بیماری لکه موجی گو جه از بیماری های مهم گوجه فرنگی در ایران محسوب میشود.. در دو سال زراعی 86-85 و87-86 اندام های گیاهی مشکوک به آلودگی توسط جنسalternaria در استان های خراسان رضوی و شمالی جمع آوری شدند.از نمونه های آلوده 74 جدایه ی قارچی جدا و خالص سازی شد که از این تعداد 4 جدایه به عنوان bipolaria sp. و 5 جدایه به عنوانstemphyllium sp. شناسایی شدند. با بررسی مشخصات ریخت شناسی از 65 جدایه خالص سازی شده آلترناریا، سه گونهa.alternata , a.tenuissima وa.arborescense شناسایی شد.پس از آزمون بیماریزایی تمامی گونه های آلترناریا بر روی گیاهچه گوجه فرنگی بیماریزا بودند. همچنین جمع آوری اندام های آلوده از 40 مزرعه گوجه فرنگی این استان ها بطور تصادفی جهت تعیین گونه غالب بیماریزا انجام گرفت. نتایج نشان داد که فراوانی گونهa.alternata نسبت به دو گونه دیگر بیشتر بود و به عنوان گونه غالب بیماریزا در این استان ها معرفی گردید. آزمون بیماریزایی بر روی ساقه گوجه فرنگی نشان داد که فقط گونه a.arborescense قادر به ایجاد علایم شانکر ساقه بر روی این گیاه می باشد و این گونه به عنوان عامل بیماری شانکر ساقه گوجه فرنگی در این استان ها معرفی گردید. جهت تعیین تنوع ژنیتیکی درون گونه غالب بیماریزا ، از مارکر ملکولی rapd استفاده گردید. نتایج آزمایشات نشان دهنده تنوع ژنیتیکی بالایی بین جدایه های گونه a.alternata بود و در سطح تشابه 65% ، 16 گروه ژنوتیپی تفکیک گردید

به منظور بررسی ویروس لکه زرد زنبق iysv در تابستان سال 1387 از مزارع پیازکاری و گلخانه های تولید گیاهان زینتی در استان خراسان رضوی نمونه برداری صورت گرفت. تعداد 435 نمونه از مزارع پیاز و تعداد 142 نمونه از گیاهان زینتی جمع آوری شد. گیاهانی که دارای علایم کلروز، نکروز و لکه های برگی بودند در شرایط خنک به آزمایشگاه انتقال داده شدند. سپس به وسیله آزمون سرولوژیکی das-elisa مورد بررسی قرار گرفت و عصاره گیاهانی که مثبت ارزیابی شدند به 4 رقم تـوتون کاشته شده در گلخانه, nicotiana rustica (بدشکلی برگ کلروز و نکروز سیستمیک) , n. benthamiana ,n.tabacum var samson,(کلروز سیستمیک و نکروز) و n. clevelandii(کلروز سیستمیک ) مایه زنی گردید. سپس گیاهان توتون مایه زنی شده به وسیله آزمون das-elisa آزمایش شدند، عصاره گیاهان محک مثبت به 4 رقم پیاز شامل زرد نیشابور، سفید نیشابور، قرمز درگز و قرمز درچه اصفهان مایه زنی گردید که علایمی شبیه به علایمی که در پیازهای آلوده در مزرعه مشاهده شده بود در این گیاهان پدیدار شد. جهت بررسی مولکولی ویروس، استخراج rna از توتون ها و پیاز های آلوده، از دو روشpeg 6000 و استفاده از کیت (plus)rnx™ انجام شد و با استفاده از آغازگر اختصاصی مبنی بر ژن کد کننده پروتئین پوششی در واکنش rt-pcr قطعه ای در محدوده 181 و 139جفت باز تکثیر گردید. نتایج آزمون das-elisa نشان داد که تمام مزارع پیاز به نسبت های مختلفی به این ویروس آلوده بوده و بیماری از شیوع بالایی برخوردار است. iysv در 107 نمونه پیاز ، 7 نمونه گل داوودی و یک نمونه گل زنبق شناسایی شد. این اولین گزارش از وجود این ویروس در مزارع پیاز و گل داوودی در ایران می باشد.

به منظوربررسی ویروس پژمردگی لکه ای گوجه فرنگی(tswv) در سال های زراعی 1387 و 1388 از مزارع استان خراسان رضوی ( شهرستان های مشهد ، نیشابور ، قوچان ، کاشمر ، تربت حیدریه ، فریمان ، رشتخوار ، تخت جلگه ) و گلخانه های گیاهان زینتی شهر مشهد ( گلخانه های توس گل و گلخانه دانشگاه فردوسی مشهد ) نمونه برداری انجام شد. تعداد 636 نمونه گوجه فرنگی و 135 نمونه از گیاهان زینتی جمع آوری شد. نمونه هایی که دارای علایم رنگ پریدگی ، بافت مردگی و لکه های حلقوی بودند جمع آوری شده و در شرایط خنک به آزمایشگاه انتقال داده شدند. در آزمایشگاه به منظور ارزیابی وجود ویروس در نمونه های مشکوک، آزمون سرولوژیکی tas-elisa انجام شد و نمونه های آلوده به ویروس که در آزمون الایزا مشخص شدند به 3 رقم توتون nicotiana rustica ، nicotiana clevelandii و nicotiana tabacum var samson مایه زنی گردیدند و پس از ظهور علائم با آزمون tas-elisa آزمایش شدند . در شناسایی مولکولی نمونه های آلوده به ویروس با استفاده از محلول (-plus)™rnx استخراج rna صورت گرفت و با استفاده از آغازگر اختصاصی در واکنش rt-pcr قطعه ای در محدوده باندی bp276 تکثیر گردید . نتایج حاصل از آزمون tas-elisa نشان می دهد که این ویروس فقط در شهرستان های مشهد ، تربت حیدریه ، تخت جلگه و رشتخوار وجود دارد و در سایر شهرستان های نمونه برداری شده آلودگی مشاهده نشد . tswv تنها در 18 نمونه گوجه فرنگی و 2 نمونه شمعدانی و 1 نمونه رز شناسایی شد . در آزمون مایه زنی مکانیکی ویروس مورد مطالعه تنها در توتون nicotiana tabacum var samson ( تغییر شکل برگ ها و ابلقی ) علائم مشخص بیماری را نشان داد .

ویروس موزائیک زرد کدو (zucchini yellow mosaic virus)، یکی از اعضاء جنس پوتی ویروس بوده و باعث کاهش قابل توجهی در کدوئیان در مناطق مختلف جهان می شود. ویروس موزائیک کدو (squash mosaic virus) باعث ایجاد موزائیک رگبرگ روشنی در خربزه می شود و عضو جنس کوموویروس است. به منظور تعیین شناسایی ویروس موزائیک زرد کدو و ویروس موزائیک کدو در استان های خراسان رضوی، شمالی و جنوبی در تابستان و پائیز 1388 و 1389، نمونه های مشکوک به آلودگی از مزارع مختلف استان جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل گردید. نمونه های آلوده به ویروس، با استفاده از آزمون das-elisa شناسایی شدند. جهت استخراج rna از دو روش استفاده از بافر rna-x-plus و بافر accuzol استفاده گردید و بدنبال آن آزمون rt جهت ساخت cdna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام شد. آزمون pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشت مربوط به ناحیه coat protein ویروس موزائیک زرد کدو و ناحیه protease cofactor ژنوم rna-1 ویروس موزائیک کدو انجام شد. الکتروفورز محصول pcr بر روی ژل آگارز 7/1 درصد ظهور قطعات تکثیر شده مربوط به zymv و sqmv را به ترتیب در محدوده های 970 و 226 جفت باز نشان داد. آنالیز فیلوژنتیک قطعات تکثیر شده نشان می دهد که جدایه های درگز و نیشابور مربوط به ویروس zymv به جدایه syzy-30 (ac. no: gu903892) و جدایه تربت جام مربوط به ویروس sqmv به جدایه y-sqmv (ac. no: ab054688/1) در مقایسه با سایر جدایه های دنیا شباهت بیشتری دارند.

ویروس نکروز ساقه داوودی (chrysanthemum stem necrosis virus) یک ویروس rna دار متعلق به جنس tospovirus و خانواده bunyaviridae می باشد. علائم ویروس روی گیاهان میزبان از علائم سایر ویروسهای این جنس مثل tomato spotted wilt virus قابل تفکیک نیست. علائم روی هر میزبان متفاوت است و می تواند به سرعت تشدید گردد. به منظور بررسی این ویروس نمونه برداری از گلخانه های استان های خراسان رضوی( مشهد و چناران) و مرکزی(محلات) و همچنین مزارع گوجه فرنگی استانهای خراسان رضوی و شمالی(مشهد، چناران، نیشابور، سبزوار، تربت جام، فریمان، نصرآباد) انجام شد. نمونه های مشکوک و دارای علائم (لکه های کلروز و نکروز، لکه حلقوی، موزائیک شدید تا خفیف و نکروز ساقه) جمع آوری و در شرایط مناسب به آزمایشگاه انتقال داده شد. سپس با آزمون سرولوژیکی داس الایزا نمونه های آلوده به این ویروس شناسایی گردید. به دلیل شباهت سرولوژیک برخی ویروس ها در جنس توسپوویروس و به منظور جلوگیری از خطای آزمایش و تایید آلودگی، با استفاده از آزمون مولکولی rt-pcr با کمک آغازگرهای اختصاصی ، قطعه dna در محدوده مورد نظر (bp384) موبوط به ژن پروتئین پوششی این ویروس تکثیر گردید که با نتایج سایر منابع یکسان می باشد.همچنین جهت نگهداری ویروس و مشاهده علائم ویروس، از 3 گونه گیاه محک مختلف استفاده شده و علائم ایجاد شده بر روی هر گیاه ثبت گردید. در دو گونه nicotiana clevelandii و nicotiana glutinosa علایم سیستمیک دیده نشد و فقط لکه های موضعی نکروزه مشاهده گردید ولی در گونه datura stramonium ویروس در گیاه سیستمک شده و در نهایت مرگ گیاه را به دنبال داشت.

ویروس موزاییک هندوانه (wmv) متعلق به جنس potyvirusاز خانواده potyviridaeو ویروس موزاییک پیسک سبز خیار (cgmmv) متعلق به جنس tobamovirus از خانواده virgaviridae است. به منظور شناسایی wmv و cgmmv طی سالهای 1388-1389، از نمونه های برگی مشکوک به آلودگی این ویروسها در مزارع مختلف کدوئیان و گلخانه های خیار استان های خراسان رضوی و شمالی نمونه برداری صورت گرفت. عصاره برخی از نمونههایی که در آزمون سرولوژیکی das-elisa مثبت ارزیابی شده بودند بر روی گیاهان محک مربوط به هر ویروس مایه زنی شد و بر اساس ظهور علایم و بررسی مجدد با آزمون الایزا وجود آلودگی تایید گردید. جهت ردیابی مولکولی، استخراج rna کل تعدادی از نمونههای آلوده به دو روش محلول rnxtm(-plus) و رسوب با peg6000 انجام شد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی منطبق بر ژن کد کننده پروتئین پوششی در واکنش rt- pcr قطعه ای در محدوده 822 جفت باز برای wmvو 486 و 420 جفت باز برای cgmmv تکثیر گردید. محصول pcr مربوط به دو جدایه از ویروس موزاییک هندوانه و یک جدایه از ویروس موزاییک پیسک سبز خیار توالی یابی شدند. این اولین گزارش از وجود cgmmv در استان های خراسان رضوی و شمالی است. ترادفهای بدست آمده پس از هم ردیف سازی چندگانه با برنامه clustalw2 با برخی از توالی های موجود در بانک ژن مقایسه گردیدند. جهت تعیین جایگاه تکاملی و رسم دندروگرام تبارزائی این جدایه ها از روش neighbor-joining نرم افزار mega 4.0 استفاده گردید. طبق نتایج این بررسی جدایه های تعیین ترادف شده wmv با سایر جدایه های wmv بین 99-92% در سطح نوکلئوتیدی و بین 100-96% در سطح آمینواسیدی مشابهت دارند.

در چند سال اخیر، تعداد توسپوویروس ها ی شناسایی شده روبه افزایش بوده و در بسیاری از نواحی مختلف جغرافیایی و در محصولات مختلف، بیماری های ناشی از این ویروس ها نمایان شده است. در ارتباط با وقوع و تاثیر این ویروس ها در ایران، اطلاعات محدودی موجود می باشد. به منظور بررسی توسپوویروس ها در استان های خراسان، از برخی مزارع و گلخانه ها در این استان ها بازدید گردید. به منظور شناسایی توسپوویروس ها، نمونه هایی از آلسترومریا و پیاز در استان خراسان رضوی(مشهد و چناران)، گوجه فرنگی در استان خراسان شمالی(بجنورد) و گوجه فرنگی و پیاز در استان خراسان جنوبی بر اساس علائم آلودگی به این ویروس ها از جمله لکه های بافت مرده روی برگ ها، ساقه ها و دمبرگ ها(در آلسترومریا)، زخم های کلروتیک و بافت مرده چشمی شکل(در پیاز) و بافت مردگی برگ(در گوجه فرنگی)، جهت بررسی بیشتر جمع آوری شدند. آلودگی این نمونه ها به توسپوویروس ها با استفاده از گیاهان آزمون، سرم شناسی ( das-elisa و diba ) و rt-pcr تایید گردید. بر اساس آزمون های سرم شناسی و مولکولی، آلودگی نمونه های آلسترومریا (از مشهد ) و گوجه فرنگی(از بجنورد) به ویروس حلقه زرد گوجه فرنگی(tomato yellow ring virus; tyrv) و نمونه های پیاز(از چناران) به ویروس لکه زرد زنبق (iris yellow spot virus; iysv) تایید گردید. با این حال، هیچگونه توسپوویروسی در نمونه های جمع آوری شده از استان خراسان جنوبی شناسایی نگردید. تجزیه و تحلیل توالی آمینواسید های پروتئین نوکلئوکپسید جدایه های tyrv و iysv شناسایی شده در این تحقیق نشان اد که به ترتیب با توالی آمینواسیدی این پروتئین در جدایه tyrv-t از ایران 99درصد و با توالی آمینواسیدی این پروتئین در جدایه iysv از سری لانکا 98درصد شباهت دارد. همچنین در این تحقیق، tyrv توسط thrips tabaci از بوته های آلوده به سالم منتقل شده و این انتقال با rt-pcr تایید گردید.

ویروس خراشک حلقوی میخک (carnation etched ring virus, cerv)، یکی از اعضای جنس caulimovirus و از خانواده caulimoviridae می باشد. ژنوم ویروس بصورت dna دورشته ای به طول هشت کیلوباز بوده وناقل آن شته سبز هلو (myzus persicae) می باشد. به منظور شناسایی این ویروس در سال های زراعی 1389 و 1388 از گلخانه های میخک (dianthus caryophyllus)و قرنفل (dianthus barbatus) استان های خراسان رضوی (شهرستان های مشهد، نیشابور، چناران، سبزوار) و خراسان شمالی (شهرستان های بجنورد و شیروان) نمونه برداری انجام شد. تعداد 254 نمونه شامل میخک، قرنفل و علفهای هرزی که دارای علائمی نظیر لکه ها و خطوط کلروزیا نکروز، ابلقی یا حتی بدون علائم بودند، جمع آوری شدند. در آزمایشگاه به منظور ارزیابی وجود ویروس در نمونه های مشکوک، آزمون سرولوژیکی das-elisa انجام شد. نتایج نشان داد که 54 نمونه (شامل میخک و قرنفل) از 254 نمونه، آلوده به این ویروس بودند. به منظور تکثیر ویروس، بر روی گیاهان محکsaponaria vaccaria cv. pink beauty و silen armeriaو dianthus caryophyllus cv.joker مایه زنی انجام شد. در آزمون pcr پس از بکار بردن جفت آغازگرهای اختصاصی برای نواحی حفاظت شده از ژن پروتئین پوششی و ژن پروتئین حرکتی ویروس خراشک حلقوی میخک، به ترتیب قطعاتی در اندازه تقریبی1500 و 1000جفت باز تکثیر شدند. رسم درخت فیلوژنی برای ژن پروتئین پوششی و ژن پروتئین حرکتی ویروس cerv با استفاده از نرم افزار mega و بکارگیری روش neighbor joining نشان داد که در مورد ژن پروتئین پوششی شباهت ایزوله ایرانی در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی به ترتیب با ایزوله هلند 9/98% و 3/99% و با ایزوله هند به ترتیب 3/98% و 6/98% می باشد. همچنین در مورد ژن پروتئین حرکتی شباهت ایزوله ایرانی در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی با ایزوله هلند به ترتیب 7/97% و 6/99% و با ایزوله هند به ترتیب 1/96% و 9/98% نشان داده شد. این اولین گزارش از مطالعات مولکولی درباره ویروس خراشک حلقوی میخک در ایران است.

ویروئیدها کوچکترین عوامل بیماریزای شناخته شده هستند که تنها در گیاهان یافت شده اند. آنها rna های حلقوی، تک رشته ای، غیر کد کننده، برهنه و بیماریزایی هستند که برای همانند سازی وابسته به میزبان خود می باشند. ویروئید موزاییک نهفته هلو (plmvd) peach latent mosaic viroid از جنس pelamoviroid و خانواده avsunviroidae، در گونه های مختلف جنس prunus بیماریزا می باشد و دارای گسترش جهانی است. در این مطالعه جدایه های plmvd از باغهای هلو و آلو در ایران برای نخستین بار شرح داده شده و با جدایه های استرالیایی plmvd مقایسه شدند. استخراج rna با استفاده از روشهای trizol و یا به دام اندازی سلیکا (silica capture method) انجام گرفت. شناسایی ویروئید توسط آزمون rt-pcr صورت پذیرفت. محصول خالص شده pcr با استفاده از ناقلpgem®-t easy همسانه سازی شده و پلاسمید نوترکیب حاصل توالی یابی شد. 13 جدایه جدید که طولی بین 338-336 نوکلئوتید داشتند، بدست آمد. تنوع توالی خارج از نواحی سرچکشی، خود شکنندگی و حلقه اتصال این ویروئیدها اتفاق افتاده است. این جدایه ها با جدایه هایی از کشورها و میزبانهای مختلف از نظر فیلوژنتیکی گروه بندی شدند. یکی از 9 جدایه ایرانی دارای شباهت نزدیک با جدایه های استرالیایی بود. عصاره استخراجی اسید نوکلئیک، محصول pcr اندکی طولانی تر از واحد طول و پلاسمیدهای نوترکیب حاصل از یکی از جدایه های استرالیایی، همه آلوده کننده و در نهالهای هلوی مایه زنی شده دارای علایم بودند. مولکولهای ویروئیدی دو نتاج حاصل از کلون آلوده کننده هر کدام 10 جهش در مقایسه با کلون مادری که 30 روز قبل مایه زنی شده بود، نشان دادند که تکرار جهش 10 عدد در هر 338 نوکلئوتید می باشد. ویروئید پوست پینه ای سیب، (assvd) apple scar skin viroid از جنس apscavroid و خانواده pospiviroidae، یکی از مخربترین بیماریهای ویروئیدی در میان درختان میوه دانه دار بوده و می تواند خسارات اقتصادی چشمگیری ایجاد نماید. علایم این بیماری شامل شکاف خوردگی، بدشکلی و خال دار شدن میوه در باغات سیب و گلابی در استان خراسان رضوی مشاهده گردید. نمونه برداری از باغات سیب و گلابی صورت گرفته و rna از برگهای درختان با استفاده از روش به دام اندازی سلیکا استخراج گردید. assvd پس از انجام آزمون rt-pcr در نمونه های حاصل از این باغها شناسایی شد. محصول pcr خالص گردیده و با استفاده از ناقلpgem®-t easy همسانه سازی شده و پلاسمید نوترکیب حاصل توالی یابی شد. پس از انجام آنالیزهای لازم، 12 جدایه جدید این ویروئید از میزبانهای سیب و گلابی در بانک ژن (ncbi) ثبت گردید. این جدایه ها طولی بین 334 -329 نوکلئوتید داشتند. آنالیز فیلوژنتیکی با استفاده از روش neighbor joining نشان داد که جدایه های ایرانی از سایر جدایه های این ویروئید مشخص بوده و در گروه جداگانه ای قرار گرفتند. تنوع ژنتیکی از طریق نشان دادن جایگاه های جهش جدایه های ایرانی بر روی ساختار ثانویه مولکول مرجع assvd مورد بررسی قرار گرفت. این مطالعه اولین گزارش از شناسایی و بررسی صفات ویروئید پوست پینه ای سیب در ایران می باشد.

چکیده: ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی (tomato yellow leaf curl virus, tylcv) در خانواده geminiviridae و جنس begomovirus قرار دارد. این ویروس یکی از مهمترین ویروسهای گیاهی در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان محسوب می شود. به منظور شناسایی و بررسی تنوع ژنتیکی tylcv در قسمت هایی از ایران، در طی سالهای 1388 و 1389، تعداد 545 نمونه گیاهی مشکوک از مزارع و گلخانه های کاشت گوجه فرنگی و 65 نمونه از مزارع کاشت لوبیا، از استانهای خراسان رضوی، خراسان شمالی، خراسان جنوبی، آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی، کرمانشاه و فارس جمع آوری شد. در آزمون pcr پس از بکار بردن دو جفت آغازگر دژنره اختصاصی dna-a جمینی ویروس های منتقل شونده با سفید بالک، قطعه هایی به اندازه تقریبی550 و 1300 جفت باز تکثیر شد و در مجموع 119 نمونه گوجه فرنگی، آلوده تشخیص داده شدند. مناطق آلوده شامل نیشابور، فدیشه، درگز، سبزوار، بجنورد، بیرجند، کازرون و شهرستان صحنه (استان کرمانشاه) بودند. آلودگی به tylcv در هیچکدام از نمونه های لوبیا ردیابی نشد. همچنین هیچکدام از جدایه های مورد بررسی در این تحقیق داری ژنوم دو قطعه ای یا dna? نبودند. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی tylcv با توجه به منطقه نمونه برداری و تنوع علائم، تعداد 22 جدایه از مناطق مختلف کشور همسانه سازی و تعیین توالی شد. قطعه همسانه سازی شده شامل، ناحیه بین ژنی، حدود 200 جفت باز از انتهای 5’ ژن پوشش پروتئینی و حدود 700 جفت باز از ناحیه 5’ ژن پروتئین rep در ژنوم tylcv بود. همچنین در تعدادی از جدایه ها با استفاده از آنزیم فی دی. ان. ای پلیمراز با همانندسازی به روش دایره غلتان، طول کامل ژنوم تکثیر و همسانه سازی گردید و با استفاده از روش primer walking تعیین ترادف شد. در نهایت چهار چوبهای ژنی و نقشه ژنتیکی هر جدایه با استفاده از نرم افزار(invitrogen) vector nti ترسیم گردید. رسم درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار mega5 و بکارگیری روش neighbor joining بر اساس ترادف نوکلئوتیدی کامل ژنوم، ژن پروتئین پوششی و 200 اسیدآمینه ناحیه انتهای آمینی پروتئین rep انجام شد. آنالیزهای فیلوژنتیکی نشان داد که جدایه های استان خراسان رضوی و شمالی در یک گروه قرار گرفته و بیشترین شباهت (1/98%) را با جدایه اورزوئیه استان کرمان (gu076445) دارند. جدایه های جمع آوری شده از خراسان جنوبی مستقلا در گروهی جداگانه و در کنار جدایه جیرفت (gu076452) و جدایه عمان (dq644565) قرار گرفتند. همچنین جدایه های استان کرمانشاه گروه جداگانه ای قرار داشتند و بیشترین شباهت (8/97%) را با جدایه های almeria از اسپانیا (aj489258) نشان دادند. نتایج حاصل نشان میدهد که از زمان اولین گزارش از وجود tylcv در استانهای جنوبی کشور تاکنون، دامنه پراکنش این ویروس به سمت عرضهای جغرافیایی بالاتر کشیده شده به نحوی که وجود درصد بالای آلودگی از شهرستان نیشابور (روستای فدیشه) و درگز در این تحقیق گزارش می شود. همچنین بر اساس نتایج حاصل ویروس فوق در ایران دارای تنوع ژنتیکی زیادی است و تعیین وجود نژادهای نوترکیب جدید در ایران مستلزم مطالعات بیشتر جدایه های ایرانی می باشد. کلید واژه ها: ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی (tylcv)، تنوع ژنتیکی، آنالیز فیلوژنی، ایران.

polymyxa betae keskin یکی از مهمترین ناقلین بیماریهای ویروسی خاکزاد چغندرقند است.این ناقل متعلق به سلسله protozoa و شاخه plasmodiophoromycota بوده و قادر است ،5 نوع بیماری ویروسی مختلف را به چغندرقند منتقل نماید که یکی از مهمترین آنها، بیماری ریشه ریشی یا رایزومانیا است که توسط ویروس) bnyvv beet necrotic yellow vein virus( ایجاد می شود. این بیماری ویروسی انتشارجهانی داشته و در استان های خراسان رضوی و شمالی خسارت زیادی را به کشاورزان وارد می کند. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی و دامنه میزبانی p. betae در دو استان فوق ،از خاک 49 مزرعه در نقاط مختلف استان های ذکر شده، نمونه برداری انجام گردید.تعیین آلودگی نمونه ها به p. betae با دو روش میکروسکوپی (مشاهده میکروسکوپی سیستوسورها در ریشه گیاهچه های چغندرقند کاشته شده) و روش مولکولی nested pcr) و ( pcr انجام شد و نتایج بدست آمده وجود p.betae در خاک 45 مزرعه نشان داد. در بررسی دیگر با کشت 17 گونه گیاهی از علف های هرز غالب در گونه های انتخاب شده دامنه میزبانی این ناقل به کمک دو روش فوق بررسی شد و گونه های سلمه تره ) ( chenopodium album، تاج خروس وحشیamaranthus retroflexus) (، تاج خروس سبز (a.viridis)، خرفه (portulaca oleraceae) و پیچک صحرایی (convolvulus arvensis) به عنوان میزبان های این ناقل معرفی گردیدند. با کشت گیاهان میزبان در خاک آلوده ، ریشه های آلوده به سیستوسورهای p.betae از هریک از علف های هرز تهیه شد.سپس ریشه های آلوده به خاک سترون اضافه گردید و بذر چغندرقند رقم ic در آنها کاشته شد و به کمک مشاهدات میکروسکوپی، گونه های سلمه تره و پیچک صحرایی به عنوان میزبان های آلترناتیو این ناقل تعیین گردیدند. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی p.betae از منطقه ای شامل 18s rdna gene (partial) , its1 , 5.8s rdna gene , its2 , 28s rdna gene (partial) استفاده شد. منطقه فوق به روش pcr تکثیر شد. محصول pcr به کمک توالی یابی مستقیم و یا با استفاده از ناقل/t ptz57r همسانه سازی گردید و پلاسمید نوترکیب حاصل، توالی یابی و سپس 22 جدایه از نواحی مختلف استان های خراسان رضوی و شمالی انتخاب شدند.مقایسه توالی این جدایه ها با 4 جدایه از اروپا نشان داد که جدایه های خراسانی نسبت به یکدیگر دارای 97? تا 99? شباهت بودند و همچنین از 96? تا100? شباهت نسبت به جدایه های اروپایی ثبت شده در بانک ژن برخوردار بودند. فاصله درون گونه ایp.betae در استان خراسان از صفر تا 04/0 درصد متغیر است و فاصله بین جمعیت p.betae در استان خراسان با جدایه های p.betae از اروپا بین صفر تا 20/0 درصد بود . آنالیز فیلوژنتیکی با استفاده از روش neighbor joining در برنامه mega 5.10 نشان داد که جدایه های خراسانی و اروپایی در دو گروه مجزا از یکدیگر در درخت فیلوژنی قرار می گیرند. همچنین ژن 5.8s rrna بهتر از نواحی دیگر توانست جدایه های خراسانی را از یکدیگر تفکیک نماید. در این تحقیق از p.graminis به عنوان گروه خارجی استفاده شد.این مطالعه اولین گزارش از تنوع ژنتیکی p.betae در ایران می باشد.

ویروس موزائیک کلم گل (cauliflower mosaic virus-camv) عضو تیپ جنس caulimovirus از خانواده caulimoviridae می باشد که به عنوان مهم ترین ویروس آلوده کننده گیاهان خانواده کروسیفر در ایران شناخته شده است. به منظور شناسایی و تعیین برخی از خصوصیات بیولوژیکی و مولکولی camv در طی سال های1390-1389 تعداد 358 نمونه گیاهی مشکوک به آلودگی از مزارع کاشت کلم گل و شلغم در استان های خراسان رضوی، شمالی و آذربایجان غربی جمع آوری شد. در ابتدا جهت ارزیابی وجود ویروس در نمونه های مشکوک به آلودگی از آزمون سرولوژیکی das-elisa استفاده گردید. نتایج حاصله نشان داد که از میان 299 نمونه برگی کلم گل، 146 نمونه و از میان 59 نمونه برگی شلغم 36 نمونه آلوده به این ویروس بودند. به منظور تکثیر camv، بر روی گیاهان محک brassica rapa cv. just right، brassica oleracea var. gongylodes و datura stramonium مایه زنی انجام شد. جهت شناسایی، تعیین قابلیت انتقال و بررسی تنوع ژنتیکی در جدایه های ایرانی شناسایی شده در این تحقیق، به ترتیب چارچوب های ژنی چهارم (orf iv)، دوم (orf ii) و ششم (orf vi) ویروس با اندازه های تقریبی 1400, 724 و1500 جفت باز در آزمون pcr تکثیر و از میان نمونه های آلوده شش جدایه جهت تعیین توالی نوکلئوتیدی انتخاب شدند. رسم درخت فیلوژنتیکی برای هر سه ژن با استفاده از نرم افزار mega 5 و بکارگیری روش neighbor joining انجام شد. نتایج حاصل از هم ردیف سازی چندگانه توالی های نوکلئوتیدی چارچوب ژنی دوم جدایه های ایرانی با سایر جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های ایرانی به جز جدایه camv-msh8 دارای بیشترین درصد تشابه با جدایه ای از چین (af140604)، 4/99%-7/98 می باشند و این در حالی است که جدایه camv-msh8 دارای بیشترین درصد تشابه با جدایه ای از اصفهان (ay703456)، 7/98% بود. مقایسه توالی های آمینواسیدی orf ii جدایه های ایرانی با سایر جدایه های موجود در بانک ژن و مشاهده اسید های آمینه گلایسین (g) و ایزولوسین (i) به ترتیب در موقعیت های 94 و 105 آمینو اسیدی، احتمال قابلیت انتقال تمامی جدایه های ایرانی توسط شته ناقل را تأیید نمود. نتایج به دست آمده از هم ردیف سازی چندگانه توالی های نوکلئوتیدی چارچوب ژنی چهارم جدایه های ایرانی با سایر جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های ایرانی دارای بیشترین درصد تشابه در سطح nt با جدایه هایی از مجارستان و چین به میزان 9/96%-5/96 و 4/96%-96 می باشند. آنالیز مولکولی و رسم درخت تبارزایی orf vi مربوط به شش جدایه نشان داد که جدایه های شناسایی شده از کلم گل دارای بیشترین شباهت در سطح nt با جدایه ای از چین به میزان (%6/98-3/98) می باشند و این در حالی است که جدایه جدا شده از شغلم دارای بیشترین شباهت در سطح nt با جدایه ای از میبد یزد (dq870916)، 7/97% بود. شباهت جدایه camv-turnip2 در سطح nt، 5/85%-85 با جدایه های شناسایی شده از کلم گل بوده که در درخت فیلوژنتیکی رسم شده مجزا از این جدایه ها و در گروه i قرار گرفت. این مطالعه اولین گزارش از وجود ویروس موزائیک کلم گل در استان خراسان شمالی و بعضی از شهرستان های استان خراسان رضوی می باشد.

ویروس زردی غربی چغندرقند (beet western yellows virus-bwyv) عضو تیپ جنس polerovirus از خانواده luteoviridae می باشد که به عنوان یکی از مهم ترین ویروس های آلوده کننده چغندرقند شناخته شده است. به منظور بررسی و تعیین پراکنش ویروس زردی غربی چغندرقند (bwyv) طی تابستان و پاییز 1390-1389 تعداد 1145 نمونه از مزارع چغندرقند استان خراسان رضوی جمع آوری شد. نمونه برداری به دو صورت جمع آوری گیاهان دارای علائم زردی، ضخیم و شکننده شدن برگ ها، کوتولگی برگ ها و سیاه شدن برگ ها، چروکیدگی و لکه های نکروتیک برگ ها و همچنین به روش تصادفی جهت تعیین پراکنش انجام شد. برای شناسایی اولیه و تعیین پراکنــــش از روش های ســــرولوژیک tas-elisa و das-elisa استفاده شد که تعداد 200 نمونه آلوده تشخیص داده شد. بطور کلی متوسط میزان پراکنش این ویروس در استان خراسان رضوی برابر 56/17% بود. بیشترین درصد آلودگی در شهرستان چنـــاران با 33/23% و کمترین میزان در شهرستان قوچان با 9/10% مشاهده شد. جهت شناسایی نهایی در جدایه های ایرانی شناسایی شده در این تحقیق، ژن سوم با اندازه ی تقریبی 609 جفــت باز در آزمـــون rt-pcr تکثیر و از میان نمونه های آلوده هفت جدایه جهت تعیین توالی نوکلئوتیدی انتخاب شدند. ترادف های توالی یابی شده در پایگاه اطلاعاتی ncbi ثبـــت شده، با سایر ترادف های جهانی مقایسه شدند. نتایــــــــــــــج همولوژی با استفاده از نـــــــــرم افزارdnaman version 7 مورد بررسی قرار گرفـــــــت که نتـــــایج حاصله نشاندهنده بیشترین شباهت آنها با ایزولــــه ها ی چینــــی (hm804471 ,hm804472) بود. این شباهت در سطح نوکلئوتیدی 5/99% و در سطح آمینواسیدی 3/99% بود. همچنین نتایج به دست آمده از آنالیز فیلوژنتیکی ژن orfiii با استفاده از نرم افزار 2/5mega و بکارگیری روش neighbor joining بیشترین درصد تشابه را با استرین های چینی تأیید نمود. همچنین توالی یابی این ژن استراتژی بیان ژن readthrough را ثابت کرد. هم ردیف سازی توالی آمینواســـــیدی orfiv جدایه های ایرانی با سایر جدایه های موجود در بانک ژن، قابلیت انتقال تمامی جدایه های ایرانی را توسط شته ناقل تأیید کرد.

ویروس های عامل موزاییک خاکزاد در غلات، در مناطق مختلف دنیا از اهمیت بالایی برخوردار می باشند. این ویروس ها در دو جنس bymovirus و furovirus طبقه بندی می گردند. تا کنون هیچ بررسی جامعی در خصوص شناسایی و بررسی خصوصیات مولکولی آن ها در ایران صورت نگرفته است. به منظور شناسایی ویروس های مذکور در طی سال های 1389 تا 1391 تعداد 251 نمونه گیاهی از مزارع جو و 111 نمونه گیاهی از مزارع گندم استان های خراسان شمالی، جنوبی، رضوی، گلستان و آذربایجان غربی با استفاده از سه آنتی سرم(bymv) barley yellow mosaic virus، barley mild mosaic virus (bmmv) و(sbwmv) soilborn wheat mosaic virus مورد بررسی قرار گرفت و نهایتا ویروس ها در تمامی استان ها جز خراسان جنوبی در آزمون الایزا ردیابی گردید. تعدای از نمونه های گیاهی مثبت در آزمون pcr با استفاده از آغازگرهای عمومی bymv1-r1/f1 bammv1-f3 و bammv1-r2، sbwmv-l2 و sbwmv-r2 بررسی شد. سپس به منظور تایید کامل حضور ویروس ها در نمونه های گیاهی محصول pcr مربوط به یک جدایه از هر ویروس تعیین توالی گردید. به منظور بررسی جایگاه فیلوژنی ویروس موزاییک زرد جو تعداد 8 نمونه مربوط به ناحیه کد کننده پوشش پروتئینی و 5 نمونه مربوط به vpg همسانه سازی و تعیین توالی گردید. نتایج نشان داد که جدایه های ایرانی در هر دو این مناطق ژنومی در گروه مجزا از سایر جدایه های دنیا اما نزدیک به جدایه های اروپایی می باشد. در مقایسه دندروگرام رسم شده بر مبنای پوشش پروتئینی و vpg جدایه های ایرانی با جدایه های دنیا نتایج تقریبا مشابه به دست آمد، بنابراین تکامل این دو ژن به صورت موازی صورت گرفته و تنها در مورد vpg به دلیل اینکه شباهت بین جدایه ها کمتر است سرعت تکامل اندکی بیشتر است به منظور تعیین برخی از خصوصیات ژنومی این ویروس توالی کامل rna1 به طول تقریبی 7500 جفت باز و rna2 به طول تقریبی 3500 جفت باز همسانه سازی و تعیین توالی گردید. به طور کلی جدایه ایرانی در دندوگرام رسم شده بر مبنای توالی rna1 بیشتر به جدایه های اروپایی شباهت نشان می دهد در صورتیکه در دندروگرام رسم شده بر مبنای توالی rna2 شباهت به جدایه های آسیایی دارد. بنابراین از نظر تکاملی احتمال می رود جدایه ایرانی به دلیل واقع شدن ایران در موقعیت بینابین اروپا و آسیا، rna1 آن از جدایه های اروپا و rna2 از جدایه های آسیا تکامل یافته باشد. ردیابی و بررسی مولکولی این ویروس ها برای اولین بار در ایران می باشد.

ویروس برگ بادبزنی مو (grapevine fanleaf virus, gflv) متعلق به جنس nepovirus از خانواده secoviridae است. این ویروس یکی از مخرب¬ترین بیماری ویروسی مو در سراسر دنیا است که موجب خسارت جبران ناپذیری در تاکستان¬ها می شود. به منظور شناسایی و بررسی تنوع ژنتیکی gflv در تاکستان¬های استان خراسان¬رضوی در طی سال¬های 1391 و 1392 از تاکستان¬ها و علف هرز های موجود نمونه برداری شد. با استفاده از آنتی¬بادی جدایه ایرانی ویروس در آزمون آلیزا آلودگی به gflv در 114 نمونه مو و 46 نمونه علف هرز تایید شد. در این تحقیق علاوه بر علف¬های هرز مرغ و علف هفت بند برای اولین بار گیاهان قیاق، یونجه¬باغی و بارهنگ به عنوان میزبان¬های طبیعی ویروس برگ بادبزنی مو معرفی شدند. ویروس برگ بادبزنی مو از طریق مایه زنی عصاره آلوده مرغ و قیاق به گیاهان مرغ و قیاق سالم و سلمک انتقال داده شد. با مایه زنی عصاره تاک¬های آلوده به سلمک تولید لکه¬های کلروتیک و رگبرگ روشنی در برگ¬های جدید شد. با استفاده از آغازگر¬های اختصاصی قطعه¬ای بطول 1760 جفت باز مربوط به طول کامل پروتئین پوششی ویروس و 230 نوکلئوتید انتهای ژنوم تکثیر شد. هضم آنزیمی قطعه تکثیر شده با اندونوکلئاز taqi جدایه¬های gflv از خراسان-رضوی را در 18 گروه ژنوتیپی قرار داد. جدایه¬های ایرانی gflv با جدایه¬های سایر نقاط دنیا 36/2±97/88 درصد در سطح نوکلئوتیدی و 72/1±2/95 درصد در سطح آمینواسیدی ژن پروتئین پوششی شباهت داشتند. نتایج آنالیز¬های فیلوژنی بر اساس ژن پروتئین پوششی، جدایه¬های ایرانی gflv را در شاخه¬ای مجزا از جدایه¬های سایر نقاط دنیا قرار داد. همچنین جدایه¬های شرق کشور در گروهی مجزا از جدایه¬های شمال¬غرب کشور قرار گرفتند. که نشان دهنده اثر جدائی جغرافیائی در تکامل gflv است. اسیدآمینه گلایسین 297 (g297) و موتیف r2 که در انتقال اختصاصی ویروس با نماتود نقش دارند در ناحیه مرکزی ژن پروتئین پوششی ویروس صرفنظر از منبع جداسازی به صورت کاملا حفاظت شده بوده که نشان دهنده توانایی انتقال آنها با نماتود x. index است.

ویروس m سیب زمینی (potato virus m- pvm) متعلق به جنس carlavirus از خانواده betaflexiviridae است. پیکره های ویروس رشته ای و دارای یک قطعه آر.ان.ای تک لای مثبت به اندازه 5/8 کیلو باز و شش چهارچوب ژنی است. میزبان اصلی ویروس سیب زمینی و دارای گسترش جهانی است. به منظور تعیین تنوع ژنهای پروتئین پوششی و پروتئین p11 (چارچوب ژنی ششم) در جدایه های ایرانی ویروس pvmاز مزارع سیب زمینی در استانهای خراسان رضوی، خراسان شمالی، کرمان، فارس، اصفهان و همدان نمونه برداری شد. شناسایی گیاهان آلوده به pvm با استفاده از آزمون الیزای مستقیم انجام شد. آر.ان.ای کل از گیاهان آلوده استخراج و در واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، طول کامل پروتئین پوششی و پروتئین p11 ویروس m تکثیر شد. قطعات تکثیر شده پس از همسانه سازی، تعیین توالی و آنالیز توالیها به ترتیب در 30 و 16جدایه انجام شد. نتایج بررسی blast نشان داد که قطعات 915 و 398 جفت بازی تکثیر شده در واکنش زنجیره ای پلی مراز به ترتیب ترادف کامل ژن پروتئین پوششی و p11 ویروس m سیب زمینی است. میزان شباهت این دو ژن در جدایه های ایرانی ویروس m سیب زمینی با جدایه های بانک ژن 98-74 درصد در سطح نوکلئوتیدی و 99-83 درصد در سطح آمینواسیدی بود. در آنالیز فیلوژنی، جدایه های pvm در دو گروه pvm-o شامل جدایه های خراسان شمالی و رضوی و برخی از جدایه های کرمان همراه با جدایه های آمریکای شمالی و pvm-d شامل جدایه های همدان، اصفهان و کرمان با جدایه های اروپایی دسته بندی شدند. در هر گروه شباهت بین اعضاء 100-81 درصد و شباهت بین گروهی 76-74 درصد بود. آنالیزها بر روی توالیهای این دو ژن نشان داد که موتاسیون و موقعیت جغرافیایی، فاکتورهایی موثر در تنوع جدایه های pvm هستند. از سوی دیگر فشار انتخاب منفی نیز تنوع و تکامل این ویروس را هدایت کرده و تغییرات ژنتیکی ایجاد شده را در جمعیت، پایدار می کند. طول کامل ژنوم جدایه ایرانی pvm با آغازگرهای اختصاصی تکثیر و تعیین ترادف ژنوم کامل ویروس pvmبه روش primer walking انجام شد و با رس شمار jx678982 در بانک ژن ثبت گردید. ژنوم کامل جدایه ایرانی pvm با جدایه های موجود در بانک ژن 7/96-1/93 در سطح نوکلئوتیدی شباهت داشت. این جدایه ارتباط نزدیکی با جدایه های آلمان [eu604672] و روسیه [d14449] داشت. ژنوم کامل pvm در ناقل دوگانه pbi 121 تحت کنترل پیشبر 35s ویروس موزائیک گل کلم (camv) قرار گرفت و سازه حاصل به روش agroinoculation به گیاهان سیب زمینی، گوجه فرنگی و توتون مایه زنی شد. 20 روز پس از مایه زنی و بروز علایم در گیاهان، ردیابی ویروس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی pvm انجام شد.

تعداد 436 نمونه مشکوک به آلودگی ویروسی در طول ماه های اسفند 89 و فروردین 90 از مزارع کلزا جمع‎آوری و با آزمون الایزا و آنتی سرم‎های اختصاصی tumv، tcv و tymv مورد سنجش قرار گرفت که از میان آن ها 117 نمونه به tumv و هفت نمونه به tcv آلودگی داشتند. خالص سازی بیولوژیکی یکی از نمونه‏های آلوده (جدایه گوارشک) انجام شد و پس از استخراج rnaی کل گیاه، ژن پوشش پروتئینی ویروس با آزمون rt-pcr تکثیر (bp 986) و تعیین ترادف گردید. بررسی‎های فیلوژنتیکی جدایه گوارشک نشان داد که این جدایه به همراه دو جدایه دیگر ایرانی (irn tra6 و irn ss5) در گروه based-b قرار دارد. جدایه گوارشک (irn gsk) در سطح آمینواسیدی بیشترین تشابه (65/99 درصد) را با جدایه‎ای از ایران ( irn tra6) داشت. در فروردین 1391 علایم یک بیماری مشکوک ویروسی در خردل کاذب مشاهده و آلودگی آن به tumv با آزمون rt-pcr به اثبات رسید. آنالیزهای فیلوژنتیکی مربوط به توالی ژن پروتئین پوششی جدایه خردل کاذب نیز نشان داد که این جدایه (irn hfi) به همراه سه جدایه ایرانی (irn tra6، irn ss5 و irn gsk) در گروه basal-b قرار دارد و درصد تشابه آن در سطح آمینواسیدی 73/93 (با irn gsk)، 08/94 (با irn tra6) و 38/93 (با irn ss5) است. همچنین در بررسی توالی اسیدآمینه جدایه‎های مورد بررسی، جایگاه برشی گلوتامین-آلانین (gln-ala) نیز به عنوان جایگاههای برش برای پروتئاز nia شناسایی شد که باعث جدا شدن پروتئین پوششی از nib می‎شود. با توجه به اینکه tumv از شیوع بالایی در منطقه برخوردار بود لذا این ویروس جهت مطالعات پروتئومیکس انتخاب شد. آلوده سازی گیاه مدل n. benthamiana با سازه عفونت‎زای این ویروس (p35tunos) انجام گردید و پس از حدود 28 روز از زمان آلودگی و مشاهده علایم، صحت آلودگی گیاهان با آزمون rt-pcr تأیید و استخراج پروتئین کل گیاه از دو گیاه آلوده و غیرآلوده انجام شد. در آزمون الکتروفورز دوبعدی پروفایل پروتئینی دو گیاه آلوده و غیرآلوده با هم مقایسه و با وجود بیش از 200 لکه پروتئینی تکرار پذیر، حداقل 96 لکه تغییر بیان داشتند که از این میان تعداد 15 لکه جهت بررسی طیف سنجی جرمی انتخاب شدند. مقایسه دو ژل مربوط به گیاه غیرآلوده و آلوده نشان داد که تولید بسیاری از پروتئین‎هایی که در گیاه غیرآلوده وجود داشت، در گیاه آلوده در اثر آلودگی به ویروس کم شده بود. در این بین آنزیم های رابیسکو از پروتئین هایی بود که در پروفایل پروتئینی گیاه آلوده تولید آن کاهش یافته بود. با توجه به اینکه آنزیم رابیسکو در فتوسنتز نقش به سزایی دارد و عمل فتوسنتز در گیاه آلوده مختل شده بود، بنابراین می‎توان این مهم را با علایم کم رشدی گیاه نسبت داد. تولید آنزیم‎های کیتیناز، اندوکیتیناز و اسموتین نیز که در دفاع گیاه در برابر ویروس نقش دارند کم شده بود که این می تواند باعث حساس تر شدن گیاه به ویروس و یا سایر پاتوژن ها شود. از دیگر پروتئین هایی که تولید آنها در گیاهان آلوده کاهش یافته بود می توان به عامل رونویسی myb و زیرواحد بتای آنزیم atp سینتاز اشاره کرد که با ظهور علایم گیاه مرتبط بود. آنالیز پروتئومیکی ثابت کرد که فعالیت گیاه در واکنش به tumv بسیار کاهش می یابد. این اولین آنالیز پروتئوم سلول آلوده به یک ویروس گیاهی در مقایسه با سلول غیرآلوده در ایران می باشد.

در این پژوهش سه جدایه پرآزار چندهسته ای و یک جدایه کم آزار دوهسته ای از قارچ نکروتروف rhizoctonia در برهمکنش با گیاه میزبان حساس گوجه فرنگی (رقم موبیل) مورد بررسی قرار گرفت. میزان بیماریزایی این چهار جدایه بر روی گیاهچه ها و همچنین با روش دیسک های برگی ارزیابی شد و شاخص بیماری محاسبه گردید. بررسی میکروسکوپی ساختارهای آلوده کننده هر جدایه در زمان های مختلف و تعمیم آن با قدرت بیماریزایی جدایه ها انجام گرفت. در بررسی مقاومت گیاه علیه بیمارگر، میزان رسوب کالوز و تولید هیدروژن پراکسید و آنیون سوپر اکسید از گونه های فعال اکسیژن نیز در سلولهای گیاه علیه هر جدایه بررسی گردید. بیشترین میزان رسوب کالوز و فعال شدن مکانیسم های دفاعی گیاه علیه جدایه متعلق به ag3 از قارچ rhizoctonia solani که شدت بیماری کمتری را نسبت به دو جدایه پرآزار ag4hgi و ag4hgii ایجاد کرد مشاهده شد. تیمار با زانتین / زانتین اکسیداز که باعث تحریک تولید آنیون سوپر اکسید می شود موجب افزایش شدت علائم بیماری توسط بیمارگرها گردید. در حالی که تیمار گلوکز / گلوکز اکسیدازکه موجب افزایش هیدروژن پراکسید در سلولهای گیاه می شود علایم بیماری را کاهش داد. بررسی اثر آسکوربات به عنوان بازدارنده تولید و تجمع هیدروژن پراکسید نشان داد که کاهش تولید هیدروژن پراکسید منجر به کاهش رسوب کالوز در برهمکنش میزبان با جدایه های rhizoctonia و در نتیجه موجب افزایش شدت بیماری شد. همچنین ارزیابی میزان فعالیت آنزیم های مخرب دیواره سلولی شامل پکتیناز و سلولاز تولید شده توسط جدایه های مختلف rhizoctonia نشان داد که هرچه جدایه پرآزارتر باشد میزان ترشح این آنزیم ها بیشتر است. بنابراین رابطه مستقیم بین قدرت بیماریزایی جدایه ها و فعالیت آنزیم های تخریب کننده دیواره سلولی مشاهده شد.

ویروس زردی چغندرقند (byv) عضو شاخص جنس closterovirus، یکی از مهم ترین ویروس های مولد زردی در چغندرقند است که باعث خسارت شدید اقتصادی می شود. به منظور بررسی و تعیین پراکنش این ویروس، طی تابستان 1386 تعداد 530 نمونه از مزارع چغندرقند استان خراسان رضوی(شهرستان های فریمان، تربت جام، قوچان، چناران، تربت حیدریه، کاشمر، نیشابور و حومه مشهد) جمع آوری شد. نمونه برداری به دو صورت جمع آوری گیاهان مشکوک به بیماری، دارای علائم روشن شدن رگبرگ، زردی و نقاط نکروتیک و همچنین به روش تصادفی جهت تعیین پراکنش انجام شد. برای شناسایی عامل این ویروس از روش سرولوژیکی das-elisa استفاده شد و نهایتاً در گیاهان بیمار با علائم مذکور، ویروس زردی چغندرقند(byv) تشخیص داده شد. جهت استخراج rna ویروس از برگ های آلوده، از روش رسوب با peg6000 استفاده گردید. سپس با استفاده از پرایمر اختصاصی cdna مربوطه ساخته شد و برای انجام rt-pcr مورد استفاده قرار گرفت. باند محصول واکنش rt-pcr بر روی ژل آگارز 1 درصد در bp332 مشاهده شد. وجود این ناحیه تکثیر شده در نمونه های آلوده، نشان از آلودگی به ویروس مذکور در مناطق بررسی شده دارد. بر اساس بررسی نتایج به دست آمده شهرستان های تربت حیدریه با 8/17% و نیشابور با 8/4% به ترتیب بیشترین و کمترین میزان آلودگی را دارا بودند. متوسط میزان پراکنشbyv در استان خراسان رضوی در این سال،10% تعیین شد.

به منظور ردیابی ویروس های s و v سیب زمینی در تابستان سال 1386 از مناطق عمده سیب زمینی کاری استان های خراسان رضوی و همدان نمونه برداری صورت گرفت. غده های گیاهانی که علایمی نظیر موزاییک، کلروز و تموج حاشیه برگ را نشان میدادند، جمع آوری شدند و در شرایط خنک به آزمایشگاه منتقل گردیدند. غده ها جهت گذراندن دوره خواب در دمای 4 درجه سانتی گراد در سردخانه قرار گرفتند و سپس جوانه زدند. عصاره تعدادی از نمونه هایی که در آزمون سرولوژیکی das-elisa مثبت ارزیابی شده و در گلخانه کاشته شدند، بر روی گیاهان محک شامل chenopodium quinoa و c. amaranticolor (نقاط کلروتیک روی برگ)، nicotiana debneyi (موزاییک و رگبرگ نواری)، n. occidentalis (رگبرگ روشنی)، n. glutinosa و گوجه فرنگی (موزاییک) مایه زنی شد و علایم ایجاد شده در هر یک با منابع مطابقت داشت و حضور ویروس را تأیید کرد. جهت ردیابی مولکولی، استخراج rna به دو روش فنل-کلروفرم و peg 6000 انجام شد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی مبنی بر ژن کد کننده پروتئین پوششی در واکنش rt-pcr، قطعه ای در محدوده 1118 جفت باز برای pvs و 811 جفت باز برای pvv تکثیر گردید. این اولین گزارش از وجود ویروس pvv در ایران می باشد. همچنین فرآورده pcr مربوط به ویروس s سیب زمینی جهت تعیین توالی به شرکت macrogene کره ارسال و توالی یابی گردید.

استان خراسان رضوی یکی از مناطق مهم تولید چغندرقند در کشور است و بیشترین میزان سطح زیر کشت آن را داراست. ویروس موزاییک چغندرقند(btmv) یکی از مهم ترین ویروس های بیماریزا بر روی این محصول بوده و در تمام مناطق مهم چغندرکاری جهان دیده شده است. این ویروس باعث ایجاد علائم موزاییک، زردی، پیچیدگی و بدشکلی در برگ های میزبان می شود. به منظور بررسی و تعیین پراکنش این ویروس در استان خراسان رضوی طی تابستان 1386 نمونه برداری بطور تصادفی و نیز از بوته های مشکوک به بیماری بر اساس علائم ظاهری، از مزارع چغندرقند واقع در شهرستان های مشهد، نیشابور، قوچان، تربت حیدریه، تربت جام، فریمان و کاشمر صورت گرفت. نمونه های آلوده به ویروس با استفاده از آزمون das-elisa مشخص شدند. به منظور انجام آزمون های مولکولی، rna ویروس از برگ های آلوده با استفاده از روش رسوب با peg6000 استخراج گردید. سپس با استفاده از پرایمر اختصاصی cdna مربوطه ساخته و برای انجام آزمون rt-pcr مورد استفاده قرار گرفت. باند محصول واکنش rt-pcr بر روی ژل آگارز 1 درصد در bp658 ظاهر گردید. وجود این ناحیه تکثیر شده در نمونه های آزمایشی، آلودگی به ویروس مذکور را در مناطق مورد بررسی تأیید می کند. بر اساس نتایج بدست آمده آلودگی در همه شهرستان های مورد مطالعه به نسبت های مختلف وجود داشت و مزارع اطراف فریمان با 4/33 درصد و اطراف نیشابور با 8/4 درصد به ترتیب بیشترین و کمترین درصد آلودگی را نشان دادند. متوسط آلودگی به این ویروس در سطح استان از 530 نمونه جمع آوری شده 9/14 درصد تعیین گردید.

قارچهای بیماری زا بر روی غده و ریشه پیاز از اهمیت بسزایی برخوردارند. در دو سال زراعی 87-86 از مزارع پیاز, نمونه های مشکوک به پوسیدگی ریشه و غده ی در استان های خراسان رضوی و شمالی جمع آوری گردید. از نمونه های آلوده 115 جدایه ی قارچی جدا و خالص شد. از این تعداد52 جدایه به عنوان fuasrium oxysporum, 26 جدایه f. solani,20 جدایه f. proliferatum, 5 جدایه pyrenochaeta terestris , 6 جدایه rhizopycnis vagum و 6 جدایه alternaria sp. شناسایی گردیدند. پس از انجام آزمون بیماریزایی 29 جدایه f. oxysporum, 24 جدایه ی f. solani , 16 جدایه ی f. proliferatum و تمامی جدایه های p. terestris و r. vagum بیماریزا تشخیص داده شدند. در بررسی دامنه ی میزبانی f. oxysporum، هر 29 جدایه فقط بر روی پیاز بیماریزا بودند و به عنوان f. oxysporum fsp. cepea معرفی گردیدند. بر اساس این نتایج گونه p. terestris به عنوان عامل بیماری ریشه سرخی پیاز و گونه های فوزاریوم به عنوان عوامل اصلی پوسیدگی ریشه و غده ی پیاز شناسایی شدند. گونه ی r. vagum برای فلور قارچی ایران جدید بوده و پیاز نیز به عنوان میزبانی جدید برای این بیمارگر در دنیا معرفی گردید. در این تحقیق با استفاده از سه روش محیط کشت آگاردار , گلخانه ای و مولکولی مشخص شد که دو گونه ی f. oxysporum و f. proliferatum در پیاز بذرزاد می باشند. همچنین تیپ های آمیزشی گونه ی f. proliferatumدر استان های مذکور بررسی گردید و مشخص شد که هر دو تیپ آمیزشی 1و2 در این دو استان وجود دارند و تیپ آمیزشی 2 تیپ غالب است.

در سال زارعی 1375، در یکی از مزارع سیب زمینی در منطقه بجنورد، تعداد زیادی بوته سیب زمینی مشکوک به آلودگی به ویروس x سیب زمینی که دارای علائم کوتولگی، رنگ پریدگی و موزائیک خفیف بودند در نظر گرفته و نشانه گذاری شدند. هنگام برداشت محصول، از هر بوته نشانه گذاری شده، تعدادی غده برداشت نمده و تاسپری و شکسته شدن دوره خواب در سردخانه تاریک و دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. بعد از اتمام دوره خواب ، غده ها در خاک مناسب کاشته شده و در گاخانه نگهداری شدند. مطالعات دامنه میزبانی، خواص ویروس در عصاره گیاه در شرایط آزمایشگاه، آزمونهای سرولوژیکی و الکترون میکروسکوپی نشان داد که بوته های حاصله از رشد غده های مذکور، آلوده به ویروس x سیب زمینی potato virtus x (pvc)، هستند. در مطالعات دامنه میزبانی، گیاهان datura strsmonium l., lycopersicon esculentum mill, nicotiana glutinosa l., n. debneyi domi, nicotina tabacum l. var. samsum, n. tabacum l. var. turkish, n. tabacum l. var. xanthi و capsicum frutescens l. علائم سیستمیک نشان دادند. در گیاهان c.amaranticolor coste & reyn, chenopodium quinoa willd و gomphrena globosa l. علائم موضعی ظاهر شد در حالیکه، بر روی cucumis sativus l. هیچگونه علائمی مشاهده نگردید. این ویروس ، جهت خالص سازی در n.glutinosa تکثیر شد و بعد از خالص سازی، آنتی سرم مربوطه بر علیه ویروس خالص شده تهیه گردید. به منظور بررسی ویروس pvc در شمال خراسان و تعیین درصد آلودگی، از 26 مزرعه در مناطق بجنورد، چناران،شیروان، طوس ، فاروج و قوچان مجموعا 247 بوته بطور تصادفی نمونه برداری شده و از آزمون das - elisa جهت تشخیص ویروس pvx در آنها استفاده شد. نتایج آزمون نشان داد که مناطق فوق به ترتیب 50، 63/6، 34/7، 53/3، 62/8 و 37/2 درصد آلودگی دارند.

سفیدک سطحی جو یکی از بیماریهای مهم در مزارع جوی استان خراسان می باشد. یکی از بهترین روشهای کنترل این بیماری، کاربرد ارقام مقاوم چند ژنی جو است . ارقام اصلاح شده جو زراعی در حال حاضر اکثرا دارای مقاومت عمودی با تعداد محدودی ژن مقاومت است . نتیجتا این ژنها به راحتی بوسیله پیدایش نژادهای فیزیولوژیک بیماریزای جدید در جمعیت پاتوژن در هم شکسته می شوند. اولین شرط اقدام، جهت ایجاد یک رقم جوی دارای مقاومت پایدار، در اختیار داشتن اطلاعات کافی در مورد کیفیت و کمیت ژنهای بیماریزای پاتوژن در منطقه است . برای این منظور نمونه هایی از واریته های آلوده به پاتوژن از مناطق مختلف استان با شرایط آب و هوایی متفاوت ، جمع آوری شد و با استفاده از روش تک اسپوری، 287 جدایه تکثیر و روی ارقام افتراقی جو به روش ولف و براون (brown and wolfe 1990) ارزیابی شدند. در این بررسی مجموعا 9 ژن بیماریزای شناسائی گردید. که در بین این ژنها، ژنهایی بیماریزای vv و vh ژنهای غالب منطقه، دارای وفور نسبی به ترتیب 93/8 و 93/3 درصد بودند و در مقابل ژن بیماریزای vo با وفور نسبی 4/9 درصد کمترین پراکنش را در جمعیت پاتوژن استان داشت .

در بررسی که در سال 1374 به منظور یافتن ویروس موزائیک کاهو در مزارع کاهو اطراف مشهد انجام شد، تعدادی بوته کاهو که علائم موزائیک ، زردی و کوتولگی نشان می دادند، جمع آوری شد و مورد مطالعه قرار گرفتند. در مطالعات دامنه میزبانی، ویروس مورد نظر، رقمی از کاهو محلی (lactuca sativa l. var. iongitolia)، گلرنگ (carthamus tinctorius) و نخود ایرانی (cicer arietinum l.) را بطور سیستمیک آلوده نموده، همچنین روی chernopodium amaranticolor coste & reyn. chenopodium quinoa willd علائم موضعی و سیستمیک ایجاد نموده، ولی روی gomphrena globosa l. علائمی ایجاد نکرد. در نمونه های مورد بررسی، هیچگونه آلودگی به ویروس موزائیک خیار (cucumber mosaic cucumovius (cmv)) مشاهده نگردید. ایزوله مورد نطر در c. quinoa تکثیر داده شد و خالص سازی آن طبق روش پیشنهادی moghal & francki (1979) با مقداری تغییرات انجام گردید. آنگاه در برابر پرپاراسیون مختصر خالص شده ویروس ، آنتی سرم مربوطه تهیه گردید. براساس واکنش گیاهان میزبان، انتقال بذری و آزمون های سرولژیکی، عامل بیماری، ویروس موزائیک کاهو (lettuce mosaic potyvirus (lmv)) تشخیص داده شد. جهت تعیین پراکنش ویروس های موازئیک کاهو و خیار در مزارع کاهو از روش das-elisa استفاده گردید. تعداد نمونه های آلوده به cmv, lmv و هر دو ترتیب 15، 14 و 9 عدد از کل 200 نمونه تعیین شد. همچنین در مزارع یاد شده، ویروس موزائیک کاهو در تعدادی از بوته های کاهوی خاردار (lactuca serriola l.) و c. quinoa ردیابی شد، در حالی که هیچیک از این نمونه ها به ویروس موازئیک خیار آلوده نبودند. ردیابی ویروس موزائیک کاهو در 16 دسته بذر کاهو جوانه زده حاکی از آلودگی 8 دسته بذری به این ویروس بود.

در بررسی که در سال 1375 به منظور یافتن ویروس s سیب زمینی در مزارع سیب زمینی شمال خراسان انجام شد. تعدادی غده بطور انتخابی از چندین مزرعه سیب زمینی در اطراف بجنورد از بوته های علامت گذاری شده که دارای علائم موزائیک ، روگوز، فرورفتنی رگبرگها، ریزبرگی، تموج حاشیه برگها بودند جمع آوری گردید. هم چنین تعدادی غده نیز بطور تصادفی از مزارع سیب زمینی اطراف شهرهای مشهد، چناران، قوچان، فاروج و شیروان جمع آوری شد. غده های جمع آوری شده تا سپری شدن دوره خواب در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شده و سپس در شرایط گلخانه کشت داده شدند. در مطالعات دامنه میزبانی، ویروس موردنظر گیاهان nicotiinan debneyi domin. و lycopersicon esculentum l. cv. early urbana iii را بطور سیستمیک آلوده نمود. این ویروس در روی گیاهان chenopodium amaranticolor costa & reyn. و c. quinoa wild علائم موضعی کلروتیک ایجاد نمود ولی در phaseolus vulgaris l. var red kidney, gompherena globosa l., petunia hybrida vilm, nicotiana tabacum l. cv. xanthi, datura stramonium l. و capsicum frutescens l. هیچگونه علائمی ایجاد نکرد. ایزوله مورد نظر در n.debneyi تکثیر داده شد و خالص سازی آن طبق روش پیشنهادی hammond & lawson (1988) با مقداری تغییرات انجام گرفت . آنگاه در برابر پرپاراسیون نسبتا خالص شده ویروس آنتی سرم تهیه گردید. براساس واکنش گیاهان محک افتراقی و میکروسکپ الکترونی، عامل بیماری ویروس s سیب زمینی تشخیص داده شد. از آزمونهای سرلوژیکی "نشت دوطرفه در آگار" و "elisa" جهت سرولوژی ویروس استفاه شد. جهت تعیین میزان آلودگی مزارع سیب زمینی اطراف بجنورد مجموعا 200 بوته به طور تصادفی نمونه برداری شده و از آزمون das-elisa جهت تشخیص pvs در آنها استفاده شد، براساس نتایج آزمون درصد آلودگی در منطقه بجنورد 15/5 درصد تعیین شد. جهت تشخیص پروتئین پوششی ویروس ، الکتروفورز روی ژل 15 درصد sds-page و سپس western blotting انجام شد. مقایسه نتایج الکتروفورز با وسترن باتینگ نشان داد که دو باند پروتئنی مربوط به پروتئین های ویروسی با وزنهای مولکولی 31 و 26 کیلو دالتون می باشد. پروتئین 31 کیلودالتونی به عنوان پروتئین پوششی ویروس 26 کیلودالتونی به عنوان یکی از محصولات پروتئینی rna ویروس s سیب زمینی که در سلولهای آلوده میزبان تولید می شوند، تشخیص داده شد.

بررسی آلودگی های فوزایومی در ارقام گوجه فرنگی طی سالهای 1374-75 در شهرهای شمالی استان خراسان انجام گرفت در بعضی مناطق این بیماری (در برخی سالها) بحدی افزایش داشت که فقط 2 یا 3 چین محصول برداشت شد و بعد از آن صرفه اقتصادی نداشت . در بررسیهای انجام شده فاروج با 7 درصد کمترین و بجنورود با 44 درصد بیشترین درصد آلودگی را نشان دادند. گونه های فوزاریوم جدا شده از گیاهان آلوده عبارتند از: f. oxysporum, f. equiseti, f. proliferatum, f. culmoruum و fusarium solani که بجز گونه آخر بیمه بیماریزا بودند. جهت بررسی و مقایسه گونه های فوزاریوم جدا شده از بذور آلوده، 11 نمونه بذر بعد از ضدعفونی سطحی با محلول هیپوکلریت سدیم 1 درصد روی nash-snyder قرار داده شدند و از تمام این بذرها فقط دو گونه f. solani و f.oxsporum جدا گردید. در آزمون گیاهچه وقتی بذور آلوده روی کاغذ صافی استریل مرطوب قرار داده شد گیاهچه های حاصل آلودگی نشان داده و از آنها هر دو گونه فوزاریوم ذکر شده در بالا جدا گردید. آزمون بیماریزایی برای ایزوله های فوزاریوم حاصله از بذور با استفاده از روشهای آلوده سازی بذور انجام پذیرفت . علائم بیماری در گیاهچه های حاصله مشاهده و از آنها مجددا گونه های f. solani و f. oxysporum جدا گردید.

از مزارع لوبیا در مناطق مشهد و چناران در سال زراعی 1375، بر اساس علائم مشکوک به آلودگی ویروس موزاییک معمولی لوبیا (bcmv)، نمونه برداری صورت گرفت . از مجموع 185 نمونه جمع آوری شده، تعداد 39 نمونه به ویروس موزائیک معمولی لوبیا آلوده بودند. نمونه های جمع آوری شده از لحاظ احتمال آلودگی به این ویروس موزائیک خیار (cmv) نیز مورد بررسی قرار گرفتند و هیچگونه آلودگی به این ویروس مشاهده نگردید، جهت بررسی آلودگی نمونه ها از روش نشت دو طرفه در آگار و مایه کوبی گیاهان محک استفاده گردید. بر اساس اختلاف در علائم ایجاد شده بر روی گیاهان لوبیا در مزارع مورد بررسی، تعدادی نمونه جمع آوری گردید و سپس با توجه به علائم ایجاد شده توسط آنها بر روی لوبیای قرمز رقم گلی سه جدا شدهخ انتخاب و همراه با جدا شده بذر و جدا شده nl-3 مورد بررسی قرار گرفتند، که بیشترین علائم مورد مشاهده در سطح مزارع مربوط به جدا شده بذر بود. بررسی خصوصیات فیزیکی جدا شده های بدست آمده نیز نشان دهنده شباهت آنها به یکدیگر و شباهت با ویروس موزائیک معمولی لوبیا می باشد. در بررسی چهار رقم لوبیای دهقان، تلاش ، ناز و گلی مشاهده گردید که رقم گلی از لحاظ درصد بذرزادی ویروس در بوته های آلوده و درصدی آلودگی بذور دارای بیشترین مقدار است ، در هیچکدام از ارقام مورد بررسی دئر برابر جدا شده های ویروس علائم نکروز مشاهده نگردید، اما علائم آلودگی سیستمیک و سایر علائم مربوطه دیده شد که احتمالا بیانگر عدم وجود ژن غالب بازدارنده i در این ارقام است و با توجه به مقاومت برخی ارقام محلی به ویروس ، جهت اصلاح بذر و تولید ارقام مقاوم می توان از آنها استفاده کرد.