آفتابگردان به خاطر داشتن مصارف مهم خوراکی، دارویی، صنعتی و... در بین سایر دانه های روغنی جایگاه ویژه دارد. از آنجایی که عمده ارزش تغذیه ای واقتصادی این گیاه در بذور آن نهفته است و بذور منابع مهم پروتئین، کربوهیدرات و روغن می باشند، اصلاح ژنتیکی در راستای بهبود کیفیت و کمیت صفات مرتبط با دانه ی آفتابگردان اهمیت پیدا کرده است. در مهندسی ژنتیک این صفات و هدفگیری بذر آفتابگردان، نیاز به استفاده از راه اندازهای اختصاصی بذر است. بنابراین همسانه سازی آن ضرورت این تحقیق را آشکار میسازد. در این تحقیق جداسازی و همسانه سازی راه انداز اختصاصی از ژن آلبومین در دو رقم بنام های آلتار و r21×330 انجام گرفت. بدین منظور ابتدا بر اساس مطالعات بیوانفورماتیک و با استفاده از نرم افزارهایoligo5 و primer3 آغازگرهای اختصاصی طراحی شد. پس از تکثیر قطعات مورد نظر با پی سی آر، محصولات حاصله پس از برش با آنزیمهای برشی hindiii و bamhi و سوار کردن در پلاسمید pbluescript ii ks همسانه سازی شدند. تایید کلنی های تراریخته و مثبت (سفید) بواسطه داشتن قطعه راه انداز، با کلنی پی سی آر و استفاده از آنزیم های برشی و الکتروفورز ژل آگارز، انجام شد. پس از توالی یابی کلون ها، تفاوت ها و تشابهات قطعه راه انداز همسانه سازی شده با اطلاعات موجود در شبکه بررسی شد. نتایج حاصل از بررسی های بیوانفورماتیکی نشان داد که راه انداز همسانه سازی شده در نواحی گوناگون دارای تغییرات نوکلئوتیدی درج، حذف و جایگزینی است. با این توصیف که محل این تغییرات شامل جعبه ی tata و جعبه ی caat و ناحیه ی utr و ناحیه آغاز ترجمه نمی گردد. با بررسی بیان این راه انداز می توان تاثیر تغییرات نوکلئوتیدی را در میزان و نحوه بیان مشاهده نمود. همچنین عملکرد و کارایی ناحیه utr در بیان ژن مشخص خواهد گردید.

راه اندازها نقش اساسی در رونویسی و بیان ژنها دارند. تا زمانیکه راه انداز ژن توسط rna پلیمراز مورد شناسایی قرار نگیرد، رونویسی و در نتیجه بیان ژن به وقوع نمی پیوندد. بعضی از ژنها دارای بیان اختصاصی در اندام، بافت و یا شرایط محیطی متفاوت هستند، کلید این بیان اختصاصی در دست راه اندازهای اختصاصی قرار دارد که در اندام، بافت و یا شرایط محیطی خاص فعال می گردند، همین امر ضرورت شناسایی و جداسازی راه اندازهای اختصاصی را نشان می دهد. به دلیل اهمیت چغندرقند به عنوان یک گیاه صنعتی و اقتصادی، این تحقیق روی گیاه مزبور انجام شد. از آنجا که ریشه این گیاه بخش اقتصادی و مورد استفاده آن را تشکیل می دهد شناسایی و جداسازی راه اندازهای اختصاصی آن هدف اصلی این تحقیق می باشد بطوریکه برای تغییر ویژگیهای خاص آن و همچنین پروژه های انتقال ژن مورد استفاده قرارگیرد. در این تحقیق ابتدا اطلاعات مربوط به راه اندازهای اختصاصی ریشه در گیاهان مختلف جمع آوری شده و با راه اندازهای اختصاصی ریشه چغندر از نظر توالی نوکلئوتیدی مورد مقایسه قرار گرفت، سپس با استفاده از قسمتهای مشترک و مورد نظر این راه اندازها، آغازگرهایی طراحی وبرای تولید سفارش داده شد. برای دسترسی به نواحی مورد نظر از ژنوم گیاه چغندرقند، واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام پذیرفت. بدین منظور ابتدا با استفاده از روش ctab، dna گیاه چغندرقند استخراج و به عنوانdna الگو در pcr مورد استفاده قرار گرفت. بعد از تکثیر قطعات مورد نظر، این قطعات در پلاسمید های pbluescript و pgemt-easy همسانه سازی شدند. پیرو درج قطعه در پلاسمید ها از طریق تراریختی باکتریایی، باکتریهای تراریخت تولید و پلاسمیدهای تکثیر یافته در آنها از طریق آنزیمهای برشی مورد تایید قرار گرفته و نهایتاً برای تعیین توالی آنها اقدام گردید. در پایان توالیهای حاصله مجدداً مورد بررسیهای بیوانفورماتیکی قرار گرفته و نتیجه گیری لازم یعنی شباهت قطعات همسانه سازی شده با اطلاعات موجود در ncbi و همچنین عدم وجود تفاوت در نواحی مهم همانند utr مورد تایید قرار گرفت.

تظاهر ژن های bt در بخش های خوراکی گیاهان تراریخت، از جمله غده های سیب زمینی، باعث نگرانی هایی برای مصرف کنندگان از نظر ایمنی غذایی شده است. بنابراین یک استراتژی مهم برای هدفمند کردن بیان ژن ها و تولید سیب زمینی bt ایمن تر احتمالا استفاده از پیشبرهای وی‍ژه-مکانی یا -بافتی و یا -زمانی به جای پیشبرهایی با بیان دائمی است. پیشبر(phosphoenolpyruvate carboxylase) pepc که از گیاه ذرت ( (c4 (zea mays) جدا گردیده است، سبب تظاهر ژن در بافت های سبز گیاه می گردد. در این مطالعه، برای رسیدن به این اهداف از انتقال ژن رمزکننده پروتئین cry1ab تحت کنترل پیشبر pepc به رقم سیب زمینی مارفونا برای بدست آوردن گیاهان تراریخت مقاوم به بید سیب زمینی استفاده شد. برای تراریختی سیب زمینی از میانگره به عنوان جداکشت به کمک agrobacterium tumefaciens سویه aglo1 استفاده شد. آنالیز pcr ژن cry1ab و nptii برای 55 گیاه از 60 گیاه باززاده تراریخت احتمالی با فنوتیپ نرمال مثبت بود. بررسی سطح پلوییدی گیاهان تراریخت با فلوسایتومتر نشان داد که این گیاهان همانند گیاهان شاهد تتراپلویید می باشند. بررسی از طریق دورگ سازی سادرن سه لاین گیاه سیب زمینی تراریخت، درج یک نسخه سالم و کامل از ژن cry1ab در ژنوم گیاهان تراریخت را تایید کرد. آنالیز rt-pcr ژن cry1ab بیان این ژن را در سطح rna در برگ های گیاه ثابت کرد. انجام تست نواری پروتئین cry1ab روی عصاره های حاصل از برگ ها و غده های سیب زمینی تراریخت در دو سطح غده های نور دیده سبزرنگ و نورندیده درون خاکی، بیان پروتئین cry1ab را در بخش های سبز گیاه شامل برگ ها و غده های سبز رنگ و عدم بیان را در غده های نورندیده درون خاکی تایید کرد. زیست سنجی برگی نه لاین تراریخت، مقاومت کامل به بیدسیب زمینی را در هشت لاین نشان داد. انجام زیست سنجی گلخانه ای در 6 لاین نشان داد که لاین های انتخاب شده هیچ خسارتی از آفت ندیدند. زیست سنجی غده های سبز رنگ نشان داد که غده های سبز رنگ لاین های تراریخت خسارتی از آفت ندیدند و حشره در همان لایه بیرونی سبز رنگ با تغذیه از این بافت مرده و غده ها سالم ماندند. زیست سنجی غده های درون خاکی که تحت نور قرار نگرفته بودند نشان داد که این غده ها به اندازه گیاه شاهد خسارت دیدند. بنابراین این امر حاکی از عدم بیان ژن cry1ab در بافت خوراکی لاین های تراریخت سیب زمینی میباشد. از طرفی این امر بیانگر آن است که پروتئین کریستالی در غده هایی که بیرون از خاک قرار می گیرد و بیشتر در معرض حمله و تخم ریزی حشره قرار دارد بیان می شود. بر اساس این نتایج، بیان مکانی ژن cry1ab با استفاده از پیشبر نوری pepc می تواند بید سیب زمینی را در مزرعه کنترل، به طور معنی داری انتقال این آفت را به انبار کاهش دهد. از طرفی عدم بیان ژن یا به حداقل رسیدن بیان آن در غده ها می تواند تاحدودی نگرانی های ایمنی غذایی مصرف کنندگان سیب زمینی bt را کاهش دهد.

بذور غلات بخصوص ذرت به عنوان منبع تغذیه فسفر برای دام و طیور می باشد حال اینکه فسفر در دانه این گیاه بیشتر به شکل فیتات می باشد و توسط جانوران تک معده مانند: انسان، طیور و ماکیان تجزیه نمی شود و بیشتر فسفر تغذیه ای موجود در دانه از دسترس این جانوران خارج می گردد. راهکار های زیادی از سال 1992 برای کاهش فیتات دانه ها بخصوص ذرت انجام گرفته است. دانشمندان روش هایی مانند موتاسیون وگزینش در سطح رضایت بخشی موجب کاهش فیتات نشده اند. روش های مختلف شیمیایی و فرآوری های گوناگونی در کارخانجات مواد غذایی و تولید جیره طیور بر روی فیتات دانه ها صورت می گیرد اما مقاومت بالای آن به دما و مواد شیمیایی مانع از هیدرولیز آن می شود فیتات با بلوکه کردن کاتیون های مختلف معدنی و دو طرفیتی و همچنین تشکیل کمپلکس های مختلف با پروتئین ها توسط مدفوع از بدن خارج می شود. امروزه در دنیا دو استراتژی برای کاهش معنی دار سطح فیتات به کارگرفته شده یکی استفاده از آنزیم تجزیه کننده فیتاز است. که به طور صنعتی نیز تولید می شود و دیگری استفاده از روشهای مهندسی ژنتیک و موتاسیون در تولید بذور با سطح فیتات کم است در این تحقیق با به کارگیری تکنیک های مهندسی ژنتیک قصد داریم که سطح بذور تولیدی ذرت را کاهش دهیم به همین دلیل با بکارگیری rna مداخله گر mrna های تولید شده در داخل سلول را تجزیه می کنیم. برای نائل شدن به این هدف آنزیم کلیدی میو اینوریتول 1- فسفات mips1)) دخیل در مسیر ساخت فیتات را که آنزیمی یک طرفه می باشد انتخاب کرده ایم ژن کدکننده این آنزیم شناخته شده است و از روی یکی از 10 اگزون آن سازه مداخله گری طراحی کرده ایم و نام آن سازه pzmmips1 قراردادیم. در صورت انتقال سازه به گیاه ذرت و قرار دادن کاست zmmips1 در ژنوم آن سبب کاهش ساخت فیتات قبل از مرحله ترجمه به پروتئین شود. سازه rnai در آگروباکتریوم انتقال داده شده و آماده انتقال به گیاه می باشد. این سازه تا حد معنی داری می تواند فیتات را کاهش دهد.

سیب زمینی یکی از محصولات مهم در دنیا است که از نظر میزان تولید در رده چهارم قرار گرفته است. در دمای پایین در انبار نشاسته تجزیه شده و به قندهای ساده گلوکز، فروکتوز و ساکاروز تبدیل می شود این قندها باعث کاهش کیفیت محصول می شوند. برای کاهش تجمع قندها از تکنولوژی rnai جهت خاموش سازی ژن های استارچ فسفوریلاز l و استارچ اسوشییتد r1 دخیل در تجزیه نشاسته در دمای پایین استفاده شد. ابتدا قطعاتی از این ژن ها با استفاده pcr جداسازی شدند. بعد از توالی یابی و تایید توالی قطعات مورد نظر، ساخت سازه rnai با این دو قطعه انجام شد. دو نوع سازه rnai، یکی rnai تک ژن برای ژن استارچ فسفوریلاز l (part-sphl-ir) و دیگری سازه rnai چند ژن برای ژن های استارچ فسفوریلاز l و استارچ اسوشییتد r1 (pbi-sphlsar1-ir) ساخته شد. سازه های rnai ساخته شده به داخل agrobacterium tumefaciens انتقال داده شد. برای تراریختی واریته ها از 60 جداکشت در هر آزمایش استفاده شد. کلا? از واریته های آگریا و مارفونا به ترتیب 21 و 33 شاخساره در محیط شاخه زایی تولید شد و از شاخساره های تولید شده به ترتیب 55/71 و 25/59 درصد در محیط حاوی کانامایسین ریشه دار شدند. برای گزینش لاین های تراریخت حاصل از سازه part-sphl-ir، آزمایشات pcr برای حضور ژن nptii و اینترون pdk صورت گرفت و تمامی لاین های ریشه دار شده برای هر دو مورد مثبت بوده و به ترتیب قطعاتی به طول 612 و 608 جفت باز تکثیر شد. برای گزینش لاین های تراریخت حاصل از سازه pbi-sphlsar1-ir، آزمایشات pcr برای حضور ژن nptii و کاست rnai صورت گرفت. تمامی لاین های ریشه دار شده برای هر دو ژن nptii و کاست rnai مثبت بوده و در الکتروفورز به ترتیب باندهایی به طول786 و514 ایجاد شد. برای بررسی میزان بیان ژن-ها در سطح رونویسی از real time rt-pcr استفاده شد. میزان بیان ژن استارچ فسفوریلاز در لاین های تراریخت مورد بررسی 56/1 الی 54/7 درصد نسبت به گیاه شاهد بود. میزان بیان ژن استارچ اسوشییتد r1 بین 58/9 الی 46/16 درصد بود. آنالیز قندهای احیاءکننده و کل در ریزغده های نگهداری شده در 4 درجه سانتی گراد نشان داد در لاین های تراریخت حاصل از سازه part-sphl-ir کاهش در تجمع قندهای کل تا 38 درصد و کاهش در قندهای احیاءکننده تا 39 درصد اتفاق افتاده است. در لاین های تراریخت حاصل از pbi-sphlsr1-ir به ترتیب 58 و 60 درصد کاهش در تجمع قندهای کل و احیاءکننده رخ داده است. بررسی فسفریلاسیون در لاین های تراریخت حاصل از pbi-sphlsar1-ir نشان داد میزان فسفات متصل به نشاسته تا 67/51 درصد نسبت به گیاه شاهد کاهش یافته است. درحالیکه بررسی محتوای نشاسته در ریزغده های این لاین ها نشان داد که میزان نشاسته تا 97/7 درصد نسبت به ریزغده های گیاه شاهد افزایش می یابد

آندوسپرم غلات دارای اهمیت اقتصادی و تغذیه ای فراوانی بوده و منبع انرژی و پروتئین برای جوامع انسانی و حیوانات اهلی به شمار می رود. استفاده از تغییر ژنتیکی در جهت بهبود ساختار و ترکیبات آندوسپرم، نیازمند راه-اندازهای ژنی مناسب برای بیان ترا ژن ها به میزان و الگوی مطلوب می باشد. از این رو در این پژوهش جداسازی راه-اندازهای اختصاصی ژن های زیرواحدهای گلوتنین با وزن مولکولی بالا (hmw-gs) از گندم نان و دوروم مورد توجه قرار گرفت. با طراحی آغازگرهای اختصاصی و بکارگیری آن ها بر روی dna ژنومی، طی واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) قطعات راه انداز به طول 954 و 545 جفت باز از گندم نان رقم نیک نژاد و قطعات راه انداز به طول 961 و 548 جفت باز از گندم دوروم رقم دنا تکثیر یافت. سپس این قطعات به حامل pgem-t انتقال یافته و کلنی های سفید (تست آبی- سفید)، جهت تایید حضور قطعه، از طریق کلنی pcr و هضم آنزیمی تست شدند که هر دو روش وجود قطعه را ثابت نمود. پس از توالی یابی و تایید مولکولی قطعات، قطعه راه انداز 954 جفت بازی جداسازی شده از گندم نان، به حامل بیان ژن گیاهی انتقال داده شده و با استفاده از روش آنزیمی، حضور قطعه راه انداز در پلاسمید بیانی تایید گردید. بررسی توالی های همسانه سازی شده، با نرم افزارهای blast و clustalw، شباهت بسیار این توالی را با سایر راه اندازهای ژن های پروتئین های ذخیره ای شناخته شده آشکار نمود. نتایج تجزیه های فیلوژنتیکی نشان داد قطعات 954 و 545 جفت بازی جداسازی شده از گندم نان و راه انداز 961 جفت بازی جداسازی شده از گندم دوروم متعلق به گروه ژنی glu-b1-1 و راه انداز 548 جفت بازی جداسازی شده از گندم دوروم جزء ژن های glu-a1-1 می باشند. استفاده از راه اندازهایی که فقط در برخی از بافت ها عمل می کنند، می تواند در رسیدن به اهداف اختصاصی از جمله تولید پروتـئین های نوترکیب در بذر ویا بافت های ویـژه بـذری، انجام تحقیقات پایه و اصلاح کمی و کیفی گندم بسیار سودمند باشد.

امروزه استفاده از راه اندازهای اختصاصی از مهمترین فاکتورهای درگیر در ساخت سازه های ژنی برای بیان اختصاصی پروتئین های نوترکیب در سیستم های بیانی می باشد. پاتاتین یک گروه از گلیکوپروتئین های سیب زمینی می باشد که به وسیله یک خانواده چند ژنی کد می شود و بیش از 40% پروتئین های محلول غده سیب زمینی را به خود اختصاص می دهد و می توان گفت قوی ترین راه انداز اختصاصی در غده می باشد. بدلیل جایگاه سیب زمینی به عنوان چهارمین محصول بااهمیت جهان، از راه انداز پاتاتین برای بیان پروتئین های مختلف در غده های سیب زمینی جهت افزایش مقاومت به آفات و تنش ها، تولید غده های غنی سازی شده نسبت به ویتامین ها و تولید داروهای زیستی در غده ها استفاده شده است. شبکه آندوپلاسمی سلول های گیاهی می تواند به طور معمول تجمع بالایی از پروتئین ها را بدون تهدید نمو و تولید مثل گیاه، تحمل کند. این ویژگی به منظور تجمع پروتئین نوترکیب بکار گرفته می شود. هدف از این تحقیق جداسازی راه انداز اختصاصی پاتاتین به همراه نواحیutr ´5 و پپتید نشانه شبکه آندوپلاسمی از غده سیب زمینی و استفاده از آنها می باشد. در این تحقیق ابتدا پرایمرهای اختصاصی طراحی و با استفاده از تکنیک pcr قطعه مد نظر تکثیر شده و پس از استخراج قطعه از ژل، واکنش اتصال ترانسفورماسیون باکتری e.coli سویه dh5? انجام شد. سپس استخراج پلاسمید از باکتری های تراریخت صورت گرفته و حظور قطعه مورد نظر در پلاسمیدها بوسیله هضم آنزیمی تأیید شد. درنهایت پلاسمیدهای نوترکیب توالی یابی شدند و نتایج حاصل از همردیفی وجود پلی مورفیسم تک نوکلوتیدی(snp) وحضور یک قطعه وارد شده داخل قطعه راه انداز را نشان دادند. این مسأله از این جهت که این توالی برای اولین بار در ایران جدا گردیده، حائز اهمیت فراوان است.

راه اندازهای ژنی از عوامل ضروری و اصلی در بیان عمومی و اختصاصی ژن ها محسوب می شوند. یکی از مسائل مرتبط با تراریخته سازی غلات جهت تغییر ترکیب پروتئین آندوسپرم و بیان ژن های هترولوگ در آن، دسترسی به راه انداز های قوی و اختصاصی آندوسپرم است. راه انداز زیر واحد با وزن مولکولی پائین گلوتنین گندم به دلیل بیان اختصاصی در آندوسپرم و غنی بودن ذخیره محصول آن در بذر گندم (70 -60 درصد از گلوتنین) که نمایانگر قدرت بالای آن می باشد، انتخاب گردید. در راستای این هدف، dna کل گندم در مرحله دو برگچه ای با استفاده از روش ctab استخراج شد. ناحیه راه انداز توسط pcr و با استفاده از آغازگر های اختصاصی طراحی شده بر اساس بانک اطلاعات نوکلئوتیدی ncbi تکثیر شد. قطعه هدف پس از اتصال به حامل همسانه سازی pgem-t جهت تراریخته سازی سلول های مستعد باکتریایی به کار گرفته شد. کلنی های سفید که حضور قطعه درجی در آن ها با کلنی pcr تائید شده بود برای کشت مایع و استخراج پلاسمید انتخاب شدند. حضور قطعه درجی از طریق برش آنزیمی با اطمینان بیشتری مورد تائید قرار گرفت و پلاسمید ها به منظور توالی-یابی به شرکت bioneer کره جنوبی ارسال شدند. بررسی بیوانفورماتیکی نتایج توالی یابی حاکی از جداسازی موفق راه انداز lmw-gs بود. راه انداز مذکور جهت بررسی فعالیت کارکردی آن در آندوسپرم، در حامل بیانی pcambia3301 درج شد. این حامل با استفاده از تفنگ ژنی به آندوسپرم بذور نارس گندم شلیک گشت. بیان موفق ژن تحت کنترل راه انداز جداسازی شده، در سلول های دریافت کننده سازه ژنی به صورت لکه های آبی رنگ نمودار گردید. این راه انداز می تواند به عنوان ابزار بیان اختصاصی در فرآیند تراریخته سازی گندم و احتمالا دیگر غلات مورد استفاده قرار گیرد

گیاه کتان linum usitatisimum l. حاوی مقادیر قابل توجهی از اسیدهای چرب غیر اشباع، پروتئین، فیبر و ترکیبات متنوع قابل استخراج می باشد. رشد فزآینده جمعیت جهان و افزایش تقاضا در دهه های اخیر موجب شده است تا تلاش گسترده ای در جهت افزایش کمی و کیفی کتان انجام گیرد. این درحالی است که کتان در ایران هنوز به طور عمده وارد چرخه غذایی نشده و تنها از آن به صورت محدود در صنایع دارویی و یا صنعتی استفاده می شود. امروزه دستکاری ژنتیکی این گیاه و افزایش بهره وری آن مورد توجه قرار گرفته است و بر همین اساس ارائه یک دستورالعمل جامع از نظر نوع و سطوح هورمونی مطلوب جهت باززایی واریته های رایج زراعی در این گیاه ضروری به نظر می رسد. در تحقیق حاضر، ابتدا شرایط کشت in vitro و سپس عوامل دخیل در انتقال ژن به روش ریز پرتابی در دو واریته بذر زرد و قهوه ای کتان مورد بررسی قرار گرفت. در این راستا تأثیر ژنوتیپ، نوع ریز نمونه، ترکیب محیط کشت، طول دوره پیش کشت، در ایجاد بافت های مستعد جهت تراریختی بهینه سازی شده و شرایط لازم جهت شلیک سازه ژنی نظیر فاصله مطلوب بین دیسک پاره شونده و بزرگ حامل و توری نگهدارنده و ریز نمونه هدف تعیین شدند. جهت بررسی حضور و فعالیت سازه پلاسمیدی در سلول های شلیک شده و استفاده از آن در دستورالعمل ریز پرتابی از آزمون هیستوشیمیایی gus استفاده شد. نتایج بدست آمده از مطالعات مربوط به باززایی نشان داد که بهترین ترکیب هورمونی جهت کال زایی، پاسخ به باززایی و تولید شاخساره در هر دو واریته غلظت 02/0 میلی گرم naa و 0/1 میلی گرم bap است. بالاترین میزان ریشه زایی در محیط مایع با 0/1 میلی گرم از هورمون iaa بدست آمد. در خصوص تأثیر دوره پیش کشت و سن ریز نمونه ها نیز بیشترین میزان انتقال و بیان موفق ژن در ریز نمونه-های 8 روزه واریته بذر زرد و 4 روزه واریته بذر قهوه ای دیده شد. قرار دادن ریز نمونه ها در ترکیب فواصل 2 و 9 سانتی متری دیسک پاره شونده از بزرگ حامل و توری نگهدارنده از نمونه هدف برای واریته بذر زرد و 2 و 12 سانتی متری برای واریته بذر قهوه ای در اطاقک شلیک با فشار psi 1100 و استفاده از dna پلاسمیدی خالص سازی شده به روش فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل تولید بیشترین تراریختی را نمود. تائید تراریختی از طریق آزمون های هیستوشیمیایی gus و pcr صورت پذیرفت و نتایج حاصله نشان داد که سازه شلیک شده در ژنوم 70 درصد از گیاهان تراریخته فرضی وارد گردیده و دارای فعالیت بیانی می باشد.

اندامک¬های پلاستیدی یکی از جایگزین¬های موثر برای تولید پروتئین¬های نوترکیب می¬باشد. تراریختی کلروپلاستی در قیاس با تراریختی هسته ای دارای برتری¬هایی می باشد، از جمله آن¬ها می¬توان به عدم فرار ژن، فقدان خاموشی ژن و بیان بالای پروتئین و غیره اشاره کرد. آنچه در فناوری ترانسپلاستومیک متفاوت از انتقال ژن به هسته می باشد، نیاز به استفاده از ناقل¬های اختصاصی است، جهت تولید این ناقل ها همسانه سازی قطعات نواحی معین از ژنوم کلروپلاست در حامل های پایه ضروری است. با استفاده از این حامل ها ست که ژن (های) مورد نظر شانس ورود هدفمند به ژنوم پلاستیدی را پیدا می کنند. برای تحقق این هدف با استفاده از نواحی ژنوم پلاستیدی سویا و نقشه فیزیکی ژن¬های مستقر در آن، اقدام به تعیین دو ناحیه اختصاصی برای درج ژن (های) مورد نظر نموده و سپس با استفاده از نرم افزارهای primer blast و oligo 7 برای تکثیر آنها،آغازگر¬های اختصاصی طراحی شد. این نواحی که به نواحی جناحین معروف می ¬باشند، به کمک آغازگرهای اختصاصی و با استفاده از dna ژنومی کل، که به روش ctab جدا شده و از طریق pcr تکثیر یافتند. قطعات تکثیری با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از نظر طول مورد انتظار تایید و با استفاده از کیت همسانه سازی t/a در پلاسمید خطی ptg19-t همسانه سازی شدند. برای تحقق این هدف باکتری¬های مستعد تهیه شده و با محصول واکنش اتصال که از اتصال قطعه تخلیص شده از ژل به ناقل خطی و در حضور آنزیم dnaلیگاز فاژی حاصل گردیده، مخلوط و برای تراریختی باکتری¬های e.coli سویه ?5dh مورد استفاده قرار گرفتند . نتیجه تراریختی به صورت کلونی¬های سفید در محیط گزینشگر حاوی آمپی سیلین، x-gal و iptg مطالعه گردید و از کلونی¬های سفید مثبت به واکنش کلونی pcr اقدام به کشت مایع و استخراج پلاسمید گردید. پلاسمیدهای استخراج شده پس از بررسی با برش آنزیمی ، برای تعیین توالی به شرکت ژن فناوران ارسال و سپس نتایج حاصل از تعیین توالی جهت تایید صحت کار مورد ارزیابی بیوانفورماتیکی قرار گرفتند، نتایج بررسی¬های بیوانفورماتیکی نشان دادند که توالی مربوط به نواحی همسانه سازی شده، با توالی ثبت شده در پایگاه اطلاعات نوکلئوتیدی ncbi همولوژی قریب به 100% دارد و بنابراین می توان از این قطعات برای ساخت ناقل¬های اختصاصی ترانسپلاستومیک سویا استفاده نمود.

امگاگلیادین ها 5 تا 10 درصد از پروتئین های آرد گندم را شامل می شوند. مشخصه بارزی که در ژن های امگا گلیادین وجود دارد و می‎ توان بهآن اشاره داشت وجود توالی های تکراری و فاقد اینترون می باشد. حدود 80 درصد از بیماری آنافیلاکسی ورزشی ناشی از گلیادین های گندم می باشد. همچنین گلیادین ها باعث بیماری های سلیاک و اسکلروزیس متعدد نیز می شوند. تنها راه درمان این بیماری ها رژیم غذایی فاقد گلوتن می باشد. بدلیل طاقت فرسا بودن این شیوه درمان، به نظر می رسد یکی از بهترین روش ها ممانعت از تولید امگا گلیادین با استفاده از تکنیک rnai باشد. گام نخست در این راه ساخت کاست های اختصاصی امگا گلیادین می باشد. در این پژوهش ابتدا به جداسازی قطعات مورد نیاز ژنی امگا گلیادین اقدام و سپس ساخت سازه پلاسمیدی حاوی دو قطعه سنس و آنتی سنس از ژن امگا گلیادین در پلاسمید ptg19-t انجام گرفت. در ابتدا توالی نوکلئوتیدی ژن امگا گلیادین با شماره دسترسی kf412579 به کمک نرم افزارهای blastn ، clustalw برای همردیفی و انتخاب بهترین ناحیه مورد استفاده قرار گرفت. در طراحی پرایمر اختصاصی برای تکثیر ناحیه انتخاب شده از نرم افزارهایprimr3 و oligo7 استفاده شد. پس از pcr و جداسازی قطعه ژنی امگا گلیادین و خالص سازی آن از ژل آگارز در پلاسمید ptg19-t همسانه سازی شد. بعد از تعیین توالی یابی و صحت 99 درصدی از ژن کلون شده شرایط برای ساخت پرایمر اختصاصی قطعه کوچک نیز فراهم شد. قطعه کوچک که همان آنتی سنس هم گفته می شود در اتصال دوباره به پلاسمید ptg19-t درست در جایگاه قطعه بزرگ ولی برعکس آن همسانه سازی شد تا شرایط برای ساخت rnai که ویژگی دو رشته ای شدن mrna بعد از رونویسی و از بین بردن ژن امگا گلیادین با پروتئین های موجود در سلول را دارد مهیا شد.

کلزا یکی از گیاهان یکساله و روغنی مهم است. سالیانه مقادیر بالایی روغن خوراکی برای تأمین نیاز داخلی از خارج وارد می شود. یکی از مشکلات زراعت و تولید کلزا ریزش دانه است که باعث کاهش عملکرد آن به ویژه در مناطق نیمه خشک می گردد. چندین ژن که در باز شدن غلاف و ریزش دانه دخالت دارند شناخته شده اند. یکی از راهبردهای اصلاح مولکولی برای ایجاد لاین های گیاهی کلزای مقاوم به ریزش دانه کنترل این ژن ها از طریق خاموش نمودن آن ها به روش rnai می باشد. از جمله ژن های موثر در ریزش دانه در گیاه کلزا ژن bnshp از خانواده ژنی mads-box می باشد. در این پژوهش، سازه خاموشی rnai با استفاده از همسانه سازی دو قطعه مستقیم و معکوس توالی رمز کننده ژن bnshp به منظور توقف بیان این ژن، طراحی و ساخته شده است.

تکنولوژی انتقال ژن به کلروپلاست های گیاهان، یک روش ارزشمند و در حال توسعه در مهندسی ژنتیک است این امر به دلایل مختلفی مانند سطح بالای بیان پروتئین، امکان بیان اپرونی، نبود اثرات خاموشی ژن، پلیوتروپی، اثرات موضعی و شرایط خاص ایمنی زیستی و غیره می باشد. ناقلین کلروپلاستی برای هر گونه گیاهی، حالت اختصاصی دارند و این به خاطر ورود ترانس ژن، در پدیده نوترکیبی همتا ست. وقوع این پدیده به واسطه حضور توالی های همولوگ از ژنوم کلروپلاست میزبان، در دو طرف کاست ژنی می باشد،،که در طراحی و ساخت ناقل های انتقال ژن باید در نظر گرفته شوند. در این تحقیق همسانه سازی ناحیه rrn23- rrn5 از ژنوم کلروپلاست کتان، به عنوان نواحی جناحین ناقل های پلاستیدی در نظر گرفته شد. طراحی آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر این نواحی به کمک نرم افزارهای primer-blast و analyzer oligo صورت پذیرفت. پس از استخراج ژنوم کل وتکثیر قطعه با واکنش زنجیره ای پلیمراز، و ارزیابی توسط الکتروفورز ژل آگاروز، عملیات همسانه سازی از طریق روش cloning- t/a و دستورالعمل کیت مربوطه انجام گرفت. پس از موفقیت در همسانه سازی و تایید حضور قطعه ژنوم کلروپلاستی در ناقل پلاستیدی، توالی نوکلئوتیدی آن تعیین گردید و سپس با دسترسی به این توالی نوکلئوتیدی، نسبت به تایید مولکولی آن از طریق نرم افزار بیوانفورماتیکی اقدام شد. با توجه به این که ژنوم کلروپلاست گیاه کتان توالی یابی نشده، بلاست توالی بدست آمده از قطعه rrn23-rrn5 با توالی های مشابه در ncbi، بیشترین تشابه را با گیاهانی از قبیل اکنا (گلابی وحشی)، بید، کرچک و غیره را نشان داد و به این ترتیب صحت همسانه سازی تایید شد. .....

چکیده: مولکول های افی بادی، داربست های پروتئینی کوچکی (حدود 7 کیلودالتون)می باشند، که از دومین b پروتئینa استافیلوکوکوس spa)) مشتق شده اند. این مولکول ها، پروتئین های مهندسی شده غیرایمنوژنیک با 58 آمینواسید و سه مارپیچ می باشند و مانند آنتی بادی ها ی مونوکلونال ، به تعداد زیادی از پروتئین ها و پپتیدهای هدف از جمله گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (her2) با تمایل پیوندی بالا متصل می شوند. امروزه این مولکول ها در پژوهش های بیوشیمیایی، کاربردهای تشخیصی و درمانی به ویژه در تشخیص سرطان کاربرد دارند. پس از بررسی آخرین مطالعات انجام گرفته و دسترسی به توالی قطعه dna همسانه سازی شده از سویه 1112 استافیلوکوکوس اورئوس الزام به طراحی و ایجاد تغییرات گوناگون مولکول افی بادی با 5 مارپیچ به منظور افزایش تمایل پیوندی به گیرنده her2 برای تصویربرداری از سطح سلول های سرطانی شد. پس از بررسی های بیوانفورماتیکی، برای سنتز به شرکت generay کره جنوبی ارسال گردید. در دو انتهای ژن مورد نظر دو جایگاه برشی ndei و xhoi قرار داده شد. جهت خارج سازی ژن، واکنش هضم آنزیمی با استفاده از دو آنزیم برشی فوق انجام شد. بعد از برش و آماده سازی ناقل (pet-26b) ، قطعه ژن مورد نظر توسط فرایند تخلیص از ژل آگارز طی یک واکنش اتصال با استفاده از آنزیم لیگاز به ناقل منتقل گردید. پس از خاتمه واکنش اتصال، تراریختی باکتریایی صورت گرفت. برای تراریختی باکتریایی، سلول های مستعد دریافت پلاسمید، تهیه گردید. برای تهیه این سلول ها، از محلول tss استفاده شده و وارد کردن پلاسمیدهای نوترکیب در سلول های باکتریایی و تکثیر آن در باکتری با استفاده از روش شوک حرارتی صورت گرفت. سپس سلول های تراریخته، کشت و کلون های حاصل مورد گزینش و غربالگری قرار گرفتند. از کلنی های حاصل اقدام به جداسازی پلاسمید به روش لیز قلیایی صورت گرفته و تأیید قطعات همسانه سازی شده با آنزیم های برشی، صورت گرفت. پس از مشاهده قطعه مورد نظر در ژل و تطبیق اندازه آن با نوار نشانگر وزنی مولکولی، جهت تأیید توالی نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر برای توالی یابی ارسال گردید. به منظور بررسی بیان پروتئین، ناقل حامل قطعه به باکتری e. coli سویه bl21 منتقل گردید. مقایسه کل پروتئین استخراج شده از باکتری های تراریخت و شاهد با استفاده از روش sds-page مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نهایی نشان داد که بیان افی بادی سنتزی در سیتوپلاسم ، تأثیر منفی بر رشد باکتری های تراریخته نمی گذارد.

دارپینها )پروتئینهای تکرار انکرین طراحی شده( گروه جدیدی از داربستهای پروتئینی کوچک غیرایمنولوژیک با پتانسیل غلبه بر محدودیتهای پادتنهای مونوکلونال هستند که از ژنوم انسان مشتق شده است. این مولکولها، پروتئینهای غیرایمنولوژیک مهندسی شده میباشند، که به تعداد زیادی به پروتئینها و پپتیدهای هدف از جمله گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی ) her2 ( با تمایل پیوندی بالا متصل میشوند و از روشهای نوین درمانی محسوب می شوند

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.