پروتئین های ناقل لیپید (ltps) گروهی از پروتئین ها با وزن ملکولی متوسط در نزد گیاهان هستند که دارای پتانسیل های کاربردی به ویژه در سیستم های رها سازی دارو می باشند. هدف از این تحقیق، کلون کردن ژن ltp2 مربوط به گیاه برنج(oryza sativa) در وکتور بیانی pgex-6p-2، در باکتری e.coli (top10) جهت تولید پروتئین به صورت متصل با gst می باشد. از آنجائیکه ژن ltp2 در گیاه برنج را فاقد اینترون است این ژن با کمک تکنیک ژنومیک pcr تکثیر گردید. در سمت 5? پرایمر forward، جایگاه برش bamhi و در سمت 5? پرایمرreverse، جایگاه برش xhoi قرار داده شد. پس از تیمار قطعه تکثیر شده با آنزیم های آندونکلئاز ، قطعه برش یافته به داخل ناحیه bamhi- xhoi وکتور و در پائین دست gst وارد شد. در مرحله بعد وکتور نوترکیب به داخل باکتری e.coli (top10) ترانسفورم شد. به منظور اطمینان از تولید وکتورهای نوترکیب، توالی مربوط به ژن ltp2 توسط تکنیک توالی یابی بررسی و تایید گردید. عصاره باکتری ترانسفورم شده توسط تکنیک sds-page بررسی و بیان ltp در باکتری تایید شد.

ضایعه نخاعی حادثه ای غیر قابل پیش بینی است که منجر به از دست رفتن اعمال حسی و حرکتی مناطق پایین تر از آسیب می گردد. در حال حاضر 90 میلیون نفر در سراسر جهان از آسیب نخاعی رنج می برند. در طی آسیب نخاعی مسیرهای حسی و حرکتی تخریب شده و منجر به ناتوانی شخص مصدوم می گردند. بازگشت اعمال حسی وحرکتی و رفلکسی ازدست رفته به بازیابی نورونی و ترمیم آکسونی یک سری از ژن های ترمیمی موجود در محل آسیب بستگی دارد. ازجمله این ژن ها می توان به اعضای خانواده نوروتروفین ها اشاره کرد که فاکتورهای رشد پیچیده ای هستند و در بقاء , تکثیر و ترمیم نورون ها و رشد آکسونی در سیستم عصبی مرکزی دخالت دارند. nt3 یکی از اعضای خانواده ی نوروتروفینی است که مسئول ماندگاری و بقاء نورون ها و گلیاها در دستگاه عصبی و فاکتور شناخته شده برای تمایز سلول های عصبی طی تکوین در دوران جنینی و همچنین به دنبال جراحت می باشد . در این مطالعه, 54 رات نر از نژاد ویستار, در 6 گروه 9تایی قرار گرفتند. یکی از گروه ها به عنوان شاهد و مابقی به ترتیب به عنوان گروه های آزمایشی 6, 24 و 72 ساعته و همچنین 7 و 10 روزه مشخص شدند. همه ی گروه های آزمایشی تحت عمل جراحی از نوع برش عرضی برروی مهره t9 قرار گرفتند. سپس سر جانور در زمان های مورد نظر جداگردید و نمونه بافت نخاع از محل برش و نواحی بالا و پایین آن برداشته شد. در مرحله ی بعد, از نمونه های بدست آمده rna کلی استخراج گردید. rna استخراج شده به cdna تبدیل شد و نهایتا" میزان بیان ژن مذکور توسط روش کمَی real time pcr بررسی گشت. نتایج بدست آمده از real time pcr و پروفایل بیان ژن nt3 حاکی از آن بود که ژن nt3 در قسمت بالای برش, محل برش و نواحی پایین تر از آن باتوجه به زمان های مختلف پس از اطجاد ضایعه ابتدا افزایش بیان نشان داد و سپس این افزاطش بطان تعدیل شد. در بالای محل برش, میزان بیان ژن مربوطه در زمان 6 ساعت افزایش یافته و در 72 ساعت به اوج خود می رسد و سپس کاهش می یابد و به سطح نرمال می رسد. در محل برش این افزایش میزان mrna از 6 ساعت تا 24 ساعت ادامه داشته و سپس کاهش می یابد ولی به سطح نرمال نمی رسد. در پایین محل برش الگوی بطان ژن متفاوت بود. بدین گونه که در زمان 6 ساعت افزایش یافته سپس در زمان های 24 و 72 ساعت کاهش می یابد و دوباره افزایش بیان در زمان های 7 و 10 روز مشاهده شد. به طور کلی افزایش بیان مشاهده شده پس از آسیب می تواند به علت افزایش ناگهانی در فرایند تخریب نورونی و دمیلینه شدن آکسون ها, افزایش فعالیت میکروگلیاها, کاهش مولکول های مهارکننده ناشی از آن, افزایش واکنش های التهابی و هجوم ماکروفاژها به محل آسیب و درنهایت ایجاد شرایطی مطلوب جهت افزایش بیان ژن های تحریک کننده رشد آکسونی و دخیل در بقاء نورونی باشد. این افزایش ناگهانی پس از اینکه عوامل تحریک کننده کاهش می یابد و تخریب نورونی متوقف می گردد, سیر نزولی پیدا می کند. تفاوت الگوهای بیانی در پایین محل برش می تواند به علت قطع ارتباط با قسمت های بالایی دستگاه عصبی مرکزی و تفاوت در دریافت سیگنال ها از آن نواحی باشد. واژه های کلیدی: ضایعه نخاعی, نوروتروفین3 , بیان ژنی, موش صحرایی(رات), real time pcr

به طور کلی یکی از بیشترین اهداف مطالعات انجام شده در مورد نانو ذرات ، توزیع ان در بدن بوده است. اما در سال های اخیر علاقه مندی های زیادی در ارتباط با چگونگی رفتار نانو ذرات در سطح مولکولی با اجزای سلولی ایجاد شده است.در همین راستا محققین یکی از اثرات تداختی نانو ذرات در سلول ها را به صورت ایجاد پاسخ های اکسیداتیو مشاهده کرده اند، ولی به هر حال اثرات نانو ذرات با توجه به نوع غلظت، نوع شکل ، اندازه و چگونگی در معرض قرار گرفتن با ان می تواند دست آوردهای متفاوتی را به همراه داشته باشد. در بررسی انجام شده در این مطالعه اثرات نانو ذرات نقره صرف نظر از شکل و اندازه، با تاکید بر غلظت و چگونگی در معرض قرار دادن تیمارها مورد توجه قرار گرفت و تغییر بیان ژنی پروکاسپاز 3 به عنوان شاخصی از اثرات تداخلی نانو ذرات نقره مطرح شد.عملکرد متما یز این مطالعه با بررسی ها ی دیگر در سطح مولکولی بر این اساس می باشد که 1) نانو ذرات نقره از طر یق اب اشامیدنی در معرض قرار گرفتند و تزریق درون صفاقی صورت نگرفت، 2) علاوه بر سد مغزی ، سد جفتی هم در نظر گرفته شد، 3) بر خلاف بررسی های قبلی که بیشتر بر روی بیان ژنهای پاسخ های اکسیداتیو مطالعه می کردند، در این آزمایش یکی از ژنهایی که به عنوان مارکر اپوپتوزیس مطرح می باشد را مورد مطالعه قرار دادیم، 4) همچنین اثرات نانو ذرات نقره را به طور جداگانه بر روی جنس نر و مونث بررسی کردیم. مطالعه اخیری توسط rahman و همکارانش (2008 ) نشان داده بود که ذرات نقره با سایز 25nm افزایش معنا داری در تولید گونه های اکسیژنی واکنش پذیر(ros)ایجاد می کند و این پیشنهاد می کند که نانو ذرات نقره به واسطه تولید رادیکال های آزاد و استرس های کسیداتیو منجر به مسمومیت عصبی می شوند. همچنین مطالعات دیگری نشان داده بود که یون های نقره می توانند از سد مغز عبور کرده و بطور ناهمگونی در تمام دستگاه عصبی مرکزی وارد شود(stoltenberg et.al 1994; landsdown, 2007). در هر دو مطالعه فوق اثرات و توزیع نانو ذرات را از طریق تزریق درون صفاقی مورد بررسی قرار داده بودند. در مورد افزایش تولید گونه های اکسیژنی می توان به برهم کنش ذرات نانو نقره و پروتئین های گلوتاتیون و تیرودوکسین اشاره نمود. morones و همکارانش در سال (2005) فعالیت ضد میکروبی ذرات نانو نقره را به دلیل بر هم کنش با گروه های سیستیینی در پروتئینها نسبت دادند. در واقع همین مکانیزم باعث غیر فعال سازی پروتئین های گلوتاتیون و تیرودوکسین می شود که دست اورد این روند تجمع گونه های اکسیژنی واکنش پذیر و اسیب های اکسیداتیو می باشد (chen and schluesen, 2008). . سه نوع مکانیزم متفاوت وجود دارد که به واسطه آن سلول متعهد به خود کشی می شود (barisic et al,2003) : 1. به واسطه سیگنالهای ناشی شده از درون خود سلول 2. به واسطه اتصال فعال کننده های مرگ به رسپتورهای مرگ در سطح سلول 3. به واسطه اثرات گونه های اکسیژن واکنش پذیر و آسیب های اکسیداتیو(barisic et al,2003) همانطور که در بخش نتایج این مطالعه مشاهده شد ژن پروکاسپاز 3 در غلظت ppm 10 در مغز نوزادان رات نسبت به کنترل ها میزان بالایی از بیان را نشان می داد این مشاهده بر این موضوع دلالت می کند که این نانو ذرات نقره سطح اولیه پیشرفت آپوبتوزیس یعنی بیان ژن را به واسطه عبور از سد خونی و مغزی در یک روش وابسته به غلظت تحت تاثیر خو قرار داده است و این القاء نا مناسب آپوپتوزیس ممکن است ناشی از کاهش اکسیداسیون سلولی و تجمع گون های اکسیژنی واکنش پذیر باشد

چکیده نوروتروفین ها، فاکتورهای رشد پلی پپتیدی هستند که توسط سلول های هدف سنتز و ترشح می شوند. چهار عضو از این خانواده شناخته شده اند: فاکتور رشد اعصاب (ngf)، فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (bdnf)، نوروتروفین 3 و نوروتروفین 4. اثرهای زیستی این فاکتورها با اتصال به گیرنده های گذرنده از غشاء آغاز می شود. نوروتروفین ها با دو گروه از گیرنده های سطح سلولی بر همکنش می دهند. گروه اول گیرنده های تیروزین کیناز (trk) است که با میل ترکیبی زیادی به نوروتروفین ها وصل می شوند. trka پاسخ زیستی ngf را وساطت می کند، trkc توسط 3nt فعال می شود و bdnf و 4nt لیگاند ترجیحی برای rkbt هستند. گروه دوم گیرنده ای با میل ترکیبی کم است، 75p، که دومین تیروزین کینازی ندارد. نوروتروفین ها در دستگاه عصبی در تمایز و بقای نورون ها، سازماندهی دوباره ی طناب نخاعی آسیب دیده و تعدیل نورو پلاستی سیته وابسته به فعالیت، ایجاد فیبرهای عصبی، مهار مرگ برنامه ریزی شده ی نورون ها در طول تکوین و رشد آکسون ها دخیلند. آسیب نخاعی (injury spinal cord) یک واقعه ی پیچیده همراه با آسیب های فیزیولوژی متعدد است. از اثرات آسیب نخاعی، مرگ نورون ها، تخریب وسیع آکسونی، دمیلینه شدن نورون های سالم ودست نخورده، التهاب، مرگ سلولی و نقص های شدید حسی وحرکتی می شود. در این تحقیق میزان تغییرات بیانmrna نوروتروفین 4 و گیرنده آن trk-b، در رت ، 6، 24 و 72 ساعت و 7 و 10 روز پس از ایجاد آسیب در محل ضایعه و همچنین بالا و پایین محل ضایعه به روش quantitative real-time pcr بررسی شد. به این منظور rna این ‍ژن ها استخراج و از آن ها cdna ساخته شد و طراحی پرایمر نیز با استفاده از نرم افزار beacon انجام شد. نتایج بدست آمده نشان داد که بیان این ژن ها پس از ضایعه تغییر می کند. به طوری که بیان nt4 در ناحیه بالای ضایعه پس از افزایش در 6 ساعت اول و در مرکز و پایین ضایعه بدون این که افزایش یابد، کاهش می یابد. بیان ژن trk-b نیز در تمام نواحی مورد نظر پس از افزایش در ساعات اولیه شروع به کاهش می کند. پس از ضایعه نخاعی، تجدید عملکردهای کنترل شده بستگی به بازتولید اکسون ها در سرتاسر محل آسیب و تشکیل ارتباطات سیناپسی و عملکردی دارد. اگرچه بازتولید و ترمیم اعصاب بعد از آسیب نخاعی هنوز دشوار است اما نوروتروفین ها به عنوان فاکتورهایی شناخته شده اند که در توسعه ی آکسون های آسیب دیده و افزایش توانایی رشد اکسون ها و نوروپلاستی سیته دخیلند. بیان نوروتروفین ها در نورون هایی که به دلیل بیماری های تخریب اعصاب آسیب دیده اند، تغییر می کند و تعدیل میزان نوروتروفین ها در این بیماری ها می تواند مزایای درمانی داشته باشد. از این رو افزایش اطلاعات در زمینه ی مسیرهای ملکولی و نقش های فیزیولوژیکی فاکتورهای نوروتروفیک می تواند منجر به استفاده از آن ها به عنوان فاکتورهای درمانی شود. کلید واژه ها: نوروتروفین، گیرنده تیروزین کیناز، ضایعه نخاعی، نوروتروفین 4، real-time pcr

پروتئین سبز فلورسنت green fluorescent protein (gfp)، پروتئینی با وزن مولکولی kda 27 شامل 238 اسیدآمینه و دارای ساختار فضایی بشکه ی ? می باشد که برای اولین بار در سال 1962 از ستاره ی دریاییaequorea victoria جداسازی شد. این پروتئین به دنبال تحریک با نور آبی، فلورسنس سبز ساطع کرده و این ویژگی باعث شده تا gfp به عنوان نشانگر برای بیان پروتئین های نوترکیب، گزارشگر برای بیان ژن و به عنوان برچسب برای مشخص کردن جایگاه پروتئین ها در سلول های زنده استفاده شود.gfp به طور ژنتیکی با پروتئین های بسیاری در گونه های مختلف برای تولید مولکول های پایدار که هم فعالیت بیولوژیک اولیه ی خود و هم ویژگی های فلورسنت gfp را حفظ می کنند، ادغام شده است. egfp نوع جهش یافته ای از gfp است که دارای فلورسنسی 35 برابر شدیدتر نسبت به نوع وحشی می باشد. یکی از معمول ترین فرم های آنتی بادی نوترکیب، قطعه ی تک زنجیره ای ناحیه ی متغیر (scfv) می باشد. یک آنتی بادی در فرمت scfv شامل نواحی متغیر زنجیره های سبک و سنگین (vh) و (vl) می باشد که به وسیله ی یک توالی اتصال دهنده به یکدیگر متصل می شوند.scfv می تواند به آسانی در escherichia coli بیان شود. از مزایای scfv نسبت به آنتی بادی کامل نفوذ بهتر به بافت ها به دلیل اندازه ی کوچک تر و امکان پاک سازی سریع تر کمپلکس های ایمنی تشکیل شده می باشد. در مقایسه با آنتی بادی طبیعی scfv به گلیکوزیلاسیون نیاز ندارد و می تواند به طور فعال در باکتری که فاقد سیستم تغییرات پس ترجمه است، تولید شود. cd4گلیکوپروتئین غشایی با وزن مولکولی تقریبیkda 55 است که در سطح زیر گروه های خاصی از لنفوسیت هایt بروز می یابد. cd4 یک کمک گیرنده بوده که با گیرنده های سلول t همکاری می کند. علاوه بر این، cd4 گیرنده ای برای ویروس نقص ایمنی انسان (hiv) نیز می باشد. در پژوهش حاضر یک ساختار ژنتیکی برای تولید کارامد یک آنتی بادی فلورسنت به صورت یک پروتئین نوترکیب در e.coli با ادغام egfp به scfv آنتی بادی ضد cd4 طراحی و ساخته شد. ژن egfp پس از تکثیر به وسیله ی pcr و برش با آنزیم های محدود کننده ی خاص، در انتهای n مولکول scfv کلون شد. صحت کلونینگ با کلنی-pcr و هضم آنزیمی تأیید شد. سپس تعیین توالی به منظور اطمینان از عدم وقوع جهش در ساختار و نیز صحیح بودن قالب خواندن egfp-scfv انجام گرفت. در نهایت بیان فلوبادی بعد از ترانسفورم کردن e.coli hb2151 و القای پلاسمید با iptg به وسیله ی تکنیک dot blotting وwestern blotting با استفاده از آنتی بادی ضدegfp انجام شد.

کشف پروتئین های انتقال دهنده لیپیدها (ltp) به حدود 30 سال پیش بر می گردد. این پروتئین ها انتقال لیپیدها را از یک غشای دهنده به یک غشای گیرنده تسهیل می کنند و به دو زیرگروه ltp1 و ltp2 تقسیم می شوند. پروتئین مذکور به دلیل عملکرد غیر اختصاصی،ns-ltp نیز نامیده می شود. این پروتئین فعالیت ضدقارچی و ضدباکتریایی دارد. از این پروتئین می توان در ساخت حسگرهای زیستی و تکنولوژی انتقال دارو استفاده کرد. هدف مطالعه حاضر، بهینه سازی شرایط لازم جهت تولید پروتئین نوترکیب ltp در یک سویه مناسب و مستعد شده از کلی باسیل است. پروتئین نوترکیب ltpدر مراحل بعد خالص شده و بر روی آن مطالعات پروتئومیکسی به منظور شناسایی ویژگی های آن صورت خواهد گرفت. در این بررسی وکتور بیانی (pgex-6p-2) که در آن ژن ltp در مجاورت ژن gst (گلوتاتیون-s- ترانسفراز) قرار داده شده است به کارگرفته شد. وکتور نوترکیب به درون سویه مناسب e. coli ترانسفورم شدند. سلول های باکتریایی پروتئین نوترکیب متصل به gst را در محیط کشت lb بیان کردند. سلول های لیز شده به وسیله سونیکاسیون، سانتریفوژ شده و سوپرناتانت حاصله جمع آوری و در سوسپانسیون گلوتاتیون آگارز انکوبه شدند. ذرات گلوتاتیون آگارز با بافر شسته و نتیجه، با الکتروفورز sds-page بررسی گردید. رنگ آمیزی با رنگ کوماسی برلیانت (cbb) به منظور تشخیص و شناسایی باندهای پروتئینی ژل ها صورت گرفت

کشور ایران با دارا بودن تنوع آب و هوایی گسترده و ذخایر ژنتیکی گیاهی فراوان به عنوان یکی از غنی ترین کشورها از نظر امکانات و استعدادهای طبیعی بشمار می رود. هم چنین ایران خاستگاه اصلی و یکی از مراکز مهم تنوع گونه های گون می باشد. گونه گون سفید (fischer astragalus gossypinus) مولد کتیرا، به خانواده پروانه آسا (papilionaceae) تعلق دارد و به طور عمده در قاره آسیا انتشار دارد. این گونه در کشورهای ایران، عراق، ترکیه، لبنان و سوریه انتشار دارد. مهمترین رویشگاه های گونه های گون مولد کتیرا در مناطق کوهستانی منطقه ایران و توران (به ویژه ارتفاعات البرز و زاگرس) واقع است. رویشگاه های گون در استان اصفهان حدود 3/31 درصد از سطح این استان را تشکیل می دهند. گون سفید بیشتر از نظر ریخت شناسی و اکولوژیکی بررسی شده است. در این تحقیق خصوصیات ژنتیکی جمعیت های گون سفید در گون زار های غرب استان اصفهان بررسی و مقایسه گردید؛ نتایج حاصل از چنین مطالعاتی می تواند در اصلاح نژاد، تولید و افزایش پایه های گون با کیفیت کتیرای بالا، احیای رویشگاه های تخریب شده یا توسعه رویشگاه های گون مورد استفاده قرار گیرد. به این منظور نمونه های گون سفید از شش مکان مرتعی در گون زار های استان اصفهان شامل: مراتع رحمت آباد خوانسار، قلعه جمال گلپایگان، مراتع بتلیجه و هندوکش از توابع فریدن، موسی آباد تیران و کرون و تنگ بیدکان لنجان جمع آوری شد. ژنوم نمونه ها با استفاده از روش ctab استخراج و کیفیت dna استخراج شده بر روی ژل الکتروفورز بررسی گردید. غلظت dna نیز به روش اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد. پس از اطمینان از کیفیت dna بدست آمده، ژنوم تکثیر شد. برای انجام واکنش تکثیر دو پرایمر رفت و برگشت از طریق نرم افزار (oligo6) طراحی گردید. واکنش pcr روی قسمتی از ژن cngc4 انجام شد. پس از انجام تکثیر، محصولات pcr بدست آمده روی زل الکتروفورز بررسی شد. تصاویر الکتروفورز نشان داد که قطعات تکثیر یافته ژنی به دلیل یکنواختی از نظر توالی و تناوب، بر روی ژل به صورت یکنواخت و با وزن مولکولی برابر قرار گرفتند. سپس محصولات تکثیر سکانس شد. نتایج حاصل از ترادف یابی ژن cngc4 نشان دهنده تشابه ژنتیکی بین جمعیت های گون سفید بود. با توجه به تشابه ژنتیکی، جمعیت های گون سفید مورد مطالعه به عنوان یک ژنوتیپ معرفی می شوند. هم چنین ژنوم گون سفید با گون-های دیگر از نظر ژنتیکی مقایسه شدند. نتایج با استفاده از آنالیز خوشه ای و به روش upgma وجود سه گروه عمده a، b و c را در بین گون ها نشان داد. بنابراین با توجه به یافته های این تحقیق و هم چنین نتایج بدست آمده از بررسی های قبلی در خصوص کمیت و کیفیت محصول کتیرای این گونه در مکان های مورد مطالعه، می توان نتیجه گرفت از آنجا که گون سفید دارای میدان اکولوژیک و دامنه بردباری محدودی است، وجود تفاوت در صفات کمی و کیفی صمغ کتیرای گون سفید ناشی از تاثیر عوامل زیست محیطی بر فیزیولوژی و عملکرد گیاه گون است و به نظر می رسد ارتباطی به صفات زنتیکی و نقش مدیریت ژن گون سفید ندارد.

پلاسمیدها انواعی از ناقلهای غیر ویروسی هستند که برای انتقال ژن بکار می روند. پلاسمید های معمول که در ژن درمانی استفاده می شوند، از دو قسمت تشکیل شده اند که عبارتند از توالی های باکتریایی و واحد نسخه برداری که حاوی ژن مورد نظر و توالی های لازم برای بیان آن در سلول های یوکاریوتی می باشد. توالی های باکتریایی از جمله مبدا همانندسازی باکتریایی و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک برای تکثیر و غربالگری در باکتری لازمند اما این توالی ها می توانند سبب ایجاد مشکلات جدی در زمینه ایمنی زیستی شوند. وجود توالی های باکتریایی در پلاسمید ها علاوه بر ایجاد مشکلات ایمنی، بیان ژن را نیز کاهش می دهند، دلیل اصلی این کاهش بیان ، این است که با گذشت زمان توالی های باکتریایی توسط پروتئین های خاموش کننده در سلول های یوکاریوتی شناسایی می شوند و در اثر قرار گرفتن این پروتئین ها هتروکروماتینی می شوند . با گذشت زمان به علت وجود اتصالات کووالانسی بین توالی های باکتریایی و توالی های یوکاریوتی، ژن مورد نظر نیز هتروکروماتینی شده و خاموش می شود. بر همین اساس وکتورهای minicircle ساخته شدند. وکتور های minicircle پلاسمید هایی هستند که توالی های باکتریایی آن ها، به واسطه ی یک نوترکیبی داخل مولکولی حذف شده است. در این مطالعه ابتدا یک حامل minicircle حاوی ژن مقاومت به پورومایسین (puro) ساخته شد. به این منظور ابتدا یک پلاسمید والدی ساخته شد که حاوی ژن اینتگراز ?c31 قابل کنترل با پروموتر قابل القای arabad ، توالی های attp وattb اختصاصی ژن اینتگراز?c31 در دو طرف ژن puro و توالی های لازم برای بیان آن ، یک شاخص انتخابی برای غربالگری در باکتری ها و توالی شروع برای همانند سازی در باکتری می باشد. با القای بیان اینتگرازتوسط آرابینوز، فرآیند نوترکیبی توسط اینتگراز صورت گرفت و minicircle حاوی ژن puro در باکتری e. coli ساخته شد. هدف از ساخت این وکتور استفاده از آن در غربالگری رده های سلولی پایدار بود. در این مطالعه، وکتور minicircle حاوی ژن egfp نیز ساخته شد. برای ساخت وکتور minicircle حاوی ژن egfp، ژن egfp به همراه پروموتر cmv جایگزین ژن puro و توالی پروموتری در پلاسمید والدی گردید. یکی از خصوصیات این وکتور این است که پس از ژن egfp چندین جایگاه برش برای آنزیم های محدود کننده دارد، بنابراین از این وکتور می توان برای ساخت وکتور های minicircle حاوی ژن های مختلف دارای قابلیت ردیابی با استفاده از خاصیت فلورسنت پروتئین egfpاستفاده کرد. مطالعات قبلی نشان داده اند که وکتور های minicircle نسبت به پلاسمید های معمول مزایایی دارند از جمله:1- وکتور های minicircle به علت حذف توالی های باکتریایی، بیان بالایی دارند. 2- وکتور minicircle به صورت خارج کروموزومی باقی مانده و در ژنوم الحاق نمی شود. 3- اندازه کوچک این وکتور ها نسبت به پلاسمید های معمول، ورود آن ها را به هسته تسهیل می کند.

پروتئین های غیراختصاصی انتقال دهنده ی لیپید (nonspecific lipid transfer proteins) پروتئین های گیاهی هستند که بر اساس وزن مولکولی به دو گروه nsltp1 و nsltp2 تقسیم بندی می شوند. این پروتئین ها دربرابر عوامل فیزیکوشیمیایی مانند عوامل اکسید کننده و قابلیت اتصال به دارو و حمل آن را دارند. مولکول nsltp2 گیاه برنج ، پروتئینی است که به دلیل توانایی ذاتی عبور از غشا و اتصال به ترکیبات استروئیدی (از جمله برخی ترکیبات داروئی) پتانسیل استفاده در سیستم تحویل داروئی را داراست. به منظور افزایش توانمندی های این پروتئین در چنین سیستمی لازم است که در ساختار آن تغییراتی صورت پذیرد. این تغییرات را می توان با استفاده از ایجاد جهش های مطلوب در ژن کدکننده ی این پروتئین اعمال کرد. در این تحقیق با هدف افزایش خاصیت فلورسانس، در ژن rice nsltp2 جهش های هدایت یافته مکانی ایجاد گردید. پس از طراحی پرایمرهای مناسب با استفاده از روش soe-pcr (single overlap extension-polymerase chain reaction) اسید آمینه تیروزین 45 به تریپتوفان تبدیل شد. توالی جهش یافته با استفاده از پرایمرهای کلونینگ تکثیر شد و آمپلیکون حاصل درون ناقل pet32a الحاق و به داخل سویه بیانی مناسب (bl21(de3)plyss)، منتقل شد. غربالگری اولیه با انجام pcr و در نهایت با استفاده از واکنش تعیین توالی انجام گرفت. پروتئین جهش یافته فیوژن باhis-tag ، تخلیص و وجود این پروتئین با استفاده از وسترن بلات تایید گردید. به نظر می رسد در مطالعات بعدی از این پروتئین بتوان به عنوان یک انتقال دهنده داروئی به خصوص داروهای درمان سرطان استفاده نمود.

گیرنده های کبدی ایکس (lxrs)، از جمله فاکتورهای رونویسی فعال شونده توسط لیگاند هستند که در تنظیم بیان ژن های درگیر در هموستاز کلسترول نقش دارد. هدف از تحقیق حاضر بررسی اثر یک دوره تمرین استقامتی بر بیان ژن گیرنده کبدی ایکس در موش های نر نژاد ویستار است. برای این منظور 12 عدد موش صحرائی نر از نژاد ویستار با وزن تقریبی (13±216 گرم) به دو گروه تجربی و کنترل تقسیم شدند. موش های گروه تجربی به مدت 8 هفته و 5 روز در هفته، با سرعت متوسط 28 متر در دقیقه (شیب صفر درجه) و به مدت 60 دقیقه، تحت تمرین روی نوارگردان قرار گرفتند. 24 ساعت پس از آخرین جلسه تمرینی، موش ها در حالتی که یک شب کامل ناشتا بودند (14 ساعت ناشتایی) بیهوش شدند. مقداری خون از هر موش گرفته شد، بافت کبد سریعا جدا و جهت تخلیص rna در فریزر80- نگهداری شد. برای تعیین میزان تفاوت بین دو گروه از آزمون تحلیل واریانس چند متغیره (manova)، در سطح معنی داری 1 درصد استفاده شد. نتایج افزایش معنادار بیان ژن lxr? و hdl (01/0p<) و همچنین کاهش معنادار ldl، tg، tc (01/0p<) در موش های گروه تجربی نسبت به گروه کنترل را نشان داد. بدین ترتیب به نظر می رسد که یک مکانیزم مثبت تمرینات استقامتی منظم در بهبود نیمرخ لیپیدی (افزایش hdl) و پیشگیری از بیماری های قلبی عروقی، افزایش بیان ژن ?lxr باشد که باعث خروج کلسترول سلولی می شود.

مقدمه: اختلالات التهاب عصبی نظیر ms، با تخریب میلین همراه هستند. سلول های پیش ساز الیگودندروسیتی (opc) در سیستم cns به نواحی دمیلینه شده مهاجرت کرده و پس از تمایز به الیگودندروسیت های بالغ، منجر به بازسازی میلین می شوند. مرگ سلول های opc توسط گونه های فعال اکسیژنی (ros) نظیر h2o2 از عوامل مهم بروز اختلال در این روند و تشدید این بیماری ها می گردند. مطالعات نشان داده است که بیان پروتئین ماتریکس خارج سلولی osteopontin در شرایط التهاب بالا رفته و گیرنده های اینتگرینی اختصاصی آن در سطح سلول های opcs در مراحل فاز حاد بیماری در مدل های موشی به میزان چشمگیری بیان می شوند. بنابراین از آنجا که اثر ضد آپوپتوزی استئوپونتین در سلول های مختلف بررسی و تایید شده است، بررسی اثر این فاکتور در بقای سلول های opc در شرایط القا شده آپوپتوز توسط رادیکال های آزاد نظیرh2o2، می تواند در مسیر درمانی اختلالات همراه با دمیلیناسیون راه گشا باشد. روش کار: پس از کشت سلول های opc در پلیت پوشیده شده با غلظت بهینه استئوپونتین، تیمار سلولی با غلظت بهینه ای از h2o2 جهت القای آپوپتوز صورت گرفته و وضعیت حیات و بقای سلول ها بررسی گردید. جهت بررسی مکانیسم عملکرد استئوپونتین بیان گیرنده های اینتگرینی اختصاصی آن، ژن های کنترل کننده آپوپتوز و فعالیت کاسپاز 3 سلولی نیز مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج و بحث: نتایج نشان داد که h2o2 با القای آپوپتوز بقای سلول های opc انسانی در محیط کشت را مهار می کند در حالیکه تیمار سلول ها با لیگاند استئوپونتین منجر به مهار ژن p53، ژن های پروآپوپتوز bid و bax و افزایش بیان ژن های آنتی آپوپتوز bcl-2 و bcl-xl می شود. علاوه بر این بررسی فعالیت کاسپاز 3 در سلول های opc انسانی تیمار شده نشان داد که h2o2 منجر به فعال شدن کاسپاز اجرایی 3 در سلول های opc انسانی می شود در حالیکه تیمار سلول ها با استئوپونتین از فعال شدن این مسیر کاسپازی جلوگیری می کند. این نتایج حاکی از این است که استئوپونتین به عنوان یک فاکتور ضدآپوپتوز منجر به بقای سلول های opc انسانی در محیط کشت سلول عمل می-کند.

التهاب دستگاه عصبی از عوامل مهم بروز بیماری های نقص یادگیری و حافظه همراه با تخریب شدن نورون ها به شمار می رود. در واقع التهاب دستگاه عصبی زمینه ساز بروز انواع بیماری های نورولوژیکی مثل آلزایمر و مالتیپل اسکلروزیس می باشد. در جریان التهاب فعالیت سلول های دستگاه ایمنی مغز افزایش یافته و با تولید فاکتورهای التهابی سبب تخریب نورون ها می شوند. تحقیق های اخیر نشان داده اسیدهای چرب غیر اشباع مانند آلفا لینولئیک اسید، به عنوان پیش ساز اسیدهای چرب غیر اشباع امگا 3 دارای اثرات ضد التهابی در مغز بوده که می توانند نقش موثری بر تقویت حافظه ایفا کنند. یکی از ژن های موثر در مسیر یادگیری و حافظه مولکول پیام رسان کالمودولین کیناز-2 آلفا می باشد، که به عنوان مولکول حافظه به شمار می رود و در ایجاد و حفظ حافظه بلند مدت نقش اساسی دارد. هدف از این مطالعه برسی اثر اسیدهای چرب امگا 3 بر یادگیری احترازی غیر فعال و بیان ژن کالمودولین کیناز-2 آلفا در شرایط التهاب در ناحیه هیپوکمپ( به عنوان ناحیه اصلی درگیر در حافظه و یادگیری) می باشد. در این پژوهش به منظور ایجاد التهاب در دستگاه عصبی، لیپوپلی ساکارید(lps) به روش درون صفاقی و به دو صورت حاد و مزمن به رات ها تزریق شد. در روش حاد از تک دوز lps به میزان(0.5mg/kg) استفاده شد و در روش مزمن تزریق lps با دوزهای افزایشی، طی ده روز و روزانه دو بار صورت گرفت، سپس به بررسی اثر پیشگیری کننده امگا 3 بر اختلالات حافظه و یادگیری و بیان ژن کالمودولین کیناز-2 آلفا در رات هایی که lps دریافت کرده بودند، پرداختیم. در این تحقیق از دستگاه step-through shuttle box به منظور انجام تست رفتاری و از روش real-time pcr جهت بررسی بیان ژن مورد نظر استفاده گردید. همچنین با استفاده از آزمایش الایزا میزان فاکتور tnf-? به عنوان فاکتور التهابی در بافت هیپوکمپ طی شرایط مختلف اندازه گیری شد. نتایج این تحقیق بیان گر اثر تخریبی دوزهای حاد و مزمن lps بر مرحله به خاطر آوری حافظه و بیان ژن کالمودولین کیناز-2 آلفا و اثر پیشگیری کننده امگا 3 بر این اختلال بود. به طور خلاصه نتایج ما نشان داد که التهاب دستگاه عصبی می تواند توانایی های مرتبط با حافظه و یادگیری را کاهش دهد و به نظر می رسد اختلال در بیان ژن کالمودولین کیناز-2 آلفا نقش اساسی در این رابطه دارد. اسیدهای چرب امگا 3 احتمالاً از طریق تولید ترکیب های رزولوین باعث کاهش یا توقف تولید واسطه های التهابی مانند سایتوکین ها می شوند. بنابراین امگا 3 می تواند به عنوان عاملی موثر در بر طرف کردن مشکلات حافظه و سایر اختلال های نورولوژیک مطرح باشد که این امر نیازمند تحقیق بیشتر می باشد..

pep یک پروتئین پراکسی‍زومی است که در سال 2002 شناسایی شده است. این پروتئین دارای 209 اسید آمینه بوده و در انتهای کربوکسیل خود دارای توالی ski می باشد که سبب ورود این پروتئین به داخل پراکسیزوم می شود. بیان این پروتئین در موش بالغ در بافت‍ هایی نظیر قلب، ماهیچه های اسکلتی و مغز بسیار بالا می باشد. از طرف دیگر بیان این ژن در روند تمایز به عصب سلول های بنیادی جنین موشی تحت تیمار با رتینوئیک اسید افزایش می یابد استفاده از وکتورهای نوترکیب لنتی ویروسی جهت الحاق ژن خاص در سلولهای پستانداران امروزه مورد توجه است. در مقایسه با وکتورهای رتروویروسی، لنتی ویروسها دارای محاسن زیادی هستند. اولا لنتی ویروسها می توانند هم سلولهای دارای قدرت تقسیم و هم سلولهای فاقد قدرت تقسیم را آلوده کنند و دوم ژنوم ترانس ژن خود را به ژنوم میزبان الحاق می کنند و به خاموش شدن در مرحله رونویسی مقاوم هستند. سلول های بنیادی جنینی موش ، سلول های پرتوانی هستند که منشا آن ها از توده داخلی بلاستوسیست می باشد. از مهم ترین ویژگی این سلول ها خودنوزایی می باشد که به آنها توانایی تکثیر نامحدود و تمایز به هر سه لایه جنینی را می دهد و این ویژگی آن ها را به مدل مناسبی برای بررسی تکوین انواع رده های سلولی تبدیل کرده است. در مطالعات قبلی نشان داده شده که بیان ژن pep در بافت مغز در موش بالغ بالا است و در روند عصب زایی تحت تیمار با رتینوئیک اسید بیان ژن pep افزایش پیدا می کند. همچنین به دنبال کاهش بیان این ژن در روند عصب زایی بیان مارکرهای عصبی ?-tubulin iii، map2 کاهش می یابد. نتایج این مطالعه نشان داد با افزایش بیان pep توسط سیستم القایی لنتی ویروسی از ابتدای مرحله عصب زایی به واسطه بیان بسیار بالای pep در تمایز سلول های بنیادی جنین موشی به عصب در روز ششم عصب زایی سبب از بین رفتن اشکال شبه جنینی (embryoid body ) شده و بیان مارکرهای عصبی مانند ?-tubulin iii ، map2 و nestin کاهش می یابد و در نتیجه مانع ایجاد تشکیل عصب های مناسب می شود.

سرطانخون لنفوبلاستیک حاد (all)، رایجترین نوع سرطان در بین کودکان میباشد. مقاومت دارویی چندگانه ( mdr) مهمترین علت شکست درمان و عود در all است. عمدتاً abc ترانسپورترها در این اختلال دخیل هستند. mdr1/abcb1 مهمترین عضو این بالا خانواده است که ممکن است توام با mrp1 (یک abc ترانسپورتر دیگر) و lrp/mvp (یک ترانسپورتر داخل سلولی) منجر به بروز mdr در برخی سلولهای سرطانی شود. نقش این ژنها در all هنوز ناشناخته است. هدف از این پژوهش بررسی پروفایل بیان ژنهای mdr1، mrp1 و lrp در سطح mrna و ارزیابی اهمیت پیشآگهی آنان در all کودکان میباشد. در این پژوهش، نمونهها از خون محیطی و مغز استخوان 28 کودک مبتلا به all در زمان تشخیص اولیه و 15 نمونه کنترل (طبق استانداردهای اخلاقی و دستورالعمل بیمارستان سیدالشهداء اصفهان) جمعآوری شد. تخلیص سلولهای تک هستهای خون با استفاده از شیب چگالی فایکول صورت گرفت. استخراج rnaَ و پس از آن، سنتز cdna انجام شد. پروفایل بیان ژنهای mdr1، mrp1 و lrp با استفاده از روش real time pcr ارزیابی و ژن gapdh به عنوان کنترل داخلی به کار گرفته شد. وضعیت حداقل جزء باقیمانده بیماری (mrd یک ساله) به عنوان شاخص پاسخ به درمان مد نظر قرار گرفت. آنالیز دادهها با استفاده از نرم افزارهای graph pad prism 5 و spss 20 انجام شد. نتایج پژوهش حاضر نشان میدهد که پروفایل بیان ژنهای mdr1 و mrp1 در بدو تشخیص، در بیماران با mrd+ (22/1±29/2 و 12/1±70/3) به طور قابل ملاحظهای بیشتر از بیماران با mrd- (21/0±79/0 و 51/0±41/1) (mean±sem، 049/0p< و 031/0p<) بود. نتایج پیشنهاد میدهد که میتوان از پروفایل بیان ژنهای mdr1 و mrp1 به عنوان شاخصهای پیشآگهی در all استفاده کرد. زمانی که مرز جدایی بیان ژنی 5/1 بود، پروفایل بیان mrna ژن lrp تنها در بیماران t-all با وضعیت مثبت mrd (پاسخ نامطلوب به درمان) رابطه داشت ( 04/0p<). روشن شدن رابطه این ژن با مقاومت دارویی چندگانه نیاز به بررسیهای بیشتر دارد. مطالعه حاضر پیشنهاد میهد که سنجش پروفایل بیان mrna ژنهای mdr1 و mrp1 (در بیماران در بدو تشخیص) میتواند شناسایی افراد پرخطر را ممکن ساخته و به تعدیل پروتکلهای درمانی all (به منظور بهبود بازده درمان) کمک نماید.

cdna ی ژن پروتئین پراکسی زومی (pep) یاfndc5،کدکننده ی پروتئینی 209 اسید آمینه ای است که کلونینگ گونه ی موشی آن در سال 2002 میلادی صورت گرفته است. نشان داده شده که بیان pep / fndc5 ، در روند تمایز سلول های بنیادی موشی به ویژه در سلول های پیش ساز عصب، افزایش می یابد. همچنین کاهش بیان pep/fndc5 میزان عصب زایی را در سلول های بنیادی موشی در حدود60% کاهش می دهد. این داده ها در مجموع پیشنهاد می دهند که ممکن است pep/fndc5 در تمایز عصبی نقش ایفا کند. علاوه براین نشان داده شده که کینازهای فعال شونده توسط میتوژن ها ( mapks ) ، که بزرگراه پیام رسانی در مسیرهای پیام رسانی گوناگون هستند، بسته به نوع سلول، نوع القاگر و روش کار، نقش مهمی را در تمایز عصبی ایفا می کنند. نقش pep/fndc5 در عصب زایی ناشناخته است. یکی از روش های مفید در شناسایی نقش یک ژن یا یک پروتئین، یافتن رابطه ی آن با مسیرهای پیام رسانی شناخته شده در فرآیندهای سلولی است. هدف از این پژوهش بررسی این مسئله است که آیا میان فعال شدن mapkها و بیان pep/fndc5 هماهنگی وجود دارد؟ در صورت وجود هماهنگی، می-توان برای درمان بیماری هاینورودژنریتیو ، کاربردهای پزشکی گوناگونی را پیشنهاد داد. در این پژوهش یک روند گام به گام برای بررسی بیان pep/fndc5 با استفاده از real time pcr و فعال شدن mapkها با استفاده از western blot، در روند تمایز عصبی سلول های بنیادی موشی انجام شد که نشان دهنده ی وجود هماهنگی میان بیان pep/fndc5 و روند فعال شدن erk1/2 ، می باشد.

فاکتور رشد گرانولوسیتی-مونوسیتی انسانی(gm-csf)، گلیکوپروتیینی با وزن ملکولیkd 477/14 می باشد. ژن gm-csf بر روی کروموزوم شماره 5 انسانی (5q31.1) قرار دارد. این پروتئین باعث تحریک تکثیر و تمایز سلولهای زاینده گرانولوسیت و ماکروفاژ می شود. پروتئین gm-csfانسانی دارای 144 اسید آمینه می باشد که 17 اسید آمینه آن نقش سیگنال پپتید را برای پروتئین ایفا می نمایند. و تعداد 127 اسید آمینه آن به عنوان پروتئین دارویی با نام مولگراموستیم شناخته می شود. gm-csf دارویی است که با تحریک تولید و تکامل سلول های خونی تاًثیر قابل توجهی در احیاء سلولهای خونی دارد. gm-csf توسط سلول های اندوتلیال، منوسیت، فیبروبلاست و سلول های لنفوسیت t تولید می شود. در این مطالعه برای بیان gm-csf از حاملی موسوم به pet-32(b) محصول شرکت novagen استفاده گردید. این حامل ???? جفت باز اندازه دارد و برای کلون نمودن و بیان بالای پروتئین های متصل شده به تیوردوکسین مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین پروموتور این حامل از نوع t7 است و دارای توالی های قابل شکست his tag و s tag است. در این تحقیق از سویه باکتریاییrosetta-gami (de3) e.coli به عنوان میزبان استفاده شد و به علت وجود توالی پلی هیستیدین متصل به پروتئین مورد نظرمان از کروماتوگرافی تمایلی نیکل جهت خالص سازی استفاده شد. در مرحله اول، cds ژن gm-csf به صورت سنتتیک ساخته شد و در وکتور pet-32(b) قرار داده شد. پس از انتقال به باکتریrosetta-gami (de3) e.coli، در 4 زمان 2، 4، 6 و 8 ساعت و سه دمای 30، 34 و37 درجه سانتی گراد بهینه سازی بیان پروتئین انجام گرفت. محلول حاصله به وسیله page -sds آنالیز شد. همچنین جهت خالص سازی پروتئین مورد نظر از آنزیمی به نام انتروکیناز استفاده شد که این آنزیم کاملا تخصصی برش در جایگاه توالیasp-asp-asp-asp-lys? ایجاد می کند و در نتیجه پروتئین مورد نظرمان به صورت جدا از پروتئین تیوردوکسین با استفاده از page -sds مشاهده شد نتایج این مطالعه نشان داد که بالاترین غلظت پروتئین gm-csf برابر lµg/µ 9/0 مربوط به دمای 34 درجه سانتی گراد و زمان 4 ساعت بود. در مطالعات قبلی غلظت پروتئین gm-csf بین 3/0 تاlµg/µ 8/0 اندازه گیری شده است که پس از بهینه سازی در این مطالعه غلظت بالاتری نسبت به تحقیقات گذشته مشاهده شد.

پروتئین های انتقال دهنده لیپید بصورت غیراختصاصی (nsltps) ابرخانواده ای از پروتئین های ناقل می باشند و قابلیت انتقال انواع لیپیدها مانند: اسیدهای چرب، فسفولیپیدها و کلسترول را دارند. این پروتئین ها شامل دو خانواده: nsltp1 (kd~9) و 2nsltp (kd~7) هستند و می توان آنها را از گیاهان مختلفی مانند برنج جداسازی و خالص نمود. علاقه روزافزونی در زمینه استفاده از پروتئین های متصل شونده به لیگاند به منظور رسانش دارو وجود دارد، به همین منظور پژوهش های زیادی در ضمینه اتصال و انتقال داروها و مولکول های دارای ساختار آبگریز به nsltpها صورت گرفته است. هدف از این پژوهش، مطالعه ساختار فضایی و ویژگی های عملکردی پروتئین nsltp2 و قابلیت اتصال و انتقال برخی از مولکول ها و داروهای آبگریز به این پروتئین از طریق تکنیک های بیوانفورماتیک؛ بررسی امکان شناسایی و خالص سازی پروتئین nsltp2 از برنج ایرانی با استفاده از تکنیک های کروماتوگرافی تعویض کاتیونی و تمایلی آبگریز؛ بهینه سازی شرایط بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب nsltp2 از سویه باکتریای ترانسفورم شده، به منظور استفاده در مطالعات پروتئومیکس بر روی این پروتئین بوده است. در این بررسی ابتدا ساختار سه بعدی پروتئین پیش بینی شد و کیفیت مدل تایید شد، در ادامه قابلیت و امکان اتصال برخی مولکول ها و داروهای آبگریز با استفاده از نرم افزار mvd بررسی شد. برای خالص سازی پروتئین nsltp2 از آرد برنج عصاره گیری شده و در مرحله اول پروتئین های بازی با استفاده از رزین cm-سفارز بعنوان تعویض گر کاتیونی جداسازی شدند و در انتها پروتئین های آبگریز با استفاده از رزین فنیل-سفارز با خاصیت آبگریزی، خالص سازی شدند. برای خالص-سازی پروتئین نوترکیب با تغییر شرایط دمایی، میزان iptg و لاکتوز در محیط القاء شرایط بیان بهینه سازی شد و در ادامه خالص سازی پروتئین نوترکیب از اجسام درون بسته صورت گرفت. نتایج بررسی های بیوانفورماتیک نشان داد، این پروتئین دارای یک حفره آبگریز و انعطاف پذیر در مرکز خود می باشد، مولکول های چرب به این ناحیه متصل و انتقال می یابند. تعداد اتم کربن و طول زنجیره؛ تعداد، موقعیت و حالت پیوند دوگانه در ساختار اسید های چرب در تمایل اتصال این قبیل مولکول ها به پروتئین nsltp2 موثر می باشند. در این تحقیق برای اولین بار مشخص شد، اسید های نوکلئیک و داروهای شبه نوکلئوزیدی، کلسترول و داروهای دارای ساختار حجیم با تمایل بسیار خوب و قابل توجه ای به nsltp2 متصل می شوند. با استفاده از تکنیک ها و روش های حاضر، تخلیص پروتئین مورد نظر به میزان دلخواه صورت نپذیرفت. بررسی بیان پروتئین نوترکیب نشان داد، این پروتئین بصورت اجسام درون بسته در داخل سلول های باکتریایی ذخیره می شود و لازم است خالص سازی پروتئین از این اجسام درون بسته صورت گیرد.

سیستم ایمنی موجودات چند سلولی شامل چندین پلی پپتید کاتیونیک با وزن مولکولی کمتر از 10 کیلو دالتون می‎باشند. در میان پپتید‎های ضد میکروب، دیفنسین‎ها یکی از بزرگ‎ترین خانواده‎ی پپتید‎های ضد میکروب می‎باشند و به واسطه‎ی فعالیت آن‎ها بر ضد باکتری‎ها، قارچ‎ها و بسیاری از ویروس‎ها، به عنوان آنتی‎بیوتیک‎های نسل جدید منفعت بسیار دارند. هدف از این مطالعه طراحی، سنتز، بیان، تخلیص و بررسی خاصیت ضد میکروبی پروتئین bnbd2 بوده است. در این مطالعه‎ی باکتریbl21 حامل وکتور pet-32a(+) که ژن bnbd2 در آن همسانه سازی شده بود استفاده گردید. بیان پروتئین bnbd2 با تغییر در پارامترهای، دمای رشد و غلظت ماده‎ی القا کننده‎ (iptg) با استفاده از سیستم الکتروفورز عمودی (sds-page) بررسی گردید. با استفاده از محیط کشت lb، شروع القا در جذب نوری 8/0 در طول موج 600 نانومتر، غلظت یک میلی مولار ماده‎ی القا کننده‎ی iptg و دمای رشد 30 درجه بیشترین بیان پروتئین به دست آمد. مراحل تخلیص پروتئین با کمک روش شیمیایی شکافت در جایگاه فرمیک اسید و عبور از سانتریکون انجام گردید و اثر ضد باکتریایی پروتئین تخلیص شده بر باکتری‎های گرم مثبت و گرم منفی بررسی گردید. نتایج آزمایش وسترن بلاتینگ نیز نشان داد که پروتئین نوترکیب به طور اختصاصی به آنتی‎بادی mouse anti-(his)6 peroxidase متصل می‎گردد. تشکیل هاله‎ی عدم رشد در محیط‎ کشت مولر هینتون آگار، خاصیت ضد باکتری این پروتئین را نشان می‎دهد.

بیماری پارکینسون نمونه ای از بیماری پیشروند? عصبی همراه با تخریب نورون ها در ناحی? جسم سیاه مغز است. نورون های این ناحیه از مغز مسئول سنتز انتقال دهند? عصبی دوپامین می باشند و با از بین رفتن این نورون ها میزان دوپامین تولیدی نیز کاهش می یابد. تحقیقات گسترده بیانگر این موضوع است که التهاب، استرس های اکسیداتیو و عدم کارکرد میتوکندری نقش بسزایی در ایجاد این بیماری و پیشرفت آن دارند. ppar? به عنوان گیرند? هسته ای در متابولیسم گلوکز و چربی ها نقش اساسی دارد. در سال های اخیر نشان داده شد که این گیرنده می تواند باعث مهار بسیاری از مسیر های التهابی نیز شود. در مدل های آزمایشگاهی نشان داده شد که این گیرنده می تواند از بیان فاکتور های التهابی مانند inos، cox-2،nf?b و اینترلوکین ها جلوگیری بعمل آورد. از طرف دیگر گیرند? هسته ای nurr1 که جزو خانواد?nr4a است نقش بسیار اساسی در تمایز سلول های بنیادی به نورون های دوپامینرژیک دارد. بیان این پروتئین در ناحی? جسم سیاه مغز در بالاترین میزان خود است و با افزایش سن این میزان کاهش می یابد. این گیرنه می تواند پس از فعال شدن به هسته رفته و نقش فاکتور رونویسی را ایفا کند. ژن های مورد هدف آن در مسیر سنتز و انتقال دوپامین در مغز نقش اساسی دارند. کاهش بیان nurr1 و یا وقوع جهش در آن با افزایش احتمال ابتلا به پارکینسون رابط? مستقیم دارد. بنابراین این فاکتور می تواند ابزار خوبی جهت درمان این بیماری باشد. درمان چند دارویی در مقابل درمان های رایج امروزی شیو? جدیدی از درمان است که اجازه می دهد تا با استفاده از ترکیب چند دارو و یا استفاد? همزمان از آن ها بسیاری از بیماری ها را تا حدی درمان کرد. به همین علت با بررسی مسیر های سلولی کنترل شده توسط ppar? و nurr1 می توان با استفاد? همزمان از آگونیست های این گیرنده ها دریچه های جدیدی در جهت درمان بیماری پارکینسون گشود.

annexin a1 یک پروتئین 37 کیلو دالتونی با برخی تاثیرات ضد التهابی است. این پروتئین عضو پروتئین های خانواده annexins است که در سرکوب برخی از مسیرهای سیگنالی در گیر در التهاب کمک می کند. این پروتئین با مهار cpla2 از تولید آراشیدونیک اسید که سوبسترای آنزیم های لیپو اکسیزناژ و سیکلو اکسیژناژ است جلوگیری کرده و مانع تولید گونه های فعال اکسیژن ناشی از فعالیت این آنزیم ها می شود. همچنین در برخی منابع پروتئین به عنوان یک فکتور مقابله کننده با شرایط آپوپتوزی نیز معرفی گردیده است. در این طرح برای بررسی اثرات این پروتئین cds کد کننده پروتئین در وکتور بیانی مناسب که از انواع وکتورهای دارای توالی s/mar است کلون گردیده است. برای رد یابی پروتئین در پائین دست cds, توالی flag که یک توالی 8 اسیدآمینه ای است با جایگزینی در پرایمر reverse تعبیه شده است. وجود توالی s/mar در وکتور باعث اتصال آن به داربست هسته ای شده و در نتیجه احتمال از دست رفتن وکتور در هر تقسیم سلولی از بین خواهد رفت که بیان طولانی مدت ژن را در سلول های هدف باعث می شود.

یکی از پلیمر های مورد توجه در زمینه مهندسی بافت پلی لاکتیک گلایکولیک اسید (plga) است. plga دارای خواص مطلوب زیست سازگاری و زیست تخریب پذیری می باشد ولی دارای خواص سطحی مطلوب برای چسبیدن، تکثیر وگسترش سلول ها نمی باشد. به همین دلیل پلیمرهای طبیعی و مواد معدنی طبیعی را به منظور بهبود برهم کنش بین سلول و داربست و همچنین بهبود خواص مکانیکی به داربست اضافه می کنند. در این تحقیق، ابتدا نانوالیافی از plga، مخلوط plga/gelatin و مخلوطplga/nano silica به روش الکتروریسی تهیه شد. بررسی مورفولوژی نانوالیاف حاصل با میکروسکوپ الکترونی روبشی (sem) نشان داد که بهترین غلظت برای الکتروریسی plga غلظت17% (w/v)، برای مخلوط plga/gelatin غلظت 17% (w/v) با نسبت (75:25) و برای مخلوط plga/nano silica غلظت 17% (w/v) و مقدار 5 و 10 درصد وزنی نانو سلیکا می باشد. سلول-های پیش ساز عصبی pc12 به منظور بررسی زیست سازگاری و سمیت وب های مذکور و بررسی رشد و تکثیر این سلول ها بر روی داربست کشت داده شدند. نتایج میکروسکوپ الکترونی روبشی sem و آنالیز mts assay نشان داد هیچ یک از داربست های تولیدی باعث سمیت نشدند افزایش ژلاتین به داربست plga باعث چسبندگی، رشد و تکثیر بهتر سلول ها و ایجاد زواید سلولی بیشتر شد. و همچنین افزایش نانو سلیکا باعث بهبود خواص مکانیکی داربست وافزایش رشد و تکثیر سلول های پیش ساز عصبی pc12 برروی داربست شد.

دی-آمینواسید اکسیداز (daao) یک فلاووآنزیم پراکسیزومی حاوی فلاوین آدنین دی نوکلئوتید است که دآمیناسیون اکسیداتیو اسیدهای آمینه ی نوع دی را کاتالیز می کند. این آنزیم کاربرد های بسیاری در طراحی حس-گرهای زیستی، تولید آنتی بیوتیک سفالوسپورین cو چندین ترکیب ارزشمند دارویی و در تشخیص و پیشگیری چندین بیماری از جمله سرطان دارد. اگرچه این آنزیم ها به طور وسیع از میکروارگانیسم ها تا انسان گسترده اند، اما عموما آنزیم های میکروبی به دلیل وجود مزایای بسیار نیازهای صنعتی را رفع می کنند که در این میان جنس فوزاریوم جایگاه ویژه ای دارد. هدف از این مطالعه کلون سازی توالی نشانه ی ترشحی فاکتور آلفای مخمری به همراه ترادف کدکننده ی آنزیم دی-آمینواسید اکسیداز از منبع قارچ فوزاریوم اکسیسپوروم در میزبان یوکاریوتی ساکارومایسس سرویزیه به منظور بیان ترشحی آنزیم مورد نظر بود. پس از طراحی پرایمرهای اختصاصی، توالی نشانه فاکتور آلفای مخمری با استفاده از روش pcr تکثیر شد. قطعه ی تکثیر شده سپس در وکتور شاتل بیانی p316tdh3 کلون گردید. پس از تأ یید کلونینگ،cdna دی-آمینواسید اکسیداز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. بررسی میزان هماهنگی کدون های مورد استفاده در cdna تکثیر شده در مقایسه با کدون های مورد استفاده در میزبان نشان داد که این پروتئین نمی تواند به طور موثر در میزبان ساکارومایسس بیان شود. از این رو پس از بهینه سازی کدون ها این قطعه سنتز شد و سپس در پلاسمیدp316tdh3 الحاق و در میزبانe.coli dh5? ترانسفورم گردید. پس از آن پلاسمید نوترکیب p316tdh3-?-matf-dao به میزبان ساکارومایسس سرویزیه منتقل شد. تعیین توالی قطعه سنتز شده صحت توالی و عدم وجود موتاسیون در آن را اثبات کرد. نتایج حاصل از کلونی pcr و برش های آنزیمی تأیید کننده کلون سازی قطعات در وکتور هدف می باشند.

مولتیپل اسکلروزیس بیماری مزمن التهابی و تخریب کننده ی میلین است که دستگاه عصبی مرکزی را درگیر می کند. سلول های cd4+ t گروهی از سلول های دستگاه ایمنی اکتسابی به حساب می آیند که با مشارکت سایر سلول های دستگاه ایمنی، نقش مرکزی در بروز پاسخ های ایمنی علیه عوامل بیگانه دارند. زیررده های سلولی cd4+ t نقش مهمی در بیماری زایی نه تنها بیماری مولتیپل اسکلروزیس بلکه اکثر بیماری های خود ایمن دارند. یکی از زیررده های سلول های cd4+ t، زیررده سلولی th17 می باشد که نقش پاتوژنیک آن در اکثر بیماری های خود ایمن از قبیل مولتیپل اسکلروزیس، روماتوئید آرتریتیس، پسوریازیس، لوپوس، التهاب روده ای، دیابت خود ایمن و آسم مشاهده و گزارش شده است. مطالعات نشان می دهد در بیماران مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس جمعیت زیررده سلولی th17 و در نتیجه سطح بیان ژن il17 در سلول های تک هسته ای خون محیطی، در فاز عود نسبت به فاز بهبودی، افزایش می یابد. mirnas، گروه جدیدی از rna های غیر کد کننده و تک رشته ای به طول تقریباً 20 الی 25 نوکلئوتید هستند که نقش محوری در تنظیم فرآیند های سلولی و نموی دارند. تا کنون مطالعات متعدد پروفایلینگ بیان mirnas در خون، سلول های تک هسته ای خون محیطی، لنفوسیت ها و یا بافت های درگیر دراکثر بیماری های خود ایمن از قبیل مولتیپل اسکلروزیس، روماتوئید آرتریتیس، بیماری التهاب روده ای و دیابت خود ایمن صورت گرفته است. در این طرح تحقیقاتی ابتدا با انجام مطالعات بیوانفورماتیک پیش بینی میانکنش mirna-mrna بین mirnas ی تغییر بیان نشان داده در بیماری های خود ایمن و تنظیم کننده های مثبت و منفی تمایز زیررده سلولی th17، mir-26a به عنوان mirna ای که احتمالاً با مهار ترجمه تنظیم کننده های منفی تمایز زیررده سلولی th17 از قبیل pten و tsc1، می تواند نقش القاکننده در تمایز این زیررده داشته باشد، کاندید گردید. پیش از این افزایش بیان mir-26a در سلول های تک هسته ای خون محیطی بیماران مبتلا به روماتوئید آرتریتیس و نیز سرم و نمونه های بافتی افراد مبتلا به بیماری دیابت خود ایمن و التهاب روده ای، گزارش شده بود. در این مطالعه برای اولین بار سطح بیان نسبی mir-26a در سلول های تک هسته ای خون محیطی بیماران مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس عودکننده-بهبود پذیر در مقایسه با افراد سالم با روش real-time pcr مورد ارزیابی قرار گرفت. از آنجایی که که مشخص شده است جمعیت سلول های th17 در فاز عود نسبت به فاز بهبود افزایش می یابد، انتظار می رود در صورتی که mir-26a در تمایز این زیرده سلولی نقش القا کننده داشته باشد همین الگوی بیان را نشان دهد. نتایج نشان داد بیان نسبی mir-26a در فاز عود بیماری مولتیپل اسکلروزیس نسبت به با فاز بهبود و نیز در مقایسه با افراد سالم، به طور معنی داری افزایش می یابد. این نتایج تایید کننده ی نقش القا کننده ی mir-26a در روند تمایز زیررده سلولی th17 می باشد.

cdna مربوط به ژن fibronectin type iii domain containing 5(fndc5) در سال 2002 به عنوان پروتئین پراکسیزومی شناخته و همسانه سازی شده است. این پروتئین کد شونده دارای 209 اسید آمینه بوده که بیان آن در موش بالغ در بافت ‍ هایی نظیر قلب، ماهیچه های اسکلتی و مغز بسیار بالا می باشد. از طرف دیگر بیان این ژن در مسیر تمایز ماهیچه ی اسکلتی افزایش می یابد. همچنین بیان این ژن در روند تمایز به عصب سلول های بنیادی جنینی موش تحت تیمار با رتینوئیک اسید افزایش می یابد. با توجه به این مسئله بررسی بیان این ژن در روند تمایز سلولهای قلبی نکته ای با اهمیت به نظر می رسد زیرا با بررسی افزایش یا کاهش بیان این ژن می توان پی به مکانیسم ملکولی این ژن در روند تمایز قلبی سلولهای بنیادی پی برد. به همین دلیل در این مطالعه بر آن شدیم تا با القای افزایش بیان این ژن به نقش این ژن در روند تمایز سلولهای بنیادی موشی به سلولهای قلبی پی ببریم. استفاده از وکتورهای نوترکیب لنتی ویروسی جهت الحاق ژن خاص در سلولهای پستانداران امروزه مورد توجه است. در مقایسه با وکتورهای رتروویروسی، لنتی ویروسها دارای محاسن زیادی هستند. اولا لنتی ویروسها می توانند هم سلولهای دارای قدرت تقسیم و هم سلولهای فاقد قدرت تقسیم را آلوده کنند و دوم ژنوم ترانس ژن خود را به ژنوم میزبان الحاق می کنند و به خاموش شدن در مرحله رونویسی مقاوم هستند. در این مطالعه با اضافه کردن داکسی سیکلین به محیط کشت سلولهای حاوی وکتورplvx-tight-puro-fndc5 و plvx -tet-on بیان ژنfndc5 افزایش یافت که این افزایش بیان توسط دستگاه real time pcr به طور کمی تعیین گردید و سپس باتمایز این سلولها به کاردیومیوسیت همراه با افزایش بیان fndc5، بیان مارکرهای مزودرم قلبی، پیش ساز قلبی و مارکرهای قلب بالغ بصورت کمی در برابر گروه کنترل بررسی گردید و با تکرار این آزمایش بصورت سه بار تکرار صحت داده ها را با روشهای آماری معین شد. نتایج این مطالعه نشان داد با افزایش بیان fndc5 توسط سیستم القایی لنتی ویروسی در ابتدای مراحل تمایز قلبی سلول های بنیادی جنین موشی به دنبال بیان بالای fndc5 مارکرهای مزودرمی، مزودرم قلبی، پیش ساز قلبی و مارکر های کاردیومیوسیت بالغ افزایش می یابند بنابراین می توان گفت افزایش بیان بالای ژن fndc5 سبب تقویت لایه مزودرم با بیان مارکرهای مزودرمی می شود و سبب از بین رفتن لایه اکتودرم و اندودرم می شود. با توجه به نتایج فوق الذکر به نظر می رسد که افزایش بیان ژن fndc5 در تمایز سلولهای بنیادی به سلولهای قلبی موثر بوده و بنابراین در این تمایز دارای نقشی قابل ذکر می باشد.

پادتن ها ابزارهای قدرتمندی برای مطالعه ی عملکرد، مکان یابی و میان کنش پروتئین ها هستند. هم چنین این مولکول ها به طور گسترده برای اهداف تشخیصی و درمانی نیز به کار می روند. پادتن ها معمولاً برای اهداف تحقیقاتی و تشخیصی با مولکول های فلورسنت نشان دار می گردند. اگر مولکول فلورسنت مورد نظر یک پروتئین نوترکیب باشد در این حالت مولکول حاصل فلوبادی نامیده می شود. در این پژوهش، ابتدا قطعه ی تک زنجیره ای ناحیه ی متغیر پادتن ضد گیرنده ی cd4 انسانی که به پروتئین فلورسنت سبز متصل شده است، توسط دو آنزیم ecor? و nco? از ناقل pab1 استخراج گردید. سپس قطعه ی مورد نظر به منظور یافتن ناقل بیانی مناسب، در ناقل های pet26b و pcantab5e همسانه سازی شد و ناقل های نوترکیب ایجاد شده به منظور یافتن سویه بیانی مناسب در چندین سویه از باکتری اشرشیا کلی ترانسفورم گردیدند. ورود قطعه ی مذکور به داخل هر دو ناقل به وسیله ی واکنش کلنی-pcr و هضم آنزیمی دوگانه تأیید شد. سپس بیان اولیه ی فلوبادی با روش فلوسیتومتری بررسی گردید و بر اساس نتایج به دست آمده باکتری اشرشیا کلی سویه ی bl21 حاوی ناقل pet26b نوترکیب برای بهینه سازی تولید فلوبادی انتخاب شد. هم چنین بیان فلوبادی مذکور توسط تکنیک های sds-page، وسترن بلات، دات بلات و الیزا تأیید شد. به منظور بهینه سازی تولید فلوبادی 6 پارامتر شامل دما در سطوح 14، 18، 24 و ?c30 ، زمان های پس از القا در سطوح 6، 12، 18 و 24 ساعت، غلظت iptg در سطوح 0، 75/0، 1 و mm5/1، محیط کشت های lb و tb، درصد های مختلف اتانول و گلیسرول انتخاب شد. برای طراحی آزمایش های بهینه سازی از روش تاگوچی استفاده شد. میزان بیان فلوبادی در هر آزمایش به صورت سه بار تکرار و با روش فلوسیتومتری اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که. غلظت mm1 iptg، دمای ?c18 و زمان پس از القای 18 ساعت بیشترین تاثیر را در تولید فلوبادی داشته اند. سپس فلوبادی حاصل با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل خاص سازی شد. هم چنین در این پژوهش تولید پروتئین egfp نیز بهینه سازی شد، که بر اساس نتایج به دست آمده دمای ?c30، غلظت mm5/0 از iptg و محیط کشت lb بیشترین تاثیر را در تولید پروتئین egfp داشتند. کلمات کلیدی: فلوبادی، بهینه سازی، اشرشیا کلی، ناقل

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.