چکیده مقدمه: در این مطالعه به منظور بررسی اثر انجماد شیشه ای بر تغییر بیان ژن و ارتباط مدیفیکاسیون های هیستونی با این تغییر بیان، الگوی سه مارک مختلف هیستونی ( h3k9me2, h3k9acو h3k4me3) در ناحیه تنظیمی ژن های ایمپرینت h19, igf2, mest و عامل رونویسی oct-4 مورد بررسی قرار گرفت. روش ها: با استفاده از روش سوپراوولاسیون در موش، جنین های 8 سلولی و بلاستوسیست بدست آمد. سپس جنین ها به سه گروه تقسیم شدند: گروه i: بلاستوسیت های in vivo به عنوان گروه کنترل، گروهii: جنین های 8 سلولی که به روش انجماد شیشه ای با کرایوتاپ منجمد شدند و پس از ذوب، در محیط کشت hamsf10 به مرحله بلاستوسیست رسیدند و گروه iii جنین های 8 سلولی منجمد نشده که در محیط کشت hamsf10 به مرحله بلاستوسیست رسیدند. سپس به منظور بررسی بیان کمی ژن ها ی ایمپرینت h19, igf2, mest و ژن oct-4 از تکنیک real-time pcr و به منظور بررسی وضعیت الگوی سه مدیفیکاسیون هیستونی مورد مطالعه در نواحی تنظیمی این چهار ژن از تکنیکchip lowcell استفاده شد. یافته ها: نتایج بررسی real-time pcr آشکار نمود که میزان بیان هر چهار ژن در گروه ii بطور معنی دار کاهش پیدا کرده است، در حالی که در گروه iii تنها بیان دو ژنh19 و igf2 بطور معنی دار کاهش یافت و کاهش بیان در ژن هایmest و oct-4 مشاهده نشد. اختلاف بیان ژن های mest و oct-4 بین گروه ii و گروه iii معنی دار می باشد. در بررسی نواحی تنظیمی ژن های مورد مطالعه، نشان داده شد در گروه ii در هر چهار ژن h3k9me2 به طور چشمگیر افزایش و h3k9ac و h3k4me3 به طور معنی دار کاهش یافته است. در گروهiii در ژن هایh19 و igf2 مارک h3k9me2 افزایش معنی دار پیدا کرده و مارک های h3k9ac و h3k4me3 به طور معنی دار کاهش پیدا کردند. اما در ناحیه تنظیمی ژن های mest و oct-4 سطح مارک h3k9me2 و سطح h3k4me3 و h3k9ac نسبت به کنترل تغییری نکرده است. نتیجه گیری: در گروه ii برایند سه مارک هیستونی مورد مطالعه در هر چهار ژن به سمت کاهش رونویسی می باشد. در صورتی که در گروه iii الگوی هیستونی ژن های mest و oct-4 تأیید کننده کاهش بیان این ژن ها می باشد. به طوری که برایند هر سه مارک در این ژن ها مشابه گروه کنترل و در جهت بالا بودن رونویسی است. الگوی هیستونی در ناحیه تنظیمی دوژن h19 و igf2 نیز با کاهش بیان رونوشت آن ها مرتبط می باشد. در نهایت می توان گفت که فرایند انجماد شیشه ای و شرایط محیط کشت با تغییر الگوی هیستونی می تواند بیان ژن را تغییر دهد. در مجموع می توان نتیجه گرفت با وجود مورفولوژی طبیعی جنین ها پس از انجماد شیشه ای به روش کرایوتاپ ممکن است تغییرات زیادی در سطح مولکولی صورت گیرد که می تواند روی سلامت و رشد جنین ها تأثیر گذار باشد. کلمات کلیدی: انجماد شیشه ای، تنظیم بیان ژن، تغییرات هیستونی، ژن های h19، igf2، mest، oct-4

مقدمه: برخی محققان معتقدند که بیان برخی ژن ها در نتیجه روش های کمک باروری می تواند دستخوش تغییراتی گردد، دلیل این تغییرات در بیان ژن در بسیاری مواقع تغییردر توالی ژنی نبوده و به دلایل اپی ژنتیکی اتفاق می افتد. در این مطالعه به منظور بررسی اثر انجماد شیشه ای بر تغییر بیان ژن و ارتباط مدیفیکاسیون های هیستونی با این تغییر بیان الگوی سه مارک هیستونی (h3k9me2، h3k4me3 و h3k9ac) در ناحیه تنظیمی ژن های ایمپرینت h19، igf2 و mest و عامل رونویسی oct4 مورد بررسی قرار گرفت. روش ها: با سوپراوولاسیون موش های سوری نژاد nmri، جنین های 2 سلولی و بلاستوسیست بدست آمد. سپس جنین ها به سه گروه تقسیم شدند:گروه ?: بلاستوسیست های invivo به عنوان گروه کنترل. گروه ?: جنین های 2 سلولی منجمد نشده که در محیط کشت ksom به مرحله بلاستوسیست رسیدند. گروه ?: جنین های دو سلولی که به روش انجماد شیشه ای که با کرایوتایپ منجمد شده و پس از ذوب در محیط کشت ksom به مرحله بلاستوسیست رسیدند. به منظور بیان کمی ژن ها از تکنیک real-time pcr و به منظور بررسی تغییرات هیستونی مذکور، در نواحی تنظیمی این چهار ژن، از تکنیک chip استفاده شد. یافته ها: نتایج بررسی real-time pcr نشان داد که میزان بیان ژن های ایمپرینت در هر دو گروه ? و ? نسبت به گروه کنترل افزایش معنی داری داشتند. اما هیچ اختلاف معنی داری در میزان بیان ژن های مورد نظر بین دو گروه منجمد شده و کشت داده شده مشاهده نشد. از طرفی میزان بیان ژن oct4 در هر دو گروه ? و ? کاهش معنی داری را نسبت به گروه کنترل نشان داد. در نتایج مربوط به تغییرات هیستونی ناحیه تنظیمی ژن های ایمپرینت h19، igf2 و mest، همزمان با کاهش معنی دار مارک متیلاسیون لایزین 9 هیستون h3 (h3k9me2)، افزایش معنی دار مارک فعال کننده رونویسی استیلاسیون لایزین 9 هیستون h3 (h3k9ac) مشاهده شد که با تغییرات بیان ژن های mest,igf2,h19 همسو می باشد. در نواحی تنظیمی ژن oct4 همزمان با کاهش معنی دار مارک هیستونی استیلاسیون لایزین 9 هیستون h3، افزایش معنی دار مارک خاموش کننده رونویسی متیلاسیون لایزین 9 هیستون h3 مشاهده شد، که با کاهش بیان ژن مذکور همسو می باشد. در هیچ یک از گروه ها، اختلاف معنی دار در سطح مارک هیستونی متیلاسیون لایزین 4 هیستون h3 مشاهده نشد. نتیجه گیری: شرایط محیط کشت می تواند با تغییر الگوی هیستونی، بیان ژن را تغییر دهد. افزایش بیان ژن های ایمپرینت در این تحقیق علاوه بر این که می تواند به دلیل تغییرات هیستونی در آلل مربوطه باشد، می تواند نتیجه تاثیر همزمان تغییر در متیلاسیون و مدیفیکاسیون هیستونی در آلل مقابل و فعال نمودن آلل غیر فعال باشد. قابل ذکر است که تفاوت معنی داری چه در میزان بیان ژن و چه در الگوی تغییرات هیستونی ژن های مذکور در جنین های منجمد شده به روش انجماد شیشه ای و جنین هایی که بدون فریز در محیط کشت به بلاستوسیست رسیدند مشاهده نگردید و این می تواند بیانگر این مطلب باشد که آنچه جنین را بیش از همه تحت تاثیر قرار می دهد شرایط محیط است و انجماد شیشه ای جنین می تواند به عنوان روشی کارآمد و کم خطر در کلینیک های ناباروری به کار رود.

چکیده ندارد.

تاکنون تلاشهای گسترده ای جهت تسهیل و بهبود بخشیدن به روشهای انجمادی جنینها به منظور نگهداری طولانی مدت آنها صورت گرفته است. همچنین جهت تکوین بهتر جنینها، سیستم های کشت مختلفی طرح ریزی گردیده و مورد آزمایش قرار گرفته است. از جمله این روشها، سیستم کشت همزمان و نیز محیطهای کشت متوالی می باشد.هدف مطالعه حاضر، بهبود تکوین جنینهای تک سلولی، پس از انجماد شیشه ای می باشد. به این منظور و به دلیل مزایای هر یک از دو روش هم کشتی و محیطهای کشت متوالی، میزان تاثیر به کارگیری همزمان این دو روش بر تکوین جنینهای تک سلولی مورد بررسی قرار گرفته است. ‎‏ از مجموع دستاوردهای این تحقیق می توان به این نتیجه رسید که مرحله تک سلولی جهت انجماد شیشه ای مناسب نبوده همچنین اگرچه بکارگیری هم کشتی به همراه محیطهای کشت متوالی سبب بهبود شرایط تکوین جنینهای منجمد نشده در محیط کشت متوالی نمی شود. ولی درجنینهای منجمدشده بکارگیری همزمان این دو سیستم کشت کاملا ضروری بوده سبب افزایش میزان تولید بلاستوسیست و کاهش چشمگیر دژنراسیون جنینها خواهد شد.