تعداد روبه افزایش قارچهای مقاوم به دارو اهمیت جستجو برای داروهای ضدقارچی را موردتأکید قرار می دهد. اگرچهغربال گنجینه های شیمیایی و یا طبیعی یک راه اصلی کشف ترکیبات ضد قارچی جدید است ولی همچنان مکانیسم اثر ترکیبات، مورد توجه صنایع داروسازی می باشد. یکی روش تعیین مکانیزم عمل،reversal assay میباشد که پایه آن بر توانایی واسطه های متابولیکی یا محصول نهایی مسیر مسدودشده توسط داروی مورد نظر در بی اثر نمودن دارو قراردارد. در این مطالعه دو ترکیب جدید ضدقارچ (a و b) به کارگرفته شد و غلظت معکوس کنندگی هرکدام از واسطه های متابولیکی با استفاده از سریال رقتی سنجیده شد. به نظر می رسد این ترکیبات مسیرهای سنتز اسیدنوکلئیک(ترکیب) aو اسیدآمینه های آلیفاتیک(ترکیبb) را مهارمی کنند. مرحله بعد سطح بیان ژن های دخیل در ساخت این اسیدهای آمینه، با تکنیک rt-pcr مورد بررسی قرارگرفت. بااستفاده از rt-pcr نیمه کمی، بر روی نمونه های rnaاستخراج شده از مخمر ساکارومایسس سرویزیه در دوحالت حضور و عدم حضور ماده ضدقارچی میزان بیان ژنهای کاندید مورد آنالیز قرار گرفت. نتایج نشان داده است که سطح بیان ژن ilv5 که کدکننده یک آنزیم کلیدی در مسیر سنتز اسیدهای آمینه مذکور می باشد، در حضور ماده ضدقارچی تغییر نموده است که این امر نشان دهنده فعالیت ترکیب b در مهار مسیر سنتز این اسیدهای آمینه می باشد.

بیماری بورس عفونی در جوجه ها سبب سرکوب سیستم ایمنی جوجه شده و از این طریق عفونت های بعدی ایجاد می گردد. در حال حاضر انواع واکسن های حاصل از تکثیر ویروس برای مقابله با این عفونت استفاده می شود. استفاده از واکسن های زیر واحدی در سال های اخیر مورد توجه قرار گرفته است. آنتی ژن سطحی vp2 بعنوان آنتی ژن هدف جهت تولید واکسن زیر واحدی گزینه مناسبی است. مطالعات متعددی بر روی تولید این پروتئین در سیستم های مختلف پروکاریوت و یوکاریوت صورت گرفته است. در مطالعات قبل آنتی ژن vp2 به صورت خالص شده و از طریق محیطی و یا بصورت میکروارگانیزم کامل و از طریق خوراکی استفاده شده است. در مطالعه حاضر پروتئین vp2 از ویروس ibdv بعنوان کاندید واکسن جهت بیان در قارچ رشته ای آسپرژیلوس نایجر مورد استفاده قرار گرفت. پروتئین مذکور در قارچ تراریخته بیان و بیان آن از طریق روش های الکتروفورز و وسترن بلات تائید شد. قارچ تراریخته در فرمانتور تکثیر و توده زیستی حاصل در رژیم غذائی جوجه های یک روزه استفاده شد. در این مطالعه نشان داده شد که قارچ رشته ای بعنوان حامل واکسیناسیون خوراکی قابل بکارگیری است. هر چند که تحریک سیستم ایمنی توسط آنتی ژن vp2 از راه خوراکی بطور نسبی محقق شده ولی وجود آنتی سرم علیه سایر پروتئین های قارچی موید تحریک سیستم ایمنی و امکان استفاده از قارچ خوراکی بعنوان واکسن خوراکی می باشد. از نکات بارز این مطالعه استفاده از قارچ آسپرژیلوس نایجر بعنوان میزبان بیان vp2 برای اولین بار و همچنین بکارگیری این قارچ رشته ای بعنوان حامل در استفاده خوراکی و واکسیناسیون از راه خوراکی می باشد.

مقدمه: scfv یکی از معروفترین قطعات حاصل از آنتی بادیهای تک دودمانی است و مخمر pichia pastoris یکی از مهمترین میزبان های بیانی اینگونه قطعات محسوب می شود. روش های بسیاری برای افزایش میزان بیان پروتئین های هترولوگ در این میزبان وجود دارد .باتوجه به اینکه فرایند تغییرات پس از ترجمه ای در شبکه آندوپلاسمی مرحله تعیین کننده سرعت در تولید پروتئین هاست، هدف قرار دادن چاپرون هایی نظیر pdi (protein disulfide isomerase)یکی از مهمترین استراتژی های افزایش بیان محسوب می شود. در این مطالعه اثر ترکیبات القا کننده بیان pdi نظیر سیستئامین و2-مرکاپتواتانول در افزایش میزان بیان، مورد ارزیابی قرار می گیرد . هدف: بررسی اثر سیستئامین و 2-مرکاپتواتانول بر میزان بیان پروتئین نوترکیب scfv روشها: سویه مورد نظر در برابرعوامل احیا کننده با غلظت های مختلف و فواصل زمانی مختلف رشد داده شد.میزان بیان با روش sds-page و وسترن بلاتینگ و الایزا ودیگر روش های مولکولی بررسی شد. نتایج:mic (minimum inhibitory consentration) برای ترکیبات سیستئامین و2-مرکاپتواتانول تعیین شد نتایج mic نشان داد که ازغلظت 6.25 میلی مولار برای سیستئامین و غلظت 1.5میلی مولار برای 2-مرکاپتواتانول برای بهینه کردن شرایط کشت می توان استفاده کرد و سویه های ترانسفورم شده با سازه بیان کننده scfv در حضور غلظت های مناسب از این دو ترکیب رشد داده شد. میزان بیان در حضور سیستئامین افزایش معنی داری نشان داد اما 2-مرکاپتواتانول منجر به کاهش میزان بیان گردید. نتیجهگیری: در این تحقیق سیستئامین در غلظتهای sublethal توانست میزان بیان scfvعلیه آنتی ژن cd22را افزایش دهد. به نظر می رسد این اثر افزایشی ناشی از القا بیان چپرونها ئی نظیر pdi باشد. این در حالیست که -me 2چنین افزایشی را موجب نگردید.

بررسی بیان ژن cps1در فاز های مختلف رشد : پس ازشمارش تعداد مشخصی از سلول های آسپرژیلوس فومیگاتوس این قارچ درزمان های 6 ساعته،8 ساعته و 24 ساعت ، کشت داده می شود, از نظر میزان بیان ژن مورد نظر در زمان های مختلف بررسی می شود.استخراج rna از آسپرژیلوس فومیگاتوس و ساختن cdna و rt-pcrدر هر یک از ساعت های مذکور جز مراحل کار در نظر گرفته شده است. 2. تکثیر ژن cps1 از قارچ a.fumigatus: ابتدا توالی cps1مربوط به قارچ a.fumigatusاز پایگاه های اطلاعاتی موجود بدست می آید و با توجه به این توالی پرایمر ها طراحی شده و با روش pcrتوالی ژن به انضمام 1 کیلو بازمربوط به ناحیه فرادست و فرودست آن تکثیر می شود همچنین باید جایگاه برش اختصاصی برای آنزیم های محدودالاثر (restriction enzyme) مورد نظر در انتهای 5’و3’توالی ژنی مورد نظر در هنگام طراحی پرایمر در نظر گرفته شود 3. همسانه سازی ژن در یک کلونینگ وکتور مناسب : محصولات حاصل از pcr را تخلیص کرده و سپس داخل یک کلونینگ وکتور مناسب وارد می کنیم کلون های مثبت که حاصل واکنش ligation هستند شناسایی می شوند و سپس توسط آنزیم های محدودالاثر تائید می شود . 4. ساب کلونینگ قطعات مورد نظر در وکتور بیانی:pgem-t easy حال با استفاده از قطعه بزرگی که در مرحله 3 همسانه سازی شده است، چندین pcr انجام شده تا حدودا 1 کیلو باز از نواحی 5’&3’ flankingژن cps1تکثیر شده و در کنار یکدیگر در وکتور pgem همسانه سازی شوند. در مرحله آخریک مارکر آنتی بیوتیکی یا آکسوتروفی در بین این دوقطعه کلون می گردد و سازه نهائی تهیه می شود