییر فعالیت انزیم در حضور این افزودنیها، تغییر ساختار آنزیم در محل جایگاه فعال بوده است به این معنی که در این حضور این ترکیبات، دریچه جایگاه فعال برداشته شده و همین امر فعالیت آنزیم را افزایش می دهد.

ایمونوتوکسین ها عوامل فارماکولوژیکی با سموم پروتئینی متصل به یک لیگاند هدف مناسب هستند و به دو صورت شیمیایی و نوترکیب ساخته می شوند. در تحقیق حاضر زنجیره a از سم پروتئینی و گیاهی ریسین که ریبوزوم های یوکاریوتی را غیرفعال می کند توسط دو کراس لینکر مناسب برای تهیه ایمونوتوکسین ها یعنی spdp و smpt به سایتوکین g-csf متصل شده است تا یک ایمونوتوکسین به عنوان دارویی برضد سرطان خون تولید شود. بدین منظور زنجیره a ریسین به صورت نوترکیب در میزبان اشرشیاکلی سویه bl21(de3) بیان شده و توسط کروماتوگرافی تمایلی تخلیص شده است. سایتوکین موردنظر که بصورت تجاری تهیه گردیده، در معرض کراس لینکر 2-it قرار گرفته تا دارای گروه های سولفیدریل اضافی شود و بازده کانژوگاسیون از این طریق افزایش یابد. تمام مراحل کانژوگاسیون در بافر pbs-edta در ph حدود 5/7 انجام شد. نتایج بر روی ژل sds-page مشاهده و با رنگ آمیزی نیترات نقره تشکیل کانژوگه مورد نظر تایید شد. سپس برای تخلیص ایمونوتوکسین ساخته شده از روش خارج کردن باند پروتئینی از ژل و رنگ آمیزی منفی ایمیدازول ـ روی استفاده شد. با توجه به نتایج به دست آمده به نظر می رسد، پیوند دی سولفیدی برگشت پذیر ایجاد شده توسط کراس لینکر smpt دارای پایداری بیشتری نسبت به پیوند دی سولفیدی ایجاد شده توسط کراس لینکر spdp است.

لاکازها (بنزن دیول اکسیژن اکسیدوردوکتاز ها، ec 1.10.3.2) عضوی از خانواده اکسیدازهای چند مسی هستند و به دلیل توانایی اکسید کردن گستره وسیعی از سوبسترا ها می توانند در بسیاری از فرآیندهای زیست فناوری مورد استفاده قرار گیرند. لاکازهای باکتریایی نسبت به لاکاز های قارچی مزیت دارند ولی این لاکازها کمتر مورد بررسی قرار گرفته اند. در این مطالعه خصوصیات سینتیکی و ساختاری آنزیم لاکاز بازتاخورده تعیین شد. از جمله تفاوت های بین آنزیم محلول و بازتاخورده می توان به تفاوت در کارایی کاتالیتیک و ویژگی سوبسترایی اشاره کرد. آنزیم بازتاخورده نسبت به آنزیم محلول در اکسیداسیون دو سوبسترای abts و sgz کاراتر بوده و ویژگی آن برای abts افزایش یافته است. اما پدیده فعال شدن دمایی در آنزیم بازتاخورده وجود ندارد. در این پژوهش هم چنین سعی شده است که نیمه عمر آنزیم لاکاز باکتریایی در دمای بالا با استفاده از روش جهش زایی هدفمند (sdm) افزایش یابد. بدین منظور اسید آمینه asn143 با چهار اسید آمینه دیگر جایگزین شد. فقط خصوصیات یکی از جهش یافته ها یعنی asn143 pro تعیین شد و در سه جهش یافته دیگر میزان بیان بسیار کم بود به گونه ای که به دست آوردن مقدار مورد نیاز پروتئین برای تعیین خصوصیات آن ها میسر نبود. در جهش یافته asn143 pro همان گونه که پیش بینی شده بود پایداری حرارتی نسبت به آنزیم وحشی افزایش پیدا کرد و نیز افزایش تمایل آنزیم به سوبسترا (sgz) دیده شد. در این جهش یافته پایداری شیمیایی با استفاده از اوره بررسی گردید. تغییرات ساختاری به کمک روش های فلورسانس و دو رنگ نمایی حلقوی (cd) مورد مطالعه قرار گرفت.

دراین تحقیق مطالعاتی در مورد تاخوردگی مجدد پروتئین آلفا آمیلازbmw بدون سیگنال انجام شد و در نهایت شرایط تاخوردن پروتئین و فاکتورهای موثر بدست آمده از آزمایشات، توسط نرم افزارexpreimental design نوع 8 بهینه سازی شد. بهترین بازده تاخوردگی مجدد آنزیم با بافر تریس حاوی گلیسرول 20%، کلسیم 25 میلی مولار و غلظت آنزیم 3/0 mg/ml بدست آمد. دراین تحقیق نوع آلفا آمیلازbmw و ویژگی سوبسترایی و محصولات تولید شده توسط آن با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مورد بررسی قرارگرفت. نتایج نشان داد که این آنزیم دارای ویژگی سوبسترایی گسترده می باشد. درصد هیدرولیز سوبستراهای مختلف در مقایسه با هیدرولیز نشاسته در مورد سوبستراهای نشاسته، آمیلوز، آمیلوپکتین و پلولان به ترتیب 100، 130، 69، 26 است علاوه بر این، فعالیت هیدرولازی بر روی آلفا سیکلودکسترین ویژگی سوبسترایی دیگر این آنزیم منحصر به فرد است. به دلیل توانایی در شکستن هر دو پیوند آلفا 4 و1 و آلفا 6 و1 ، اصلی ترین محصول واکنش آنزیمی در مورد تمامی سوبستراها گلوکز می باشد. در ادامه به منظور بررسی در ویژگی سوبسترایی آنزیم مطالعات جهش زایی در ناحیه حفظ شده پنجم انجام شد.. آلفا آمیلازbmw در این ناحیه حفظ شده دارای توالی mpdln می باشد. آنزیم هایی که دارای این توالی هستند دارای ویژگی سوبسترایی گسترده می باشد. علاوه بر این آنزیم های گروه نئوپلولانازی که قادر به هیدرولیز پلولان و آلفا سیکلودکسترین هستند در این ناحیه حفظ شده دارای توالی mpkln می باشند. همچنین آنزیم های گروه الیگو-1و6-گلوگوزیداز در این ناحیه دارای توالی qpdln می باشند. این آنزیم ها توانا به هیدرولیز نشاسته و اولیگوساکاریدهای کوچک وتولید گلوکز هستند. بدین ترتیب جهش های m201q و d203k طراحی شدند و به انجام رسیدند. در مورد هر دو جهش یافته پارامترهای سینتیکی آنزیم هم تحت تأثیر قرار گرفت و ویژگی سوبسترایی آنزیم تغییر کرد.

آنزیم متیل گلی اکسال سنتاز (mgs) (4.2.3.3 ec) واکنش حذفی تبدیل دی هیدروکسی استون فسفات (dhap) را به متیل گلی اکسال انجام می دهد. این آنزیم دارای 6 زیر واحد است که در حضور و عدم حضور فسفات دارای رفتار سینتیکی متفاوتی است و در حضور فسفات، به عنوام مهار کننده آلوستریک، رفتار متعاون از خود نشان می دهد. مقایسه توالی آمینو اسیدی دو آنزیم متیل گلی اکسال سنتاز حاصل از باکتری e.coli با 152 آمینواسید و حاصل از باکتری thermus sp. gh5 با 132 آمینواسید (به ترتیب emgs و tmgs) نشان می دهد که کمبود 10 آمینو اسید انتهای کربوکسی در آنزیم tmgs منجر به نقص یکی از مسیرهای آلوستریکی در این آنزیم شده است. این توالی 10 آمینواسیدی دربردارنده آرژنینی است که جهت برقراری پل نمکی با آمینواسید آسپارتات انتهای آمینی آنزیم در زیر واحد مجاور و در نتیجه برقراری پیام آلوستریک بین زیرواحدها ضروریست. جهت بازبینی نقش این آرژنین، ژن کد کننده آنزیم tmgs به همراه توالی 30 نوکلئوتیدی کد کننده 10 آمینواسید مذکور کلون شد و آنزیم جدید tmgs+ با 142 آمینو اسید مورد مطالعات سینتیکی قرار گرفت. افزایش ضریب هیل از مقدار 5/1 به 99/1 نشان داد که افزایش این دنباله در افزایش تعاونی آنزیم تأثیر گذار بوده است. مطالعات تکمیلی شامل جهش در آسپارتات کونژگه با آرژنین در آنزیم های tmgs و tmgs+ و مقایسه ضریب هیل آنها برقراری پیام آلوستریکی را در tmgs+ تأیید کرد. از طرفی مطالعه ساختار دو بعدی شامل سنجش طیف cd این دو آنزیم افزایش ساختار مارپیچ در tmgs+ را تأیید می کند و طیف فلورسانس و غیرفعال سازی حرارتی برگشت ناپذیر این آنزیم ها نشان می دهد که ساختار tmgs+ تراکم بیشتری نسبت به tmgs دارد. در فاز دوم بررسی نقش قطعه 10 آمینو اسیدی انتهای کربوکسی آنزیم در خاصیت آلوستریکی، آنزیم mgs از باکتری e.coli کلون شد و پارامترهای سینتیکی و ضریب هیل آن مورد سنجش قرار گرفت. ضریب هیل این آنزیم برابر با آنچه در مورد آنزیم tmgs+ بدست آمده بود محاسبه شد که این مسئله تأیید می کند که مسیرهای انتقال اثر آلوستریک همان مسیرهایی هستند که قبلاً گزارش شده بود. در ادامه گونه آنزیمی emgs-?c با حذف قطعه 10 آمینواسیدی از انتهای کربوکسی آنزیم emgs جهت تأیید نهایی مطالعات ساخته شد و انتظار می رفت که ضریب هیل کاهش معنا داری را نشان دهد در حالیکه سنجش های سینتیکی نتیجه غیر منتظره افزایش خاصیت آلوستریکی آنزیم و متعاون شدن در عدم حضور فسفات را برای این آنزیم جدید نشان می دهد.

پروتئاز های خنثی (nps) روی متالوپروتئازهایی با کاربردهای بیوتکنولوژی مثل سنتز پپتید و آسپارتام هستند، اما محدودیت اتولیز در حرارت های بالا را دارند. در این مطالعه ما یک ناحیه ی سطحی الاستاز از سودوموناس آئروجینوزا که به یک یون کلسیم متصل می شود را با ناحیه ی مشابهی در ترمولیزین از باسیلوس استئاروترموفیلوس که به سه یون کلسیم متصل می شود، جایگزین کردیم تا پایداری حرارتی آنزیم را افزایش دهیم. پایداری حرارتی روی متالوپروتئازها با فاکتور t50تعیین می-شود،حرارتی که 30 دقیقه انکوباسیون آنزیم در دماهای مختلف فعالیت آنزیم را به نصف کاهش می دهد. غیر فعال سازی حرارتی در دماهای مختلف 65-c?95 در مورد دو آنزیم وحشی و کایمر مقایسه گردید. بر اساس نتایج، هم t1/2و هم t50به طور قابل توجهی در مورد آنزیم کایمر افزایش یافت. یعنی آنزیمی که t50 آن برابر با 68 بوده است تبدیل به آنزیمی شده است که t50آن در حضور کلسیم حدود 5/93 است و 25 درجه شیفت کرده و آنزیم کاملا پایدارتر شده است. برای بررسی بیشتر پایداری حرارتی، پارامترهای ترمودینامیکی فرآیند غیر فعال شدن شامل انرژی فعال سازی (ea)، ?h#، ?g#و ?s# محاسبه و مقایسه گردید. همچنین در این مطالعه پایداری آنزیم از جنبه های مختلف در حضور یون های فلزی، دترجنت ها، nacl و ph مورد ارزیابی قرار گرفت.در مورد اوره در غلظت های پایین میزان پایداری آنزیم کایمر کمی بیشتر از آنزیم وحشی بود و در مورد sds آنزیم کایمر پایداری بیشتری را نشان داد. در مورد پایداری ph پایداری اندکی تغییر کرده است و کمی افزایش پایداری را در مورد آنزیم کایمر داریم.

متحمل سازی گیاهان زراعی نسبت به علف کش گلیفوسیت از طریق دست ورزی های ژنتیکی یکی از کاراترین روش های موجود در کنترل علف های هرز مزارع محسوب می شود. گلیفوسیت با مهار آنزیم epsps (5-انول پیرویل شیکیمات-3-فسفات سنتاز) در مسیر شیکیمات مانع سنتز اسید های آمینه حلقوی و در نتیجه مرگ گیاه می شود. برای توسعه گیاه با سطح تحمل قابل قبول در مقیاس تجاری، علاوه بر دست ورزی آنزیم epsps، به کار گیری ژن-های مربوط به آنزیم های تجزیه کننده گلیفوسیت نظیر gox (گلیفوسیت اکسیدورداکتاز) نیز ضروری می باشد. این آنزیم علف کش را به ترکیب آمینومتیل فسفونیک اسید (ampa) و گلی اکسالات که اثر کشندگی کمتری برای گیاه دارند تبدیل می کند. این ژن برای اولین بار از باکتری خاک زیochrobactrum antrophi سویه lbaa جدا شده است. در تحقیق حاضر، از خاک های باغات مناطق مختلف ایران با سابقه استفاده از علف کش گلیفوسیت نمونه برداری شده است و با روش های غنی سازی، باکتری هایی که قادر به رشد در محیط حاوی 3 میلی مولار گلیفوسیت به عنوان تنها منبع فسفات بودند، غربال شدند. مسیر تجزیه در باکتری مربوط به جنسochrobactrum با روش hplc مورد بررسی قرار گرفت و ترکیبampa به عنوان ماده حدواسط شناسایی شد. این باکتری می تواند کاندید مناسبی برای تجزیه زیستی گلیفوسیت نیز باشد. لذا، براساس توالی ژن gox ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ncbi، آغازگرهای اختصاصی طراحی گردید و تلاش شد تا با انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز این ژن از باکتری های مذکور جداسازی گردد. با توجه به اینکه محصول تکثیر یافته پس از هم ردیفی با توالی ژن gox همسانی نداشت، لذا، ژن آن به طور مصنوعی ساخته شد. در این راستا، با کمک نرم افزارهای مختلف رایانه ای برای افزایش کارایی بیان ژن در گیاه، رمزهای ژن gox متناسب با گیاه brassica napus l. بهینه سازی گردید. همچنین درصد gc آن کاهش داده شد، عناصر تنظیمی منفی کاهش و توالی های مفید شامل کوزاک برای افزایش دقت ترجمه در آن تعبیه شد. ژن مصنوعی در ناقل بیانی گیاه (pbi121) همسانه سازی شد و برای تراریختی گیاهان کلزا در جهت ارزیابی اثر آن در مقاومت به گلیفوسیت به کار گرفته شد. پس از باززایی گیاهچه های تراریخت شده، نمونه ها در آزمایشگاه با روش کمی رقابتی زنجیره ای پلیمراز(qc-pcr) مورد بررسی قرار گرفتند و تعداد نسخه تراژن در 9 لاین مختلف تراریخت سنجیده شد. مقایسه نتایج بدست آمده با روش دورگه سازی سادرن در حدود 89 درصد شباهت را نشان داد و داده ها تنها برای یک لاین متفاوت بود. همچنین با روش کمی رقابتی rt-pcr، میزان بیان mrna در نه لاین مذکور اندازه گیری شد. نتایج بدست آمده نشان داد که لاین های 4، 7، 9 و 12بیشترین بیان را نشان دادند. در عین حال، بررسی فنوتیپی گیاهان t1 با پاشش گلیفوسیت بر روی گیاهان تراریخت و گیاه تیپ وحشی به عنوان شاهد، انجام شد. نتایج حاصل نشان دادند که گیاهان تراریخت، علف کش گلیفوسیت را تا سطح 5/1 میلی مولار تحمل می-نمایند. گرچه این میزان در حد محصولات تراریخت تجاری شده نیست، ولی بکارگیری این ژن در کنار ژن epsps مقاوم (با جهش های دوگانه) امکان ایجاد مقاومت در حد بالاتری را برای اهداف تجاری سازی کلزای تراریخت فراهم خواهد کرد.

هیدروکربن های نفتی (tphs) از جمله گازوئیل، جزء آلاینده های معمول خاک بوده که می توانند حاوی ترکیبات سمی باشند. زیست پالایی روشی پذیرفته شده برای پاکسازی خاک های آغشته به ترکیبات نفتی می باشد که یکی از انواع آن، گیاه پالایی است. نکته مهم برای موفقیت آمیز بودن پالایش خاک های آلوده به ترکیبات نفتی با روش گیاه پالایی، انتخاب گیاهان مناسب با قابلیت رشد و سازگار شدن با محیط آلوده است. جنس festuca، گیاهی علفی از تیره گرامینه می باشد که به دلیل داشتن ریشه گسترده و عمیق با طبیعت فیبری، موجب ایجاد محیط مناسب برای افزایش تجزیه آلاینده های نفتی می گردد. در این تحقیق، تأثیر خاک آلوده به گازوئیل بر درصد جوانه زنی، مقدار بیومس و آناتومی اندام های رویشی و نیز میزان فعالیت آنزیم های لاکاز و پراکسیداز در اندام های رویشی فستوکا، مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور ابتدا بذر گیاه در خاک آلوده به گازوئیل در غلظت های 10000، 20000 و ppm 30000 در شرایط گلخانه ای کاشته شد. برداشت گیاه در تیمارهای زمانی هفتگی به مدت یک ماه پس از جوانه زنی بذر صورت گرفت و همچنین، بررسی خاک از لحاظ باقیمانده tphs توسط دستگاه gc انجام شد. نتایج نشان دادند که با افزایش آلودگی در خاک، درصد جوانه زنی بذر، رشد طولی و وزن تر اندام های رویشی کاهش می یابد. بر اساس مطالعات سطح برگ، با افزایش آلودگی، پهنای سطح برگ کاهش می یابد اما افزایش در طول کرک و همچنین طول و پهنای روزنه های سطح رویی برگ مشاهده می شود. در ضمن تراکم موم ها در سطح برگ بیشتر شده و به حالت بی نظم در کل سطح برگ پراکنده می گردند. مطالعات ساختاری ریشه به طور کلی، نشان دهنده افزایش قطر ریشه، قطر آوند چوب و آبکش، بیشتر شدن ضخامت لایه اپیدرم، پارانشیم پوست، لایه آندودرم، نوار کاسپاری و دایره محیطیه تحت اثر تیمار آلودگی خاک می باشد. بررسی تغییر فعالیت لاکاز نشان دهنده افزایش معنادار فعالیت آنزیم موجود در ریشه در تیمارهای 10000 و 30000 نسبت به شاهد می باشد. مقدار فعالیت این آنزیم در ریشه فستوکا به مراتب بیشتر از اندام هوایی است اما در اندام هوایی نیز، یک روند افزایشی در فعالیت لاکاز در هر چهار هفته مورد مطالعه دیده می شود. بررسی تغییر فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه، در تمامی هفته ها بیانگر کاهش معنادار فعالیت آنزیم در هر یک از تیمارهای 10000 و 30000 نسبت به شاهد می باشد. اما بررسی تغییر فعالیت این آنزیم در برگ فستوکا در هر چهار هفته، حداقل در بالاترین تیمار نسبت به شاهد افزایش معنادار دارد. سنجش ترکیبات نفتی باقیمانده در خاک پس از مدت زمان معین نشان می دهد که با افزایش شدت آلودگی خاک، درصد پاکسازی خاک کاهش می یابد. اما از طرفی برای یک غلظت مشخص آلاینده، با گذشت زمان درصد پاکسازی خاک بیشتر می شود. به طور کلی می توان نتیجه گرفت که festuca arundinacea با ایجاد تغییراتی در ساختار و فعالیت های آنزیمی خود می تواند آلودگی خاک به گازوئیل را تا غلظت ppm 30000 تحمل کرده و در ضمن به عنوان گزینه مناسبی برای گیاه پالایی مناطق آلوده به ترکیبات نفتی همچون گازوئیل به کار رود.

در این پایان نامه برای نخستین بار سیستم بیولومینسانس گونه فانوس ماهی benthosema pterotum بررسی شد. آزمایشات ما نشان داد که در این گونه یک واکنش آنزیمی وابسته به لوسیفراز در نشر نور دخالت دارد. نتایج سنجش عصاره استخراجی بر روی سلانترازین hcp نشان داد که لوسیفراز سبب اکسایش سلانترازین در واکنش بیولومینسانس می گردد. فراکشن های دارای فعالیت لوسیفراز جمع آوری شده از ستون q-sepharose، تحت شرایط احیایی بر روی ژل 5/12?و 5? sds-page برده شد و پروتئین مورد نظر در محدوده 29 کیلودالتون ظاهر گردید. پارامترهای سینتیکی ـ km و vmax ـ این لوسیفراز نسبت به سلانترازین hcp به ترتیب ?m 4/ 0 و(rlu.s-1) 106 ×2 بدست آمد و در دمای c?40 بیشینه شدت نور آنزیمی مشاهده گردید.

این تحقیق با هدف جداسازی سویه های باکتریایی مقاوم به کروم و امکان سنجی استفاده از آنها در جهت پاکسازی محیط های آلوده به این فلز سرطانزا صورت گرفت. به این منظور نمونه گیری از معادن کروم سبزوار صورت پذیرفت. غربالگری این نمونه ها منجر به جداسازی 20 سویه ی مقاوم به کروم شد. برای شناسایی سویه ها از روش آنالیز مولکولی ژن 16s rdna استفاده شد و سپس این سویه ها در پایگاه ncbi به ثبت رسیدند. از این میان دو سویه به نام های gfcr-6 و ckcr-6a برای ادامه ی تحقیق برگزیده شدند که مقدار mic برای این سویه ها به ترتیب ppm25000 و ppm75000 بدست آمد آنالیز درخت فیلوژنتیکی بدست آمده تشابه بالای این سویه ها را به ترتیب با جنس های .entrobacter sp و alcaligenes sp. نشان داد. ابتدا مکانیسم مقاومت در این سویه ها مورد بررسی قرار گرفت. اسپکتروسکپی ftir نقش گروه های عاملی مختلف موجود بر سطح باکتری همچون گروه های آمین، کربوکسیل و هیدروکسیل را در جذب سطحی کروم، در بعضی از شرایط بکار رفته، نشان داد. از سوی دیگر تکنیک afm نیز تغییر سطح باکتری ها را در اثر جذب کروم تایید کرد. در پایان این بخش فعالیت کرومات ردوکتازی در برخی از شرایط بکار رفته در راستای مطالعات برداشت کروم مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد احیای آنزیمی یکی از مکانیسم های مقاومت در هر دو سویه است. در مرحله ی بعد برداشت یا حذف کروم(vi) توسط این سویه ها مورد مطالعه قرار گرفت. در این راستا در بخش اول حذف کروم در شرایط in vivo مطالعه شد در این بخش نقش پارامترهای مختلف در میزان برداشت کروم بررسی شد. نتایج نشان داد بیشترین برداشت کروم در دمای c°37، ph=7، agitation rate=180 rpm و در حضور %1 گلوکز اتفاق می افتد. در مرحله ی مطالعه ی تاثیر پارامترها بصورت تک متغیره، کارایی حذف ppm50 در زمان 9 ساعت حاصل شد. به منظور بهینه سازی این فرایند از یک طرح ccd متشکل از این چهار پارامتر در پنج سطح استفاده شد. در مدل های بدست آمده ضریب رگرسیون (r) برای سویه های gfcr-6 و ckcr-6a به ترتیب 0.9620 و 0.9626 بدست آمد که قابلیت بالای این مدل ها را در پیش بینی برداشت کروم نشان می دهد. بهینه سازی توانست کارایی برداشت را به میزان 6 برابر یعنی حذف ppm100 در زمان 3 ساعت بهبود ببخشد. در بخش دیگر برداشت کروم در شرایط in vitro، برای حالت ایستا و نفوذ پذیر شده، مورد مطالعه قرار گرفت ابتدا بهترین عامل برای نفوذپذیر کردن سلول ها انتخاب شد سپس سایر پارامترها بررسی شد در رابطه با نقش ph بیشترین برداشت در سویه ی ckcr-6a در ph=3-5 ولی در سویه ی دیگر در ph=6-8 مشاهده شد اما هر دو سویه در دمای c°37 بیشترین برداشت را نشان داد. بیشینه ی برداشت کروم در سویه ی ckcr-6a در 100 rpmولی در سویه ی دیگر 180 rpm اتفاق افتاد. در این بخش دهنده های الکترونی همچون فروکتوز، گلوکز و استات توانست میزان برداشت را به طور قابل توجهی افزایش دهند. میزان برداشت کروم در حضور سایر فلزات هم مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد تنها یون-های فسفات و جیوه می توانند میزان برداشت کروم را کاهش دهند. برای مطالعات آنزیم شناسی این تحقیق سویه ی ckcr-6a انتخاب گردید. نتایج این بخش نشان داد آنزیم کرومات ردوکتاز مربوط به این سویه فعالیت اورانیوم-ردوکتازی نیز دارد علاوه بر این این سویه قادر به بیان آنزیم تلوریت ردوکناز و سلنات ردوکتاز هم می باشد. همه ی این آنزیم ها در شرایط دمای c°37، ph=6-8 در زمان 24 ساعت و حضور یک درصد گلوکز بیشترین تولید را داشتند. در پایان سلول ها با استفاده از اولتراسونیکاسیون لیز شده و عصاره ی سلولی حاصل جدا شد. تخلیص آنزیم-ها با استفاده از دستگاه fplc و در سه مرحه با کمک ستون هایq-sepharose، phenyl –sepharose و نیز ژل فیلتراسیون با کمک ستون g-100 صورت گرفت.

مناطق آلوده به پساب های صنعتی، محیط مناسبی جهت بررسی مکانیسم های منجر به تحمل یا مقاومت در برابر فلزات سنگین و حلال های آلی در سوش های باکتریایی می باشند. این پژوهش در سه بخش با هدف جداسازی و شناسایی سویه ی باکتریایی مقاوم به فلزات سنگین و حلال های آلی، بررسی مکانیسم های مقاومتی سویه و غربال فعالیت آنزیمی صورت گرفت. در این راستا، از خاک و آب در مناطقی که احتمال آلودگی به این آلاینده های سمی می رفت؛ نمونه گیری انجام شد. غربال سویه های مقاوم با استفاده از محیط نوترینت (براث و آگار) و نمک فلزات شامل pb(no3)2، hgcl2، cocl2، cdcl2 و k2cro4 و نیز حلال های آلی تولوئن، گزیلن، بنزن، بوتانول، پروپانول و کلروفرم انجام شد. تعیین mic در حضور فلزات و حلال های مختلف مقاومت بالای سویه ی asm1 نسبت به سایر ایزوله ها را آشکار ساخت؛ به گونه ای که این سویه به ترتیب در حضور غلظت های: 60، 8/0، 4، 5/3 و 9/4 میلی مولار فلزات و 15، 20، 40، 2، 4 و 10 درصد حلال های آلی قادر به رشد بود. شناسایی سویه با روش مولکولی آنالیز ژن 16s rdna نشان داد که سویه بالاترین تشابه را به گونه ها ی b. methylotrpohicus و b. amyloliquefaciens دارد. برای تعیین ساز و کارهای مقاومتی به فلز سنگین راهکارهای متعددی از جمله روش های طیف سنجی و تصویربرداری استفاده شد. سنجش میزان برداشت فلزات سنگین توسط سویه در شرایط in vivo با استفاده از اسپکتروسکپی جذب اتمی نشان داد که حداکثر میزان حذف آلاینده های سرب و کبالت به ترتیب در سرعت هوادهی 100 و 180 دور در دقیقه و دمای ?45 خواهد بود. نتایج حاصل از تکنیک ftir جهت تأیید اتصال فلز به گروه های عاملی سطح سلول نشان داد که گروه هایی مانند هیدروکسیل، آمین، کربوکسیل و فسفات در این اتصال دخیل هستند. همچنین با تکنیک xrd مشخص گردید که در شرایط یکسان، اتصال سرب به گروه های سطحی با ایجاد کریستال های pb6o5(no3)2 همراه است اما اتصال کبالت به سطح به صورت آمورف خواهد بود. از آنجا که سویه ی حاضر به حلال آلی مقاومت نشان داد، غربال فعالیت پروتئازی توسط سویه با استفاده از محیط skm انجام شد. پس از تأیید تولید آنزیم پروتئاز خارج سلولی، بهینه سازی تولید آن انجام شد و نتایج حداکثر تولید آنزیم را در محیط کشت با ترکیب: گلوکز 5/0%، پپتون 75/0%، سولفات منیزیم 7 آبه 5/0%، فسفات دی هیدروژن پتاسیم 5/0% و سولفات آهن 7 آبه 01/0% با 9ph=، 24 ساعت گرماگذاری در دمای ?37، و شیک دورانی 170 دور در دقیقه تأیید کرد. خالص سازی جزئی آنزیم طی دو مرحله: رسوب عصاره ی خارج سلولی با آمونیوم سولفات تا 80 درصد اشباع و سپس ستون q-sepharose انجام شد. تعیین خصوصیات عصاره ی خارج سلولی دارای فعالیت پروتئولیتیکی نشان داد که آنزیم در دمای ?50 و 10ph= حداکثر فعالیت را دارد. پایداری آنزیم در ph و دماهای مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص گردید که آنزیم به ترتیب در محدوده ی دمایی ?55-37 و 11-6ph= به مدت 30 دقیقه پایدار می باشد. نتایج حاصل از بررسی فعالیت و پایداری آنزیم در حضور سورفکتانت ها و حلال های آلی نشان داد که آنزیم در حضور tween 20، ?–mercaptoethanol و حلال های dmso، n-هگزان، متانول و تولوئن بیشترین فعالیت را دارد. گرماگذاری آنزیم در حضور مهارکننده های مختلف مشخص ساخت که فعالیت پروتئولیتیکی در حضور pmsf بطور کامل مهار می شود و به احتمال قوی، آنزیم تولید شده یک سرین پروتئاز می باشد. مطالعات فلورسانس ذاتی حاکی از فشرده شدن ساختار آنزیم در حضور tween 20 و برعکس باز شدن ساختار در حضور گزیلن می باشد.

لاکازها(بنزن دیول اکسیژن اکسیدوردوکتاز ها، ec 1.10.3.2 ) ازجمله پلی فنل اکسیداز ها هستند که توانایی اکسید نمودن تعداد زیادی از ترکیبات فنلیک و استخلاف های امین آنها را دارند . این آنزیم ها از جمله اکسیداز های چند مسی بوده که با استفاده از اکسیژن مولکولی سبب اکسید نمودن ترکیبات آروماتیک و غیر آروماتیک می شوند. مکانیسم کاتالیزی لاکاز به وسیله چهار اتم مس که به سه سایت احیاء کننده متصل است انجام می گیرد (t1, t2, t3). آنزیم لاکاز با توجه به طیف گسترده از سوبستراها و محدوده وسیع از واکنش ها توان بالایی به منظور کاربردهای بیوتکنولوژیکی دارد که از جمله می توان به سم زدایی یا حذف زنوبیوتیک ها، زیست پالایی، تجزیه پلیمرها، تخریب حلقه ها ، اکسید نمودن ترکیبات غیر قابل تجزیه در محیط و معدنی نمودن و سپس حذف ترکیبات چند حلقه ای آروماتیک از محیط اشاره نمود. تمامی آنزیم های اکسیدوردکتاز به کوفاکتور وابسته اند در حالیکه این آنزیم بدون نیاز به این ترکیبات انتقال الکترون را کاتالیز می نماید. بر اساس مطالعات انجام گرفته برروی آنزیم لاکاز وحشی و انواع جهش یافته جدا شده از باکتریbacillus sp. hr03 ، اثر تعویض اسید های آمینه برروی فعالیت و پایداری این آنزیم در حضور حلال های آلی مورد بررسی قرار گرفت. در بخش ابتدایی این تحقیق جهش هایی در ناحیه لوپ سطحی بین دمین 1و2 که پایداری حرارتی آنها اثبات گردیده بود انتخاب و فعالیت – پایداری آنها در حضور حلال های آلی مورد بررسی قرار گرفت. سپس جهش های دیگری در ناحیه سطحی، که براساس نرم افزار های بیوانفورماتیکی پیشگویی گردیده بود، انتخاب و پایداری حلالی آنها ارزیابی شد. جهت افزایش پایداری در حضور حلال های آلی از تکنیک جهش زایی هدفمند (sdm) بهره گیری شد. خصوصیات بیوشیمیایی هر آنزیم پس از خالص سازی با بهره گیری از سوبسترای احیایی abts بررسی شد. غیرفعال شدن برگشت ناپذیر، میزان c50 (تراکمی از حلال آلی که %50 از فعالیت آنزیم باقی می ماند)، ??g‡ ( تغییردر انرژی پایدارسازی حالت گذار) و پارامتر های سینتیکی آنزیم وحشی و انواع جهش یافته در حضور حلال های آلی مختلف (متانل، اتانل، 1-پروپانل، دی متیل سولفوکساید و دی متیل فرمامید) محاسبه گردید.. نتایج نشان از افزایش پایداری حرارتی و نیز پایداری حلالی آنزیم با تعویض اسید های آمینه سطحی باردار با انواع غیر باردار دارد، همچنین پایداری حلالی به طور مستقیم با پایداری حرارتی ارتباط دارد.

برای اولین بار یک لوسیفراز جدید از گونه benthosema pterotum ،از بندر جاسک در نزدیکی خلیج فارس جمع آوری شد، توسط روش کروماتوگرافی تعویض یونی و با استفاده از رزین q- سفارز تخلیص شد. وزن ملکولی پروتئین با استفاده از روش sds- page در حدود kda 27 و مقدار km برابر با m? 4/0 بود، هر دو این مقادیر مشابه دیگر کولنترازین لوسیفرازها بود. آنزیم bp luciferase بیشینه نشر نور را در دمای co 40، بافر mm tris- hcl ph 9 20 و غلظت mm mg2+ 20 نشان می داد. اندازه گیری های تجربی نشان داد که bp luciferase یک آنزیم نسبتا" پایدار به حرارت بوده و در ph های بحرانی فعالیت باقی مانده بالایی داشت. فعالیت آنزیم به شدت در غلظت mm 1 از یون های cu2+، zn2+ و ni2+ مهار می شد در حالی که کلسیم و به ویژه منیزیم به شدت فعالیت آنزیم را افزایش می دادند. همانند سایر کولنترازین لوسیفرازها، آنزیم bp luciferase نور آبی از خود نشر می کرد، ?max محاسبه شده برای آنزیم nm 475 بود. دیگر پارامترهای اندازه گیری شده برای این آنزیم متفاوت از سایر کولنترازین لوسیفرازهای شناخته شده بود که تایید می کرد پروتئین جدیدی خالص شده است. در این پژوهش همچنین cdna ژن آنزیم bp luciferase کلون و تعیین سکانس شد. cdna یک قطعه bp 666 بود که توانایی کد کردن پلی پپتیدی با 222 آمینواسید و وزن ملکولی در حدود kda 24 را داشت. ویژگی های لومینسانس پروتئین نوترکیب در مقایسه با آنزیم native کاهش یافته بود. به نظر می رسد پروتئین بیان شده بخشی از زیر واحد کاتالیتیک آنزیم bp luciferase باشد اما به دلیل این که کل ژن این آنزیم کلون نشده، بیان پروتئین کامل نیست. این امر می تواند دلیل فعالیت کمتر پروتئین نوترکیب در مقایسه با پروتئین native استخراج شده از بافت های فوتوژنیک باشد.

آنزیم های آمیلاز حد واسط ( اغلب در زیر خانواده gh13-36 دسته بندی شده اند) که دارای توالی mpdln در ناحیه حفظ شده پنجم می باشند با مخلوطی از ویژگی های آنزیمی آلفا آمیلاز و زیر خانواده های آنزیمی الیگو-6،1-گلوکزیداز و نئوپلولاناز (مثل هیدرولیز سیکلودکسترین یا ترانس گلیکوزیلاسیون) شناخته می شوند. از آنجا که این آنزیم ها می توانند بر رنج وسیعی از سوبستراها اثر کنند دارای کاربردهای وسیعی در صنایع نشاسته هستند. آنزیم bmw آمیلاز پیش از این به دلیل توانایی اش در هیدرولیز پلولان و نشاسته از باکتری باسیلوس who جدا شده و با توجه به توالی ناحیه حفظ شده پنجم جزو آنزیم های گروه حد واسط قرار گرفته بود. با بررسی فعالیت آنزیم مشخص شد که آنزیم توانایی هیدرولیز نشاسته، آمیلوز، آمیلوپکتین،پلولان و سیکلودکسترین را دارد. کارایی کاتالیتیکی آنزیم برای سوبستراهای نشاسته، آمیلوز و آمیلوپکتین تقریباً 5/5 برابر بیشتر از پلولان بدست آمد. بررسی های hplc نشان داد که آنزیم منحصر به فرد bmw آمیلاز از هیدرولیز تمام سوبستراهای فوق گلوکز را به عنوان محصول اصلی و عمده تولید می کند. از طرفی آنزیم توانایی تولید گلوکز از مالتوز را طی فرآیند ترانس گلیکوزیلاسیون دارد. آنالیز hplc نشان داد که bmw- آمیلاز یک آنزیم حد واسط جدید است که از هیدرولیز سوبستراهای فوق فقط گلوکز ایجاد می کند. در ناحیه حفظ شده ششم (83-qvngiwmmp) همانند زیر خانواده الیگو-6،1- گلوکزیدازها، یک اسید آمینه تریپتوفان بسیار حفظ شده وجود دارد که در زیر خانواده نئوپلولانازها با اسید آمینه تایروزین جایگزین شده است. در این مطالعه به منظور بررسی نقش این اسید آمینه در ویژگی سوبسترایی آنزیم جهش w88y انجام شد. ویژگی سوبسترایی آنزیم برای سوبستراهای نشاسته، پلولان، آمیلوز و آمیلوپکتین تعیین شد. پایداری حرارتی و کارآیی کاتالیتیک آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم وحشی افزایش پیدا کردند در حالی که تغییری در محصول ایجاد شده بوجود نیامد. همانطور که انتظار می رفت فعالیت نئوپلولانازی آنزیم افزایش یافت. توالی کوتاه qpdln، mpkln، mpdln در ناحیه حفظ شده پنجم به ترتیب به عنوان تعیین کننده زیر خانواده های الیگو-6،1- گلوکزیداز، نئوپلولاناز و زیر خانواده آنزیم های حد واسط به کار می رود. توالی ناحیه حفظ شده پنجم در مورد bmw- آمیلاز به صورت 201-mpdln است. ارتباط بین این توالی و ویژگی سوبسترایی آنزیم نیز بررسی شد. آسپارتات 203 با استفاده از روش sdm به لیزین، گلوتامات، والین و آلانین تبدیل شد. جهش های d203a و d203v باعث غیر فعال شدن آنزیم شدند. جهش یافته های d203e و d203k توانایی هیدرولیز پلولان را از دست دادند در حالی که همچنان بر سایر سوبستراها اثر می کردند. بررسی محصولات تولید شده با tlc نشان داد که تغییری در محصول تولیدی ایجاد نشد. در ادامه به منظور بررسی نقش هم زمان جهش در دو ناحیه پنجم و ششم، جهش های دوتایی انجام شد. جهش یافته های d203a، w88y و d203v و w88y همچنان غیر فعال بودند در حالی که جهش یافته های d203k، w88y و d203e، w88y توانایی هیدرولیز پلولان را مجدداً بدست آوردند. در مورد این جهش ها نیز همچنان گلوکز به عنوان محصول اصلی تولید می شد.

لاکازها (1.10.3.2 ec؛ پارا دی فنول دی اکسیژن اکسیدوردوکتاز) بدلیل قابلیت اکسیداسیون طیف گسترده¬ای از ترکیبات فنولی کاربردهای زیادی در صنایع بیوتکنولوژی دارند. محدود بودن دامنه اطلاعاتی در ارتباط با ساختار و عملکرد لاکازها، آنزیم اخیر را کاندیدای مناسبی جهت راهکارهای مهندسی پروتئین معرفی می نماید. در این مطالعه، آنزیم لاکاز جدا شده از bacillus hr03 که علاوه بر توانایی لاکازی و تیروزینازی دارای خاصیت بیلی روبین اکسیدازی نیز می باشد، مورد استفاده قرار گرفت. محدودیت کاربری های این آنزیم متاثر از بیان پایین آن در میزبان اشریشیا کولی است. جهت ارزیابی وبهبود بیان موثر، کارایی و پایداری آنزیم، جهش های d500g, d500a, d500s d500l, d500e و glycine insertion در جایگاه asp 500 واقع در انتهای کربوکسیل لوپ متصل شونده به مس نوع 1 و به روش جهش زایی هدفدار صورت گرفت. در جایگزینی آسپارتیک اسید با باقیمانده ی گلایسین که دارای حداقل ممانعت فضایی است، فعالیت ویژه حداکثری مشاهده شد. در جهش یافته اخیر، کارایی کاتالتیک به میزان حدود 2/3 برابر به همراه افزایش بیان به میزان حدود 3 برابر، افزایش فعالیت حدود 7/3 برابری را موجب می گردد. جایگزینی آسپارتیک اسید با گلوتامیک اسید و لوسین باعث افزایش نیمه عمر آنزیم در دمای بالا می شود. علاوه بر مطالعات ترمودینامیکی، پارامترهای سینتیکی در حضور سوبستراهای 2, 2′-azino-bis (3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid))) ((abts، syringaldazine (sgz) و بیلی روبین انجام گرفت و ویژگی سوبسترایی در میان جهش یافته ها مشاهده نشد. پایداری و تغییرات ساختاری به کمک روش های سینتیکی، فلورسانس و دو رنگ نمایی حلقوی (cd) نیز مورد مطالعه قرار گرفت.

ترکیبات فنلی که به طور مرتب در نتیجه فعالیت های شهری و صنعتی تولید می شوند می توانند در اثر فعالیت آنزیمهایی مانند لاکازها به طور کامل سمزدایی شده یا به ترکیباتی با سمیت کمتر زیست پالایی شوند. هدف از تحقیق حاضر بیان القایی آنزیم لاکاز تنها در صورت مواجهه با ترکیبات آلاینده و سپس نمایش سطحی این آنزیم بر سطح سلولهای e. coli است تا دسترسی مناسبی میان آنزیم و سوبسترا به وجود آید. فاکتور فعال کننده رونویسی capr قادر است پروموتر القا شونده po را در حضور آلودگیها راه اندازی کند. در این مطالعه ژن لاکاز مقاوم به حرارت به سیستم نمایش سطحی aida-i متصل شده و پایین دست پروموتر po قرار داده شده است. نتایج نشان می دهد که در حضور غلظتهای مختلف فنل بیان لاکاز انجام می شود. همچنین وسترن بلات حضور آنزیم لاکاز تنها در غشای خارجی را تایید نمود. فعالیت آنزیم بر روی سطح سلولها نیز مورد سنجش قرار گرفت تا تاخوردگی صحیح آنزیم پس از عبور از خلال غشا بررسی شود. لاکاز نمایش داده شده بر روی سطح قادر به اکسیداسیون سوبسترای syringaldazin (sgz) و فنل موجود در محیط کشت می باشد. نتایج آزمون hplc نشان دهنده کاهش چشمگیر میزان فنل موجود در محیط کشت سلولهایی است که لاکاز را بر سطح خود نمایش داده اند.

آنزیم متیل¬گلی¬اکسال¬سنتاز واکنش تبدیل دی¬هیدروکسی¬استون¬فسفات را به متیل¬گلی¬اکسال انجام می-دهد. این آنزیم هموهگزامر بوده و فسفات مهار¬کننده آلوستریک آن می¬باشد. این آنزیم اولین¬بار از باکتری اشرشیاکلی جداسازی و مطالعه شده است. بررسی ساختار کریستال mgs اشرشیاکلی نشان می¬دهد که پل¬نمکی ایجاد شده بین آسپارتیک¬اسید20 با آرژنین150 در حضور فسفات، در انتقال تغییرات آلوستریکی در آنزیم نقش دارد. اخیرا" ژن سازنده mgs از باکتری thermus sp. gh5(tmgs)، کلون و ساختار کریستال آن نیز مطالعه شده است. مطالعات نشان می¬دهند که این آنزیم 132 آمینو¬اسیدی در مقایسه با آنزیم اشرشیاکلی، بطور طبیعی فاقد 10 آمینو¬اسید در دو انتهایn و c است. مقایسه ضریب هیل emgs و tmgs نشان می¬دهد که نبود آرژینین150 در tmgs باعث کاهش در تعاونی بین زیر¬واحدها در حضور فسفات شده است. در این پژوهش 10 باقیمانده آمینو¬اسیدی از انتهای کربوکسی آنزیم مزوفیل (emgs-δc) حذف گردید. سنجش¬های سینتیکی نشان¬دهنده ایجاد خاصیت آلوستریکی در عدم حضور فسفات، برای جهش یافتهemgs-δc بود. مقایسه ساختار و پایداری حرارتی این دو آنزیم نشان داد که ساختار emgs-δc در مقایسه با emgs وحشی بازتر شده است. همچنین در این تحقیق ساختار- فعالیت و پایداری emgs با tmgs مقایسه شد. برای بررسی اثر میانکنش بین هیستیدین-هیستیدین بر پایداری حرارتی و ساختار tmgs، دو جهش¬یافته بوجود آمد که در یکی از آنها یک (tmgs-hho) و در دیگری دو هیستیدین (tmgs-hhho) بین آرژنین22 و هیستیدین23 (ho) قرار داده شدند. مطالعات پایداری حرارتی و ساختاری نشان داد که پایداری tmgs-hho در مقایسه با آنزیم وحشی افزایش یافته ولی پایداری tmgs-hhho کمتر شده است. برای بررسی نقش هیستیدین23 در پایداری tmgs، ho در جهش یافته tmgs-hhho به آلانین تبدیل شد (tmgs-hha). پایداری این آنزیم نسبت به آنزیم وحشی کاهش و در مقایسه با tmgs-hhho افزایش یافت که نشان می¬دهد میانکنش هیستیدین-هیستیدین در جایگاه 23 احتمالا نقش مهم در پایداری tmgs دارد.

سواحل خلیج ¬فارس و اقیانوس هند به عنوان اولین مناطق صید صدف مرواریدساز در دنیا شناخته شده است. صدف مروارید¬ساز محار (pinctada radiata) به عنوان یک گونه بومی در منطقه است که در سال¬های اخیر کاهش جمعیت، اندازه و شکننده شدن پوسته آن گزارش شده است. از آنجا که فلزات سنگین با تاثیر بر فعالیت آنزیم¬ها می توانند روی پروسه بیومینرالیزاسیون اثر گذار باشند لذا ابتدا پنج ایستگاه بوشهر، خارک، نخیلو، هندورابی و کیش جهت نمونه¬برداری تعیین گردید و فلزات روی، منگنز، مس، کادمیوم و سرب در بافتهای مانتل، آبشش و ماهیچه صدف¬های صید شده، اندازه¬گیری گردید و سپس فعالیت آنزیم¬های آنتی¬اکسیدانی (سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون اس ترانسفراز)، آلکالین فسفاتاز، آنزیم¬های تنظیم¬یونی (ca2+atpase و na+k+-atpase) و آنزیم¬های بیومینرالیزاسیون (کربنیک انهیدراز و تیروزیناز) سنجش گردید. همچنین در شرایط آزمایشگاهی صدف¬های مروارید¬ساز محار تحت تیمار با فلزات cd و pb قرار گرفتند و سپس فلزات، فعالیت آنزیم-های ذکر شده و بیان نیمه کمی ژن های گلوتاتیون اس ترانسفراز و کربنیک انهیدراز نیز در بافت¬های مانتل، برانش و ماهیچه سنجش گردید. نتایج تجمع فلزات نشان داد که بیشترین تجمع zn و mn در بافت آبشش بود. تجمع zn در نمونه های جزیره کیش و خارک و تجمع mn در نمونه های بوشهر و نخیلو بالاتر بود. ماهیچه نیز بیشترین تجمع cd و pb را در خود داشت. بالاترین تجمع cd در جزیره هندورابی و بیشترین تجمع pb در بندر نخیلو و سپس خارک اندازه¬گیری گردید. همچنین تجمع بالای pb در پوسته¬های نمونه¬های خارک و نخیلو دیده شد. نتایج فعالیت آنزیم¬ها در صدف¬های مروارید ساز محار نشان داد که با بالا رفتن تجمع cd، فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافت اما در نمونه¬های هندورابی به دلیل تجمع بسیار زیاد cd، فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز کمتر بود. کاهش در فعالیت آنزیم کاتالاز نیز با افزایش میزان cd مشاهده گردید. همچنین فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس ترانسفراز نیز با افزایش تجمع cd در ماهیچه کاهش نشان داد. فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز با تجمع pb همبستگی مثبت داشت در حالیکه با تجمع cd همبستگی منفی داشت. کاهش در فعالیت آنزیم¬های ca2+ atpase و na+ k+-atpase با افزایش تجمع cd و pb مشاهده گردید. نتایج سنجش فعالیت آنزیم کربنیک انهیدراز، نشان¬دهنده همبستگی منفی فعالیت این آنزیم با تجمع فلزات pb و cd بود. نتایج بیان ژن¬های گلوتاتیون اس¬ترانسفراز و کربنیک انهیدراز نشان دهنده افزایش بیان آنها در چهار روز پس از در معرض قرار گرفتن با فلزات cd و pb در شرایط آزمایشگاهی بود. لذا با توجه به نتایج، فلزات سنگین به عنوان یکی از آلودگی¬های مهم در خلیج¬فارس می¬توانند با ایجاد اختلال در فعالیت آنزیم¬های موثر در فرایند تولید پوسته، مروارید و لایه نیکر، روی رشد و کاهش جمعیت صدف مرواریدساز محار نقش مهمی داشته باشند.

فرآیند ترمیم در سیستم عصبی، پیچیده بوده و چالشی بزرگ برای محققان می باشد. رویکرد مهندسی بافت با استفاده از ترکیب سلول های بنیادی و داربست های نانوفیبری علاقه ی جامعه ی تحقیق را برای کاربردهای بازسازی بافت عصبی به خود جلب کرده است. هدف از تحقیق حاضر، مطالعه ی پتانسیل تمایزی سلول های بنیادی پرتوان القایی انسانی (hipscs) به دودمان های عصبی بر روی داربست های پلی اترسولفون (pes)، pes پلاسما شده و pes پیوند شده با لامینین دار، در شرایط برون تن می باشد. کارآیی پایین تمایزی پروتوکل های متعدد، محققان را به طراحی پروتوکل های جدید برای تمایز با بازده بالا برمی انگیزد. در ابتدا، ما پتانسیل تمایز عصبی سه محیط القایی متفاوت را برای تبدیل hipscs به رده های نورونی، مقایسه کردیم. در این بخش، اجسام جنینی (eb) به دست آمده از hipscs، بر روی پلیت های پوشیده شده با ژلاتین، کشت داده شدند و در معرض سه محیط القایی شامل 1) bfgf، egf 2) رتینوئیک اسید (ra) و 3) forskolin، ibmx قرار گرفتند. آنالیز ایمنوسیتوشیمی (icc) و quantitative real-time pcr (qpcr) برای تعیین بیان پروتئین ها و ژن های نورونی استفاده شدند. آنالیز qpcr نشان داد که بیان ژن های نورونی در hipscs تمایز یافته در محیط forskolin و ibmx، به طور قابل توجهی بالاتر از سلول های تمایز نیافته و سلول های در معرض محیط های القایی bfgf، egf و ra بود. نتایج به دست آمده، پروتکلی موفق با کارآیی بالا را برای تمایز hipscs به دودمان های عصبی معرفی کرد. در بخش دوم، تمایز نورونی hipscs بر روی pes، pes پلاسما شده و pes پیوند شده با لامینین دار با الیاف موازی و نامنظم در محیط القایی forskolin بررسی شد. نتایج icc، بیان مارکرهای پروتئینی شامل ?-tubulin iii،map-2 و nse را در سه گروه داربست های مذکور نشان داد اما نتایج qpcr، افزایش بیان ژن های ویژه ی نورونی را در نانوداربست های pes موازی در مقایسه با انواع نامنظم، pes پلاسما شده در مقایسه با انواع پلاسما نشده و pes پیوند شده با لامینین دار در مقایسه با انواع اصلاح سطحی نشده، نشان داد. از آنجایی که نتایج mtt، زیست سازگاری نانوفیبرهای الکتروریسی شده pes را تأیید می کند، کاربرد نانو داربست های اصلاح شده ی مذکور در مهندسی بافت در شرایط درون تن در آینده، امیدبخش است.

لاکازها آنزیم های چند مسی متعلق به گروه اکسیداز های آبی اند. سوبستراهای مختلف (برای مثال فنول ها و ترکیبات آروماتیک یا آمین های آلیفاتیک) را اکسید کرده و اکسیژن مولکولی را به عنوان پذیرنده نهایی الکترون استفاده می کنند. در این پژوهش ژن لاکاز از باکتری bacillus .anthracis سویه qza2 تکثیر و سپس در ناقل بیانی کلون و به باکتری e.coli انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت. ژن لاکاز جدا شده از سویه qza2 دارای 16% شباهت آمینواسیدی به پروتئین cota از باسیلوس سوبتیلیس و57% شباهت به لاکاز باسیلوس هالودورانت می باشد. بمنظور به دست آوردن پروتئین فعال، بیان تحت شرایط هوازی و در دمای پایین انجام گرفت. پروتئین نوترکیب بوسیله ستون تمایلی تخلیص و جرم مولکولی آنزیم تعیین گردید. تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم با استفاده از سوبسترای معمول لاکاز ¬¬2,2?-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid) (abts) انجام گرفت. آنزیم دردمایc?55 بهترین فعالیت را دارد. در مطالعات سینتیکی km و kcat این آنزیم برای abts¬µm 111 و s-1 130 تعیین گردید. یون کلراید اثر مهار کنندگی شدیدی بر روی آنزیم دارد. ph بهینه فعالیت آنزیم 2 میباشد. این خصوصیت غیر معمول آن را نسبت به سایر لاکازهای باکتریایی شناخته شده متمایز می کند. پایداری حرارتی و اثر یون های فلزی مختلف بر فعالیت آنزیم نیز بررسی شد.

آنزیم متیل گلی اکسال سنتاز ترموفیل اولین بار ازگونه ی باکتریای thermus sp.gh5 (tmgs) جدا سازی و تعیین ساختار شد. این آنزیم به طور اختصاصی تبدیل دی هیدروکسی استن فسفات به متیل گلی اکسال و ارتوفسفات را کاتالیز میکند و مسیر گلیکولیز را از جهت اصلی خود منحرف میسازد. tmgsبه صورت هموهگزامر بوده و فسفات مهار کننده ی قوی و افکتور آلوستریک منفی آن است. پس از اتصال فسفات به جایگاه افکتور، دو نوع از تغیرات ساختاری در آنزیم مشاهده میشود. تغییرات ساختاری عمده در اطراف جایگاه فعال آنزیم منجر به بسته شدن کانال ورودی سوبسترا به سمت جایگاه فعال میشود و سبب تغییر کنفورماسیون آنزیم از شکل باز(عدم حضور فسفات) به شکل بسته (در حضور فسفات) میشود. همچنین تغییرات ثانویه ایجاد شده در الگوی میانکنش های بین زیرواحد ها منجربه انتقال پیام آلوستری در آنزیم میشود. با اتصال فسفات به آنزیم میانکنش جدیدی بین باقیمانده های آسپارتات 100 و آرژنین 80 ایجاد میشود که امکان دخیل بودن آنها در مسیر انتقال اطلاعات آلوستری در حضور مهار کننده وجود دارد. جهت بررسی این فرضیه باقیمانده های آسپارتات 100و آرژنین 80 بوسیله جهش زایی هدف دار تغییر داده شد و خصوصیات سینتیکی، رفتار آلوستری، تغییرات ساختاری و میزان پایداری این آنزیم اولیگومر جهش یافته مورد بررسی قرار گرفت. بررسی آنزیم های جهش یافته نشان داد که در اثر تخریب پل نمکی بین اسید آمینه های آسپارتات 100 و آرژنین 80 خصوصیت آلوستریکی در آنزیم به شدت کاهش پیدا می کند که این موضوع میتواند نقش این اسید های آمینه در انتقال پیام میان زیرواحدهای آنزیمی را آشکار کند.

لاکازها (بنزن دیول اکسیژن اکسیدوردوکتاز¬ها، ec 1.10.3.2) عضوی از خانواده اکسیدازهای چند مسی هستند و به دلیل توانایی اکسید کردن گستره وسیعی از سوبسترا¬ها می¬توانند در بسیاری از فرآیندهای زیست ¬فناوری مورد استفاده قرار گیرند. لاکازهای باکتریایی نسبت به لاکاز¬های قارچی مزیت دارند ولی این لاکازها کمتر مورد بررسی قرار گرفته¬اند. پایداری ترمودینامیکی و سینتیکی آنزیم لاکاز وحشی و جهش¬یافته¬های آن مورد بررسی قرار گرفت. لاکازهای جهش¬یافته در تعدادی از خصوصیات نظیر ساختار و پایداری حرارتی متفاوت هستند. تعدادی از جهش¬یافته¬ها پایداری حرارتی بالاتری در دمای 80 درجه سانتی¬گراد داشتند. از بین جهش¬یافته¬ها t415i پایداری حرارتی بالاتری رانشان داد. این جهش¬یافته هم چنین کارایی کاتالیتیکی بالاتری نشان داده است. هدف دیگر این پژوهش مطالعه ساختار جهش¬یافته¬ها بود. مطالعات ساختاری با تکنیک¬های فلورسانس و دورنگ¬نمایی دورانی انجام شد. مشاهده شد که تمامی جهش¬یافته¬ها طیف دورنگ¬نمایی متفاوتی داشتند. هم چنین نشر فلورسانس تغییر کرده است.

در این آزمایش اثر ترکیبی مقادیر مختلف اسیدهای چرب ضروری امگا 3 hufa (dha, c22:6n-3 و epa, c20:5n-3) و آلفا-توکوفرول جیره بر رشد، ترکیب اسیدهای چرب، پارامترهای هماتولوژی، ایمنی غیراختصاصی، وضعیت آنتی¬اکسیدانی و ساختار دستگاه گوارش بچه ماهی نورس آزاد دریای خزر (salmo trutta caspius) بررسی شد. شش جیره حاوی سه نسبت مختلف اسیدهای چرب امگا 3dha به epa به ترتیب 1 به 5/0 (پایین)، 2 به 1 (متوسط) و 4 به 2 (بالا) در 100 گرم جیره و هر یک از این مقادیر با یکی از سطوح 300 (پایین) و 1000 (بالا) میلیگرم ویتامین e (آلفا-توکوفرول استات) در کیلوگرم جیره تهیه و به ترتیب ll، lh، ml، mh،hl و ¬-hh نامگذاری شد. بچه ماهیان نورس با میانگین وزن اولیه 25 ± 600 (میلی¬گرم) بطور تصادفی در تانک¬های پرورشی تقسیم شدند و به مدت 10 هفته با هر یک از جیره¬ها تغذیه شدند. نتایج نشان داد نرخ رشد ویژه و میانگین وزن نهایی به طور معنی¬داری در تیمار mh نسبت به سایر تیمارها بالاتر است (p<0.05). ترکیب اسیدهای چرب قطبی و خنثی بدن بچه ماهیان ارتباط مستقیمی با ترکیب جیره داشت. پارامترهای بیوشیمی خونی، به ویژه چربی-ها و لیپوپروتئین¬های پلاسما به میزان بیشتری تحت تاثیر اسیدهای چرب امگا 3 hufaجیره قرار گرفتند و ویتامین e و اثر متقابل ویتامین e و اسیدهای چرب تاثیر کمتری داشتند. در همه تیمارهای امگا 3 hufa افزایش ویتامین e موجب افزایش معنی¬دار فعالیت کمپلمان (ach50) گردید (p<0.05). در بچه ماهیان تغذیه شده با سطح متوسط و بالای امگا 3 hufa فعالیت لایزوزیم پلاسمای بیشتری داشتند و تیمار ml بالاترین فعالیت لایزوزیم را نشان داد. علاوه بر این میزان پروستاگلاندین e2 در سطوح متوسط و بالای اسیدهای چرب کاهش یافت و اثر ویتامین e و امگا 3 hufa تاثیر معنی¬داری نشان نداد. تفاوت¬های مشاهده شده در فعالیت آنزیم¬های آنتی¬اکسیدانی (کاتالاز، سوپراکسیداز دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون-s-ترنسفراز) تیمارهای مختلف معنی¬دار و در تیمارهای با سطح بالای امگا 3 hufa بالاتر بود. در تیمارهای ml و hl محصولات ثانویه اکسیداسیون به طور معنی¬داری بالاتر بود (p<0.05). مشاهدات میکروسکوپی ساختار کبد و روده ابتدایی بچه ماهیان هیچگونه شواهدی در خصوص بروز آسیب¬ها و یا تغیرات بافتی معنی¬داری نشان نداد. 7 روز پس از انتقال بچه ماهیان به آب شور تغیرات چندانی در غلظت الکترولیت¬ها و کورتیزول ایجاد نشد، با این حال گلوکز پلاسما در سطح پایین اسیدهای چرب epa و dha قبل و بعد از استرس تفاوت معنی¬داری نشان داد. بطور کلی نتایج این بررسی نشان داد هنگامیکه سطح مناسبی از ?-توکوفرول در جیره وجود داشته باشد، افزایش امگا 3 hufa می-تواند عملکرد رشد و پاسخ ایمنی غیر اختصاصی بچه ماهی آزاد خزر را بهبود دهد.

?- آمیلاز bacillus licheniformis (bla)، به عنوان همتای ترموفیل ?- آمیلازbacillus amyloliquefaciens (baa)، مدلی مناسب برای طراحی جهش های پایدار کننده در baa است. bla، علی رغم 80 درصد یکسانی در توالی اسید آمینه ای، ده باقیمانده هیستیدین بیش از baa دارد. با توجه به این تفاوت برجسته، در تحقیق حاضر سه مورد از این موقعیت ها در baa (i34، q67 و p407) با هیستیدین جایگزین شدند. نتایج نشان داد که پایداری حرارتی جهش یافته های p407h و q67h افزایش یافته است، اما تغییرات معناداری در پارامترهای سینتیکی آنها نسبت به آنزیم وحشی مشاهده نشد. جهش i34h باعث از دست رفتن کامل فعالیت آنزیمی شد. این نتایج با نتایج حاصل از مطالعات دورنگ نمایی دورانی، فلورسانس و ترمودینامیک سازگاری نشان دادند. با توجه به اینکه جهش p407h نیمه عمر baa در c? 75 را تقریباً یک ساعت افزایش داد، به کمک مطالعات جهش زایی بیشتر، نقش هیستیدین در این جایگاه را مورد بررسی قرار دادیم. مدل ساختاری baa در محل جهش p407h نشان داد که جایگزینی p407 با هیستیدین باعث قرارگیری دو هیستیدین در مجاورت یکدیگر می شود. جهت بررسی نقش هیستیدین در این جایگاه، p407 بطور جداگانه با چهار نوع اسید آمینه دیگر (ala، glu، arg و gln) جایگزین شد. بعلاوه جهت بررسی جفت شدگی هیستیدین-هیستیدین، دو جهش همزمان (p407h/h406a و p407h/h406n) نیز ایجاد گردید. نتایج نشان داد که سایر جایگزینی ها در این جایگاه اثر معناداری بر ویژگی های آنزیمی نداشت، به استثنای جهش p407r که منجر به بهبود جزئی پایداری حرارتی شد. این امر نشان می دهد که حضور یک اسید آمینه کاتیونی در جایگاه 407 اثر مثبتی بر پایداری حرارتی دارد. پایداری حرارتی جهش یافته های دوگانه نیز در مقایسه با جهش یافته p407h بطور معناداری کاهش یافت. علاوه بر این، پایداری حرارتی جهش یافته p407h در غیاب کلسیم در مقایسه با سایر انواع آنزیم افزایش یافت. نتایج ما به روشنی نشان داد که جفت هیستیدین 406 و 407 (و نه یک هیستیدین به تنهایی) عامل بهبود پایداری حرارتی جهش یافته p407h می باشد.

در این تحقیق مطالعاتی برای بررسی و مطالعه اثر اسید آمینه های جایگاه اتصال کلسیم روی پایداری حرارتی آنزیم bmw آمیلاز-پلولاناز انجام شد. سه جهش براساس مقایسه توالی با آمیلاز های مقاوم به حرارت طراحی شد. بر اساس نتایج، جهش h58i افزایش 5/7 برابری در کارایی کاتالیتیک را نشان داد، ضمن اینکه در مورد جهش یافته s76p میزان وابستگی به کلسیم افزایش یافت و در غلظت های بالاتر کلسیم میزان پایداری این آنزیم افزایش یافت. آنزیم حاوی دو جهش فوق، double mutant (s76p/h58i)، با افزایش بیش از 16 برابری کارایی کاتالیتیک مواجه بود ولی میزان پایداری آنزیم کاهش یافت. در ادامه جهش هایی در لوپ اتصال کلسیم (ef-hand like motif) طراحی شد که به منظور اضافه کردن یک واحد dx به لوپ اسید آمینه h58 به asp تبدیل شد که نتایج نشان داد این جهش یافته بدون وابستگی به کلسیم پایدار شده است که به نظر می رسد به دلیل افزایش تمایل برای اتصال به کلسیم و در نتیجه افزایش حضور کلسیم در ساختار آنزیم است. نیمه عمر و کارایی کاتالیتیک این جهش یافته در بافر با غلظت صفر کلسیم به ترتیب 6 و 9 برابر افزایش نشان داد. برای اثبات اینکه فقط asp در آن موقعیت چنین نقشی دارد، h58 به اسید آمینه هایی متفاوت شامل arg، phe و tyr نیز تبدیل شد که نتایج نشان دهنده افزایش فعالیت و پایداری این آنزیم ها با افزایش کلسیم است (مشابه آنزیم وحشی) لذا این آنزیم ها همچنان نسبت به کلسیم وابستگی نشان می دهد. بعلاوه پارامتر های ترمودینامیکی واکنش آمیلولیتیک و واکنش غیرغعال سازی حرارتی، افزایش انرژی فعال سازی فرایند غیرفعال سازی سیستم را برای انواع مقاومتر نشان می دهد. در این مطالعه نشان داده شد که یک جهش نقطه ای می تواند آلفا-آمیلازی مزوفیل را به آنزیمی پایدار تبدیل کند ضمن اینکه همزمان کارایی کاتالیتیک را نیز بهبود بخشد.

برای استفاده کارآمد از آلفا- آمیلازها این آنزیم ها باید در دماهای بالا پایدار بوده و فعالیت خود را حفظ کنند. یکی از دلایل غیر فعال شدن حرارتی برگشت ناپذیر آنزیم ها، ایجاد تغییرات کووالان نظیر دآمیداسیون اسید آمینه های آسپارژین و گلوتامین می باشد. اسیدهای آمینه آسپارژین در دماهای بالا ممکن است دستخوش تغییر شیمیایی نظیر جدا شدن گروه آمین شوند. در این مطالعه آلفا- آمیلاز جدا شده از سویه ایرانی باسیلوس kr8104 که bka نامیده می شود مورد بررسی قرار گرفت. انتخاب اسیدهای آمینه آسپارژین به منظور ایجاد جهش با تمرکز بر ساختار کریستالی پروتئین انجام شد. با توجه به ساختار سه بعدی پروتئین 6 اسید آمینه آسپارژین که انتظار می رفت بطور بالقوه قابلیت دآمیده شدن داشته باشند انتخاب شده و بوسیله موتاسیون هدفمند به اسیدهای آمینه دارای بار مثبت، بار منفی و قطبی بدون بار تغییر یافتند. به این ترتیب 16 جهش یافته مختلف ایجاد شده و میزان پایداری حرارتی هر کدام پس از انکوبه کردن در دمای بالا مورد بررسی قرار گرفت. در مقایسه با آنزیم وحشی 4 آنزیم جهش یافته توانستند پایداری پروتئین را در دمای بالا افزایش دهند. بیشترین پایداری در مورد جایگزینی n112d مشاهده گردید که سبب افزایش نیمه عمر پروتئین به میزان 5 برابر در دمای c° 70 شده بود. همچنین جایگزینی های n112e، n129d و n312s نیز توانستند پایداری پروتئین را به طور قابل توجهی افزایش دهند. در مرحله بعد به منظور افزایش بیشتر پایداری پروتئین، 5 جهش یافته حاوی 2 جهش و یک موتانت دارای 3 جهش ساخته شده و پایداری حرارتی آنها مورد بررسی قرار گرفت. موتانت دارای دو جهش n112d/ n129d بیشترین میزان پایداری را داشته و نیمه عمر این آنزیم در مقایسه با آنزیم وحشی حدود 9 برابر افزایش یافت. علاوه بر نیمه عمر پروتئین ها دیگر پارامترهای مرتبط با پایداری نظیر t50 و tm نیز اندازه گیری شدند. نتایج نشان دادند که جایگزینی های انجام شده اثرات مطلوبی در بهبود پایداری حرارتی آنزیم bka ایجاد کرده اند.

در این تحقیق مطالعاتی برای بررسی و مطالعه اثر اسید آمینه های جایگاه اتصال کلسیم روی پایداری حرارتی آنزیم bmw آمیلاز-پلولاناز انجام شد. سه جهش براساس مقایسه توالی با آمیلاز های مقاوم به حرارت طراحی شد. بر اساس نتایج، جهش h58i افزایش 5/7 برابری در کارایی کاتالیتیک را نشان داد، ضمن اینکه در مورد جهش یافته s76p میزان وابستگی به کلسیم افزایش یافت و در غلظت های بالاتر کلسیم میزان پایداری این آنزیم افزایش یافت. آنزیم حاوی دو جهش فوق، double mutant (s76p/h58i)، با افزایش بیش از 16 برابری کارایی کاتالیتیک مواجه بود ولی میزان پایداری آنزیم کاهش یافت. در ادامه جهش هایی در لوپ اتصال کلسیم (ef-hand like motif) طراحی شد که به منظور اضافه کردن یک واحد dx به لوپ اسید آمینه h58 به asp تبدیل شد که نتایج نشان داد این جهش یافته بدون وابستگی به کلسیم پایدار شده است که به نظر می رسد به دلیل افزایش تمایل برای اتصال به کلسیم و در نتیجه افزایش حضور کلسیم در ساختار آنزیم است. نیمه عمر و کارایی کاتالیتیک این جهش یافته در بافر با غلظت صفر کلسیم به ترتیب 6 و 9 برابر افزایش نشان داد. برای اثبات اینکه فقط asp در آن موقعیت چنین نقشی دارد، h58 به اسید آمینه هایی متفاوت شامل arg، phe و tyr نیز تبدیل شد که نتایج نشان دهنده افزایش فعالیت و پایداری این آنزیم ها با افزایش کلسیم است (مشابه آنزیم وحشی) لذا این آنزیم ها همچنان نسبت به کلسیم وابستگی نشان می دهد. بعلاوه پارامتر های ترمودینامیکی واکنش آمیلولیتیک و واکنش غیرغعال سازی حرارتی، افزایش انرژی فعال سازی فرایند غیرفعال سازی سیستم را برای انواع مقاومتر نشان می دهد. در این مطالعه نشان داده شد که یک جهش نقطه ای می تواند آلفا-آمیلازی مزوفیل را به آنزیمی پایدار تبدیل کند ضمن اینکه همزمان کارایی کاتالیتیک را نیز بهبود بخشد.

کاربردهای وسیع نانومواد نیازمند سنتز نانوساختارهایی با خواص ویژه (هندسه، خواص سطح، هدایت الکتریکی و همچنین خواص مغناطیسی) می باشد. این مواد می توانند به فرم های نانوذره، نانومیله و نانوپوشش و سایر اشکال ساخته شوند. در این رساله سه رویکرد ساخت نانوذرات و کاربرد آنها مد نظر قرار گرفته است. در میان این نانوساختارها، نانوذرات مغناطیسی اکسید آهن دارای کاربردهای بیشماری در تحویل داروها، روش های تشخیصی، تثبیت سلولها و آنزیمها و سیستمهای جداسازی زیستی دارند. در این رساله نانوذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکا با روش میکروامولسیون آماده شده و توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری با قدرت تفکیک بالا و طیف eds آنالیز و شناسایی شدند. نانوذرات مذکور برای سلولهای سرطانی ریه انسان و میگو سمیت نداشته و به عنوان بستر جهت تثبیت آنزیم گلوکز اکسیداز بکار گرفته شد. اتصال آنزیم به نانوساختار توسط طیف فروسرخ تایید شد. آنزیم تثبیت شده بر روی نانوذرات، 98 میلی گرم به ازای هر گرم بستر بود و مطالعات پایداری فعالیت آنزیم نشانگر وجود فعالیت 98 درصدی پس از طی 45 روز و همچنین وجود فعالیت 90 درصدی پس از 12 مرتبه استفاده پی در پی بودند. از نظر پایداری حراراتی، فعالیت آنزیم های تثبیت شده بهبود یافته و در دمای 80 درجه سانتی گراد دارای فعالیت بوده و حساسیت کمتری نسبت به ph محیط واکنش نشان می دهد. نتایج به دست آمده از این تحقیق و مخصوصا زیست سازگاری این مواد، نشانگر وجود پتانسیل بالای نانوذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکا در زیست-پزشکی می باشد. یکی از چالشهای مهم در الکتروشیمی زیستی، دستیابی به ارتباط الکتروشیمیایی کارآمد میان الکترود و آنزیم های اکسیداسیون و احیا می باشد. در این رساله یک زیست حسگر لاکتوز الکتروشیمیایی با تثبیت سلوبیوز دهیدروژناز بر روی نانومیله های طلا ساخته شده است. نانومیله-های طلای یکدست با روش رشدهسته ای دانه ساخته شده و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی شناسایی شدند. الکترود طلا در ابتدا توسط نانومیله طلا تیمار شد و بعد آنزیم بر روی نانومیله ها از طریق تک لایه های خودآراینده تثبیت شدند. داده های به دست آمده از ولتامتری چرخه ای نشان دادند که الکترود طراحی شده نسبت به الکترود شاهد (بدون نانو میله طلا پاسخ بسیار بیشتری نسبت به لاکتوز دارد. همچنین مشاهده شد که نانومیله پوشانیده شده با 4-مرکاپتوبنزوئیک اسید (4-mba)، چگالی جریانی معادل سه برابر الکترود پوشانیده شده با 4-مرکاپتوفنل (4-mp) دارد. در چند سال اخیر استفاده از زیست الگوها برای ساخت نانوساختارها به دلیل کنترل بالا بر روی مرفولوژی و یکدست بودن نانوساختارهای ساخته شده، در تحقیقات نانوزیست فناوری بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در این رساله نانوساختارهای نیکلی با الگوی باکتریایی با روش رسوب دهی از طریق فعال سازی سطح باکتری ها ساخته شدند. فعالسازی سطح باکتری ها توسط واکنش آمینواسیدهای سطحی با نمک پلاتین انجام شد و واکنش ساخت نانوذره در محیط حاوی یونهای نیکل و احیا کننده دی متیل آمین بوران انجام گرفت. تغییرات سطحی در طول فرایند سنتز توسط طیف فلورسانس بررسی شد. طیف فلورسانس اسیدآمینه ترپتوفان بعد از رسوب نیکل بر روی سطح باکتری به طور کامل فرونشانی شد. آنالیز مرفولوژی در سطح باکتری با استفاده از میکروسکوپ نیروی اتمی و میکروسکوپ الکترونی عبوری بررسی شد. نانوساختار مذکور پس از 20 دقیقه تحت امواج مافوق صوت نیز تخریب نشدند و همچنین ناهمواری سطح باکتری پس از رسوب نانوکلاسترهای نیکل بر روی آنها افزایش یافت. مقدار نیکل پوشش داده شده بر روی سطح باکتری از طریق مطالعات آنالیز گرماوزنی 36 درصد وزنی محاسبه شد. در انتها از این نانوساختار برای به دام اندازی باکتری هایی که پیشتر در آنها آنزیم آلفا آمیلاز بیان شده بودند، به عنوان حامل فلزی استفاده شدند.

لوسیفراز پروتئینی است که دارای یک دمین بزرگ در انتهای آمین و یک دمین کوچک در انتهای کربوکسیل است. آنالیزهای b-factor نشان دهنده این است که دمین انتهای کربوکسیل لوسیفراز، انعطاف پذیرتر از دمین انتهای آمین می باشد. مطالعه بر روی پروتئین های ترموفیل نشان داده است که پایداری دمائی پروتئین های ترموفیل در نتیجه استحکام ساختاری بیشتر آنها است. در ضمن ارتباط بین انعطاف پذیری، پایداری و عملکرد در اغلب پروتئین ها مبهم است. در این مطالعه جهت بررسی ارتباط بین پایداری و انعطاف پذیری در انعطاف پذیرترین بخش لوسیفراز در دو گونه lampyris turkestanikus و photinus pyralisاز دو روش جهش زائی اشباعی و جهش زائی هدفدار استفاده شده است. در لوسیفراز گونه l.turkestanikus، از روش جهش زائی اشباعی استفاده شد و کتابخانه ایجاد شده غربالگری شد. اما کلونی های دارای پایداری دمائی قابل توجه یافت نشد و دو کلونی با افزایش جزئی در پایداری دمائی انتخاب شده و تعیین توالی شدند. کلونی های انتخابی دارای جهش های p473l و p473r بودند. آنالیز های پایداری دمائی پروتئین های خالص نشان داد که جهش یافته های p474lو p473r کمی ناپایدار شده و هر دو جهش یافته نسبت به گونه وحشی انعطاف پذیرتر شده اند.در لوسیفراز گونه p.pyralis، جهش زائی هدفدار مورد استفاده قرار گرفت و دو جهش d474k و d476n در انعطاف پذیرترین بخش لوسیفراز طراحی و ایجاد شد. آنالیز های پایداری دمائی نشان داد که جهش d476n اثر چشمگیری در پایداری ایجاد نکرده است اما جهش یافته d474k ناپایدار شده است.از طرف دیگر آنالیزهای انعطاف پذیری با استفاده از فلورسانس خاموشی و پروتئولیز محدود نشان داد که جهش یافته d474k نسبت به پروتئن اصلی انعطاف پذیرتر شده در حالیکه d476n تفاوتی محسوس پیدا نکرده است، در ضمن مطالعات فلورسانس ans و فلورسانس ذاتی نشان داد که در جهش یافته d476n تغییرات ساختاری ایجاد شده اما این تغییرات ساختاری اثر محسوسی در پایداری و انعطاف پذیری ایجاد نکرده است. بررسی های بیوانفورماتیک نشان داد که تخریب یک پل نمکی بین d474 و k445، به همراه حذف یک پیوند هیدروژنی ممکن است علت های نا پایداری دمائی جهش یافته d474k باشند.

امروزه توسعه صنعت پتروشیمی و کاربرد گسترده آن به عنوان منبع انرژی منجر به ورورد غلظت بالایی از ترکیبات آروماتیکی مثل بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و گزیلن (btex) به سفره آب های زیرزمینی شده است. ازآنجا که این ترکیبات در برابرتجزیه زیستی مقاوم هستند پایداری بسیار بالایی را در طبیعت از خود نشان می دهند. این ترکیبات همچنین اثرات مضری برعملکرد سیستم عصبی انسان دارند به همین دلیل امروزه توسعه روش های شناسایی آنها در آب آشامیدنی،مواد غذایی،لوازم بهداشتی و ...بیش از پیش مورد توجه محققین قرار دارد. اگرچه برخی روش های آنالیز شیمیایی نظیر کروماتوگرافی فشار بالا (hplc) و گاز-کروماتوگرافی (gc) می توانند آلودگی های آروماتیک را در محیط شناسایی نمایند ولی این روشهای شیمیایی قدرت تمیز و تشخیص بین بخش های زنده و غیرزنده ترکیبات آروماتیک در سیستم های بیولوژیک را ندارند از سوی دیگر تجهیزات مربوطه اغلب حجیم بوده و وابسته به محیط آزمایشگاهی می باشند . براین اساس بسیاری از دانشمندان در راستای طراحی روشهای ساده و کم هزینه جهت شناسایی ترکیبات آروماتیک، از میکروارگانیسم های تجزیه کننده این ترکیبات استفاده کردند. در این پژوهش از اجزاء اپران xyl موجود در باکتری سودوموناس پوتیدا mt-2 جهت شناسایی ترکیب تولوئن در قالب یک حسگر زیستی باکتریایی استفاده شده است. پس از ساخت کانستراکت حاوی پروتئین تنظیمیxylr ، پروموتور pu و آنزیم گزارشگر لوسیفراز توسط تیم تحقیقاتی دکتر بهزادیان، به منظور بهینه سازی این کانستراکت، ما در پایین دست پروموتورpu، یک پروتئین فلورسنت دست ورزی شده که دارای توالی های شاین دالگارنو (sd) و توالی تقویت کننده رونویسی (enhancer) می باشد به عنوان گزارشگر جایگزین آنزیم لوسیفراز نمودیم.سپس پلاسمید طراحی شده در درون باکتری jm109، ترانسفورم شد. به این ترتیب نوعی حسگر زیستی بر مبنای اپران xyl طراحی و بدست آمد. حسگر باکتریایی تولید شده در ادامه مورد آنالیز وسنجش شدت فلورسانس بر اساس غلظت های متفاوت تولوئن و ترکیبات مشابه قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر مناسب بودن این حسگر باکتریایی جهت جایگزینی آن با روش های مرسوم شیمیایی می باشد. پس از بهینه سازی ساختار مولکولی زیست حسگر با کلون کردن ژن گزارشگر gfp، به منظور انجام بهینه سازی بیشتر و بالا بردن کارایی زیست حسگر با تغییر شرایط جانبی نظیر ترکیبات محیط کشت، دما، ph ، اضافه کردن ترکیبات کمکی به محیط کشت پایه، از نرم افزار بهینه سازی rsmبرای طراحی آزمایش استفاده شد.

لاکازها (1.10.3.2 ;ec پارادی فنولدی اکسیژن اکسیدوردوکتاز) بدلیل قابلیت اکسیداسیون طیف گسترده ای از ترکیبات فنولی کاربردهای زیادی در صنایع بیوتکنولوژی دارند. لاکازهاآنزیمهای چند مسی متعلق به گروه اکسیدازهای آبی هستند کهدی فنول ها و مواد وابسته را اکسیدکرده و اکسیژن مولکولی را به عنوان پذیرنده نهایی الکترون استفاده می کنند.در این پژوهش ژن کد کننده لاکاز از باکتری b.pumilus سویه gaz23بوسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر و سپس در ناقل بیانی (pet28a)کلون و به باکتریe.coliسویه bl21 انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت. ژن لاکاز حاوی 1533 نوکلئوتید بوده و 510 اسید آمینه را کد می کند.ژن لاکاز جدا شده از سویه gaz23 دارای 67% شباهت آمینو اسیدی به پروتئینcotaاز باسیلوس سوبتیلیس و 95% شباهت به لاکاز باسیلوس پامیلوس سویه safr-032 می باشد.بمنظور بدست آوردن مقادیر بالای پروتئین محلول ، بیان تحت شرایط آئروبیک و در دمای پایین انجام گرفت. پروتئین نوترکیب بوسیله ستون تمایلی تخلیص و وزن مولکولی آنزیم بوسیلهsds-page،68 کیلو دالتون تعیین گردید. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم با استفاده از دو سوبسترای معمول لاکاز2, 2’-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid) (abts) وsyringaldazine (sgz)انجام گرفت.

چکیده آنزیم های تجزیه کننده زایلان توسط انواعی از باکتریهای هوازی و بی هوازی و قارچ ها تولید می شود که جهت تجزیه بافت های گیاهی و آزاد سازی زایلوز به عنوان منبع اصلی کربن در متابولیسم سلولی و یا برای عفونت زایی در سلول های گیاهی از طریق تجزیه همی سلولز به این آنزیم ها نیاز دارند. آنزیم های تجزیه کننده زایلان به علت کاربرد گسترده شان در فرایندهای صنعتی مانند بهبود قابلیت هضم غذای دام و طیور، سفید سازی کاغذ، صنایع نساجی، تولید زایلو الیگوساکاریدها، بهبود بافت در صنایع نانوایی، شفاف سازی آبمیوه ها، حذف پوست دانه گیاهان، تبدیل پساب های لیگنوسلولز به فراورده های واجد ارزش اقتصادی مانند اتانول، پروتئین تک سلولی، عصاره های قندی و سوخت های زیستی توجه فراوانی را به خود جلب نموده است. در این میان مخمرها به دلیل سهولت تولید صنعتی و نیز سمیت کمتر، ارزش بیشتری برای کاربرد در صنایع غذایی دارند. در این پژوهش، در مجموع 110 جدایه مخمری از 20 نمونه از منابع گوناگون شامل پساب کارخانجات کاغذ سازی، خاک، گل ها، سبزیجات و پوست درختان جداسازی شد و نیم رخ آنزیمی این جدایه ها تعیین شد و علاوه بر جدایه های مولد زایلاناز، سویه های مخمری واجد بالاترین فعالیت آنزیمی در هر گروه شناسایی شد. شناسایی جدایه واجد بالاترین فعالیت نوکلئازی به معرفی تاکسون جدیدی با نام basidioascus persicus منجر شد. فعالیت زایلانازی خارج سلولی بر اساس تشکیل هاله شفاف بر روی پلیت زایلان آگار تعیین شد. جدایه مولد بیشترین میزان آنزیم زایلاناز برای بهینه سازی فرایند تولید با استفاده از روش های کلاسیک (یک عامل در هر زمان) و آماری (پلاکت- بورمن و سطح پاسخ) انتخاب شد. در این پژوهش 11 جدایه واجد فعالیت زایلانازی جداسازی شدند. جدایه واجد بالاترین فعالیت زایلانازی تحت عنوان aureobasidium pullulans سویه sn090 شناسایی شد. این جدایه علاوه بر فعالیت بتا 1و 4 زایلانازی قادر به تولید بتا زایلوزیداز (iu/ml 179/0) و آلفا آرابینوفورانوزیداز (iu/ml 063/0) نیز می باشد. بر اساس روش کلاسیک بهینه سازی، گرماگذاری به مدت 48 ساعت در دمای c? 27، اینوکولوم 2%، ph آغازین 4 و سرعت همزنی rpm 90 شرایط بهینه برای دستیابی به حداکثر تولید آنزیم تعیین شد. پسماندهای کشاورزی واجد زایلان به عنوان منبع کربن جایگزین ارزان قیمت برای تولید زایلاناز مورد بررسی قرار گرفتند. بازده تولید آنزیم زایلاناز در محیط کشت واجد سبوس گندم به عنوان تنها منبع کربن بسیار به میزان تولید در محیط واجد زایلان خالص شباهت داشت. در طراحی آزمایش به روش پلاکت- بورمن برای غربالگری عوامل موثر و روش طراحی ccd برای بهینه سازی تولید آنزیم بکار رفت. سرعت هوادهی، غلظت منبع کربن (w/v) و ph آغازین به عنوان عوامل موثر توسط روش پلاکت بورمن انتخاب شد. در مقایسه با محیط بهینه سازی نشده، فعالیت زایلانازی iu/ml 52/5 در محیط بهینه سازی شده به روش ccd بدست آمد و در نتیجه افزایش 09/2 برابر پس از بهینه سازی محیط کشت حاصل شد. در مرحله بعد، خالص سازی آنزیم به روش الکتروفورز sds-page به جداسازی باند پروتئینی واجد فعالیت زایلانازی با وزن مولکولی 26 کیلودالتون منجر شد از این رو بنظر می رسد تعیین توالی نواحی n ترمینال و c ترمینال پروتئین بتواند به طراحی پرایمرهای مناسب برای جداسازی ژ ن مولد آنزیم زایلاناز منجر شود.

یکی از امید بخش ترین روش های درمان سرطان، القاء آپوپتوز در سلول های سرطانی است. به همین منظور، چندین آنتی بادی آگونیست علیه گیرنده مرگ 5 (dr5) تولید شده است، که تحت ارزیابی بالینی قرار دارند. اساسا، با فعال شدن dr5 در سلول های سرطانی القاء آپوپتوز در مسیرهای داخلی و خارجی آغاز می گردد. این گیرنده در بخش خارج سلولی خود دارای چندین دومن عملکردی است، که در بین آنها دومن های غنی از سیستئین (crds) آن نقش کلیدی در القاء آپوپتوز با واسطه ی اتصال به trail دارند. اخیرا مشخص شده است، اتصال آنتی بادهای منوکلونال آگونیست به دومن دیگری از ناحیه ی -n ترمینال dr5 نیز می تواند آپوپتوز را القا کنند. دومن های متغییر مشتق شده از زنجیره ی سنگین آنتی بادی های شتری به نام vhhها یا نانوبادی ها، کوچکترین قطعات مقاوم و کارآمدی هستند، که قادرند به آنتی ژن ها متصل شوند. ویژگی های منحصر به فرد vhhها ، باعث شده است که آنها کاندیداهای مناسبی برای تشخیص و درمان محسوب شوند. در این تحقیق با استفاده از تکنیک نمایش فاژی و ایمن کردن شتر با آنتی ژن های پروتئین نوترکیب dr5و پپتید حاوی بخش اپی توپی (1itqqdlapqqra12)، کتابخانه ژنی حاوی vhhهای شتری ساخته شد. با غربالگری این کتابخانه فاژِی، در طی مراحل غنی سازی موفق به جداسازی سه متصل شونده با تمایل بالا به اپی توپ پپتیدی واقع در ناحیهntr گیرنده dr5و پنج متصل شونده دیگر با تمایل بالا به تمامی بخش خارج سلولی dr5شدیم. با استفاده از مطالعات تئوریک داکینگ محل اتصال این نانوبادی های تولید شده روی گیرنده dr5پیش بینی شد. هم چنین جهت بهبود ویژگی های اتصالی vhhهای به دست آمده جهش های مناسب با هدف افزایش بلوغ میل پیوندی برای هر نانوبادی طراحی شد. بررسی فعالیت بیولوژیکی دو مونوفاژ که از لحاظ نتایج مونوفاژالایزا و نتایج داکینگ نسبت به مونوفاژهای دیگر شرایط اتصالی بهتری با dr5 داشته اند، با آزمون های بیولوژیکیmtt و فعالیت کاسپاز 3 مورد بررسی قرار گرفت. کارایی اتصال و عملکرد این مونوفاژها بر روی کشت سلول حاکی از فعالیت مناسب این مونوفاژها در القائ آپوپتوز می باشد. با در نظر گرفتن نقش کلیدی این اپی توپ ها در القاء آپوپتوز، متصل شونده-های انتخاب شده، می توانند کاندیداهای مناسبی برای راه اندازی آپوپتوز در سلول های سرطانی متفاوت باشند.

در این تحقیق نرم افزار تحت وب discover معرفی شده است که می تواند جفت های باقی مانده ای را که در صورت جهش به سیستئین، پیوند دی سولفید ایجاد می کنند و موجب بهبود پایداری پروتئین می شوند، پیش بینی کند. پیش بینی بر پایه شرایط ساختاری باقی مانده ها و تفاوت ویژگی های فیزیکی و شیمیایی اسیدهای آمینه نسبت به سیستئین انجام شده است. برای ارزیابی شرایط ساختاری از دسترس پذیری به سطح و انعطاف پذیری استفاده می شود. میانگین دسترس پذیری به سطح 18 تا 36 درصد و میانگین فاکتور دمایی نرمال شده مثبت به عنوان شرایط ساختاری مطلوب در نظر گرفته شده است. در مقایسه ویژگی های فیزیکی و شیمیایی اسیدهای آمینه، براساس مقیاس هیدروپاتی، اندیس پایداری، حجم اسیدهای آمینه، امکان ایجاد حفره و تداخلات فضایی، 31 جفت باقی مانده-ای که مناسب برای جابجایی با سیستئین هستند، پیش بینی شد. بنابراین بعد از آن که پروتئینی به نرم افزار ارائه گردد، جفت هایی با فاصله بین کربن های بتا کمتر از 5/4 آنگسترم جدا می شوند. سپس از میان جفت های جدا شده آن هایی که حداقل یکی از شرایط ساختاری مطلوب را داشته باشند و یا در لیست جفت های پیشنهادی حضور داشته باشند، به عنوان نمونه های پایدار کننده پیش بینی می گردند. برای هر جفت بسته به پارامترهای مطلوب در آن امتیازی اختصاص داده می شود و جفت ها به ترتیب امتیاز از زیاد به کم رتبه بندی شده و در خروجی به نمایش گذاشته می شوند. به علاوه کاربر می تواند هر تعداد جهش مورد نظر خود را انتخاب کرده تا در فایل ساختاری پروتئین اعمال گردد. خروجی نهایی شامل ساختار جهش یافته بهینه شده در قالب pdb همراه با نمایش سه بعدی از آن خواهد بود. مقایسه ها نشان داد که دقت و حساسیت discover نسبت به نرم افزار های مشابه بیشتر می باشد. این نرم-افزار از طریق آدرس http://bioinf.modares.ac.ir/software/discover به طور رایگان قابل دسترس می باشد.

برچسب¬های تخلیصی، ابزارهای ساده¬ای هستند که می توان از آنها برای جدا کردن طیف گسترده¬ای از پروتئین¬های نوترکیب استفاده کرد. از جمله برچسب¬های تخلیصی تازه کشف شده می توان به پلی پپتید شبه إلاستین (elp) اشاره کرد. این پلی پپتید از تکرار نسبتاً زیاد یک پنتاپپتید با اسید آمینه-های آبگریز تشکیل می شود. از ویژگی¬های منحصر به فرد این پلی پپتید رسوب در دمای محیط و در حضور غلظتی از نمک سولفات آمونیوم می باشد. این ویژگی، این پلی پپتید را برای جدا کردن انتخابی پروتئین¬های نوترکیب، حتی پروتئین¬هایی که قبلاً به دلیل حساس بودن به دما و غلظت بالای نمکی به سادگی قابل تخلیص نبودند، مناسب کرده است و دیگر نیازی به ستون کروماتوگرافی نیست. در انتهای فرایند های تولید پروتئین های نوترکیب، پروتئین هدف باید خالص و بدون برچسب باشد که حذف برچسب¬های تخلیصی یک مشکل اساسی در فرآیندهای تخلیص این پروتئین¬ها می باشد. در گذشته، از پروتئازها برای حذف برچسب¬ها استفاده می شد که این روش علاوه بر هزینه سنگین آن، مشکلاتی نظیر آسیب غیر قابل پیش بینی پروتئازها بر روی پروتئین نوترکیب و همینطور حذف این پروتئیازها را جهت بدست آوردن محصول خالص در برداشت. اینتئین¬ها (inteins) پروتئین¬های خود هیدرولیز شونده-ای هستند که می توان از آنها در برنامه¬های تخلیص پرتئین¬ها به عنوان جایگزینی برای پروتئازها جهت حذف برچسب¬های تخلیصی استفاده کرد. واکنش خود برشی اینتئین با تغییر دما و ph قابل کنترل است. بنابراین با ترکیب elp با اینتئین می توان یک برچسب خود برش دهنده ساخت که به طور اقتصادی تخلیص پروتئین¬های نوترکیب را در مقیاس¬های کوچک و بزرگ تسهیل کند. در این پایان نامه از elp-int به عنوان برچسب خود برش دهنده جهت تخلیص آنزیم اوریکاز، بدون استفاده از ستون کروماتوگرافی و دیگر روش¬های متداول، در میزبان e. coli استفاده شد.

امروزه آلودگی آب یکی از بزرگترین مشکلات نوع بشر می باشد و از میان ترکیبات آلوده کننده آب ترکیبات btex (بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و زایلن) ترکیباتی هستند که طیف گسترده ای از بیماری ها را به همراه دارند. زیست گزارشگرهای باکتریایی یکی از ابزاری هستند که توانایی سنجش کیفی و تا حدودی کمی آلودگی های زیست محیطی را دارا می باشند و این پتانسیل را دارند که جهت غربالگری نمونه های محیطی قبل از آنالیز دقیق آنها با روش های استاندارد مورد استفاده قرار گیرند. بعضی از باکتریها و قارچها دارای ژنهایی هستند که محصول روشن شدن آنها آنزیمهایی با توانایی باز کردن این ترکیبات حلقوی به شکل خطی و مصرف نهایی آنها به صورت واسطه های چرخه کربس و در نهایت زیست پالایی این مواد می باشد. یکی از این موجودات تجزیه کننده ترکیبات btex باکتری ralstonia pickettii pko1 می باشد. اپرون tbua1ubva2c اولین آنزیم مسیر تجزیه ترکیبات btex را در این باکتری کد می کند و tbua1 بخش پروموتری این اپرون می باشد که آنزیم rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از آن را انجام می دهد اما این آنزیم دارای تمایل بسیارکمی برای شروع رونویسی از tbua1می باشد. پروتئین فعال کننده رونویسی tbut مسئول کنترل مثبت این اپرون می باشد و این توانایی را دارد تا در حضور ترکیبات btex به توالی uas از این اپرون متصل شود و این کمپلکس حاصل با میان کنش با rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از tbua1 را تقویت می کند. در این تحقیق یک توالی سنتزی ساخته شد که توانایی تولید پیوسطه tbut را داراست. ژن گزارشگر gfp در این توالی تحت کنترل پروموتر tbua1 بیان می شود و این استراتژی سبب می شود که در حضور ترکیبات btex باکتریهایی که این توالی سنتزی به صورت الحاق شده در ناقل pgem-7zf(+) به درون آن ها وارد شده است از خود پیام فلورسنس تولید کنند. در این تحقیق اثر عواملی مانند نوع محیط کشت، نوع میزبان، دمای کشت، مرحله رشد بر این زیست گزارشگر و پارامترهای اختصاصی بون، حساسیت و lod آن سنجیده شد و با سایر گزارشات مشابه مقایسه شده است. نتایج نشان می دهد نوع محیط کشت و مرحله رشد بر پاسخ زیست گزارشگر موثر است و دمای 37 درجه سانتیگراد بهترین دمای بررسی زیست گزارشگر می باشد. میزان lod تولوئن و زمان پاسخ بعد از القا به ترتیب 5 میکرومولار و 48 ساعت می باشد. پاسخ زیست گزارشگر به ترکیبات btex اختصاصی است و دارای بیشتری انتخاب پذیری به تولوئن می باشد. همچنین نتایج نشان داد پاسخ زیست گزارشگر به مخلوط ترکیبات btex جمع پذیر می باشد.

سرطان پروستات یکی از شایعترین انواع سرطان در مردان 50 سال به بالا می باشد که در صورت تشخیص به هنگام این نوع سرطان احتمال درمان این بیماری بسیار افزایش می یابد و شانی بقای بیمار به صورت چشمگیری افزایش خواهد داشت.امروزه جهت شناسایی این موع سرطان از روش قدیمی روتین الایزا برای اندازه گیری آنتی ژن اختصاصی پروستات (psa) استفاده می شود.به علت دقت و حساسیت پایین تر این روش نسبت به روش های حساس تر مبتنی بر بیوسنسور ها میزان psa را در غلظت های بالاتری از تشکیل و گسترش تومور تشخیص می دهد.روش spr یا روش تشخیص رزونانس مغناطیسی سطحی یک روش مبتنی بر روش های فیزیکی و پراش پرتوی لیزر بر روی سنسور طلا می باشد که به دلیل دقت و حساسیت بسیار بالاتر نسبت به روش های قدیمی از جمله الایزا میزان psa را در غلظت های پایین تر تشخیص می دهد و به این دلیل در این پایان نامه جهت تشخیص زود هنگام سرطان پروستات مورد استفاده قرار گرفته است.

حلالهای deep eutectic اخیرا بعنوان حلالهای سبز شناخته شده اند.ای حلالها می تواند محیط مناسبی برای واکنشهای آنزیمی باشد بنابراین در این مطالعه اثر این مایعات بر فعالیت، پایداری و ساختار آنزیم لاکاز بررسی شد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

آلژینات تولید شده توسط سویه های موکوئیدی pseudomonas aeruginosa ، از عوامل مهم ایجاد عفونت های مزمن ریوی در بیماران مبتلا به فیبروز سیستیک ، می باشد. آلژینات پلی ساکارید خارج سلولی و متشکل از واحدهای d- مانورونیک اسید و l-گلورونیک اسید است. پاسخ ایمنی محافظت کننده نقش مهمی در کنترل این عفونت ها دارد . از طرفی مطالعات قبلی نشان داده که عصاره سیر وفراکشن ایمونومدولاتورجدا شده از آن ، قادر به تحریک پاسخ های ایمنی در مدل موشی می باشد. آلژینات از سویه بالینی214 p.aeruginosa تخلیص شد . آلژینات خالص شده از p.aeruginosa حاوی µg/ml 9 /30 یورونیک اسید ، از µg/ml 25/1پروتئین ، µg/ml 3/0 dna وµg/ml 08/0 lps بود. تعداد40 موش ماده balb/c 6 تا 8 هفته تحت تزریق با آلژینات ، مخلوط آلژینات – r10 و آلژینات ـ عصاره سیر در روزهای 0و7و14 قرار گرفتند . سوپرناتانت کشت سلول طحال جمع آوری و میزان سایتوکاین های il-4 و ifn? به روش enzyme- linked immunosorbent assay (elisa ) سنجش شد . بر طبق نتایج به دست آمده از آنالیز آماری t-test با ضریب اطمینان 95% ، میزانifn? بین گروه کنترل و گروه ایمن شده با فرکشن ایمونومدولاتور سیر (r10 ) ـ آلژینات (02/0 >p ) وبین گروه کنترل وگروه عصاره سیر ـ آلژینات (02/0 >p ) کاهش معنی داری و میزان il-4بین گروه های مزبور افزایش معنی داری را نشان داد.

حضور یونهای فلزات سنگین در داخل آبها و پسابهای صنعتی بدلیل سمی بودن ، یک مشکل بزرگ برای محیط زیست محسوب می شود. این آلوده کننده ها می توانند در ارگانیسمهای موجود زنده تجمع کنند و در نتیجه باعث بروز انواع بیماریها برای انسانها می شوند. جمع آوری و دفع پساب چه از نقطه نظر بهداشتی و چه از نظر اقتصادی در دیدکلان از اهمیت خاصی برخوردار بوده و انجام تصفیه و رها سازی پساب تصفیه شده و یا استفاده مجدد از پساب از موضوعات مهم جوامع صنعتی و رو به رشد می باشد. صرف نظر از چگونگی مصرف پساب تصفیه شده ، تصفیه فاضلاب را می توان از اصلی ترین و مهمترین معضلات جوامع امروزی به شمار آورد. در این میان احیای باکتریایی اکسی آنیونهای سلنیوم ( سلنات و سلنیت) به عنصر سلنیوم یک فرایند زیستی مهم در حذف آن از پساب می باشد. باکتری bacillus sp. stg-83 توسط آقای دکتر صعودی و همکارانشان از چشمه نی دشت جدا شده بود. این باکتری گرم مثبت و بی هوازی اختیاری، قادر است اکسی آنیونهای سمی و محلول سلنیوم( سلنات و سلنیت) و تلوریم( تلوریت) ر ا به فرم غیر محلول و غیر سمی سلنیوم عنصری احیا کند. در این تحقیق، آنزیم سلنات ردوکتاز و آنزیم تلوریت ردوکتاز حاصل از این باکتری تخلیص و خصوصیات سینتیکی آنها تعیین شد. مراحل تخلیص شامل رسوب با سولفات آمونیوم و روشهای کروماتوگرافی با استفاده از رزینهای سفاکریل s-200 و فنیل سفارز بود. مقدار km و vmax آنزیم سلنات ردوکتاز برای سوبسترای سلنات به ترتیب mm3/24 و µmol.min-1.mg-2/17 محاسبه شد. محدوده ph بهینه آنزیم 5/5-6 و دمای بهینه فعالیت آنزیم °c38 بدست آمد. کاتیون های mn2+ ,mg2+ ,k+ وca2+ فعالیت آنزیم را کاهش دادند. وزن مولکولی آنزیم با استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون در حدود kda 182 تعیین شد. مقدار km و vmax برای تلوریت ردوکتاز به ترتیب mm 2/63 و µmol.min-1.mg-1 5/18 بدست آمد. آنزیم بیشترین فعالیت را در دمای °c35 و8ph= از خود نشان داد. کاتیون های یک ظرفیتی و دو ظرفیتی تاثیری بر فعالی آنزیم نداشت. با استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون، وزن آنزیم در حدود kda 197 تعیین شد.

به منظور بررسی مهار آنزیم آلفا آمیلاز مزوفیل bacillus kr-8104 توسط آکاربز دو اسید آمینه ی سرین 105 و تایروزین 175 موجود در نزدیکی جایگاه فعال به اسید امینه های معادل در آلفاآمیلاز bacillus subtilis که مقاوم به آکاربز می باشد تغییر یافتند. در موتان tyr175phe حذف پیوند هیدروژنی تایروزین با gln205 که در کنار ریشه ی کاتالیتیک glu208 قرار دارد منجر به کاهش میزان مهار شده است.در موتان ser105phe حذف پیوند هیدروژنی گروه جانبی که احتمالا با نیتروژن گر.ه آکاروِیوزین در آکاربز می باشد، باعث کاهش مهار شده است.km ،kcat و آنتروپی کمپلکس فعال شده ی آنزیم سوبسترا در هر دو موتان نسبت به آنزیم وحشی کاهش یافته است. کاهش آنتروپی احتمالا با محدود کردن انواع کانفورماسیونهای کمپلکس فعال آنزیم سوبسترا و سفت کردن ساختار ناحیه ای آنزیم منجر به افزایش تمایل آنزیم به سوبسترا شده است که توسط برهمکنشهای هیدروفوب دو اسیدآمینه ی جدید فنیل آلانین به وجود آمده است . آین دو جهش تغییری در پروفایل ph آنزیم ایجاد نکرده اند که دلیلی بر عدم تغییر pka اسیدآمینه های کاتالیتیک در اپر موتاسیون می باشد.

آمیلازها (endo-1,4-alphaglucohydrolase, ec 3.2.1.1) قادرند پیوندهای گلیکوزیدی 4-1 ، α موجود در بخش درونی آمیلوز، آمیلوپکتین و سایر کربوهیدراتهای وابسته را هیدرولیز کنند. آلفا- آمیلازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی بوده و کاربردهای فراوانی دارند. سویه های مختلف از نمونه های جمع آوری شده از ناحیه ای در رامسر که تشعشع رادیواکتیو بالایی دارد، جدا شد. یکی از آنها به نام bacillus sp. who مقاوم به پرتو گاما بوده و قادر به تولید آلفا – آمیلاز خارج سلولی است. ژن آلفا – آمیلاز این سویه جدا شده، در وکتور ptz57r/t کلون و تعیین ترادف گردید. سپس این ژن در وکتور بیانی(pet21a) ، مجددا کلون شد و به سوش bl21 انتقال یافت. پس از بیان ژن، پروتئین نوترکیب تولید شده تحت شرایط احیایی با استفاده از ستون ni-nta آگاروز تخلیص شد. ژن آلفا آمیلاز حاوی 1563 نوکلئوتید بوده و 520 اسید آمینه را کد می کند. توالی این ژن با ترادف سایر آمیلازهای میکروبی از جمله bacillus megaterium ، bacillus sp. ws06 و bacillus sp. cs10 ( به ترتیب 95%، 95% و 96% ) شباهت بالایی دارد. چهار ناحیه حفاظت شده در آمیلازها (نواحی i, ii, iii, iv) در این توالی آمینو اسیدی دیده می شود و وزن مولکولی آنزیم نوترکیب با استفاده از sds-page حدود 64 کیلو دالتون تخمین زده شد. این آنزیم مثل سایر آمیلازها وابسته به کلسیم است و دما و ph بهینه برای فعالیت آن به ترتیب c°50 و 7 می باشد.

بستر سفارز-لیپید(سفارز ‏‎4b‎‏ حاوی زنجیره آلکیل) به عنوان بستر هیدروفوب برای رونشینی جذبی بسیاری از پروتئین ها از طریق میانکنش هیدروفوب مورد استفاده قرار گرفته است. برخی از پروتئین ها به دلیل قابل دسترس بودن سطوح هیدروفوب ، بر روی این ماتریکس ها بخوبی تثبیت گردیدند. علاوه برآن ، پروتئین هایی نیز وجود دارند که در فرم طبیعی ساختمان خود، قادر به انجام میانکنش با بازوی هیدروفوب بسترهای مذکور نمی باشند. از جمله این آنزیمها ، آنزیم آلفا آمیلاز می باشد.

در این مطالعه ابتدا پایداری حرارتی آلفا آمیلازهای مزوفیل (حاصل از ‏‎baa, bacillus amyloliquefaciens‎‏) و ترموفیل (حاصل از ‏‎bla, bacillas licheniformis‎‏) و اثرات عوامل دناتوره کننده، حلال های آلی و پایدارکننده ها بررسی شد. آنزیم ترموفیل در حلال آبی مقاومت بیشتری در مقابل عوامل دناتوره کننده داشت ولی چنین تفاوتی در شرایط غیرآبی مشاهده نشد. به علاوه پایداری این دو آنزیم در حضور یکسری از پایدارکننده ها افزایش یافت. از میان پایدارکننده های مختلف سوربیتول بیشترین مقاومت ساختاری در این دو آنزیم ایجاد نمود، به طوری که همزمان افزایش ‏‎tm‎‏ و کاهش دآمینه شدن این پروتئین ها در اثر حرارت مشاهده شد. مطالعه مقایسه ای پروتئولیز محدود و وسیع ‏‎bla, baa‎‏ با استفاده از تریپسین انجام گرفت. طبق انتظار، آنزیم مزوفیل مقاومت بیشتری در مقابل هضم توسط تریپسین از خود نشان داد. در طی فرآیند پروتئولیز فعالیت ‏‎baa‎‏ کاهش یافت ولی بالعکس فعالیت ‏‎bla‎‏ افزایش پیدا کرده و به طور همزمان کاهش در پایداری حارتی آن مشاهده شد. با اندازه گیری های ‏‎cd‎‏، مشخص شد که ‏‎tm‎‏ آنزیم در اثر تیمار با تریپسین از 89 درجه سانتیگراد به 86 درجه سانتیگراد می رسد که نشاندهنده افزایش انعطاف پذیری در طی این فرآیند است. در حضور پایدارکننده ها هضم پروتئولیتیکی هر دو آنزیم کاهش یافت. این پدیده احتمالا ناشی از پایدارشدن (سخت تر شدن) این آنزیم ها در حضور پایدارکننده ها است. افزایش پایداری می تواند ناشی از هیدراسیون ترجیحی پروتئین ها در حضور این افزودنی ها باشد. الگوی هضم با توجه به اطلاعات بیوشیمایی در رابطه با ساختار این پروتئین ها و حرکات موضعی در نواحی لوپ مورد بحث قرار گرفت. دستکاری شیمیایی رزیدوی لیزین در دو آلفا آمیلاز باکتریائی، ‏‎bla, baa‎‏ ، با استفاده از سیتراکونیک انیدرید مورد بررسی قرار گرفت. این تغییر باعث افزایش فعالیت و پایداری در این دو آنزیم گردید به طوری که پایداری ‏‎baa‎‏ در 80 درجه سانتیگراد افزایش یافت و فعالیت ‏‎bla‎‏ در 15 درجه سانتیگراد، پانزده برابر شد و ‏‎kcat/ km‎‏ آن سه برابر گردید. غیرفعال شدن برگشت ناپذیر و اندازه گیری های ‏‎cd‎‏ این متالوآنزیم ها در حالات طبیعی و دستکاری شده در حضور و عدم حضور کلسیم ‏‎(10mm)‎‏ مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات ‏‎cd‎‏ نشان داد که با دستکاری شیمیایی ساختار سوم این پروتئین ها تغیر یافته که در حضور کلسیم تعدیل می شود. سوربیتول در حضور و عدم حضور کلسیم، پایداری فرم های مختلف این دو آنزیم را به طور موثری افزایش داد. نتایج از لحاظ اهمیت کاربردی این دیدگاه در جهت افزایش همزمان پایداری و فعالیت آنزیمی مورد بحث قرار گرفت.