چکیده: اشریشیاکلی انتروهموراژیک o157:h7(ehec) در انسان موجب عفونت های روده ای از فرم اسهال بدون خون ریزی تا کولیت هموراژیک و سندروم اورمی همولیتیک (huc)می شود. انتقال e. coli o157:h7 از طریق آب و غذای آلوده بوده و مهمترین و اصلی ترین مخزن این باکتری حیواناتی مانند گاو و گوسفند می باشند. این باکتری قادر است که آسیب های attaching/effacing ((a/e در سلول های اپیتلیال روده میزبان ایجاد کند. محصول پروتئینی چندین ژن در اتصال باکتری به دیواره روده و تخریب آن دخیل هستند. در این میان espa مهم ترین پروتئین سیستم ترشحی تیپ ??? می باشد و باعث انتقال پروتئین tir(گیرنده intimin) به سلول میزبان می شود. پروتئین intimin یکی از مهم ترین عوامل در ایجاد ضایعات attaching/effacing (a/e) است. در این پژوهش اپی توپ های موثر دو پروتئین espa و intimin با لینکری که از تداخل کونفورماسیون آن دو جلوگیری می کند، به هم متصل شده و درون وکتور pet28a کلون شد. پروتئین کایمریک پس از بیان در میزبان اشریشیا کلی و تخلیص به موش تزریق گردید. نتایج الایزا از سرم موش های گروه تست نسبت به کنترل افزایش قابل ملاحظه ای در تیتر آنتی بادی نشان داد. میزان اتصال باکتری به اپی تلیوم روده در موش های ایمن و کنترل از طریق shedding مورد ارزیابی و بررسی قرار گرفت که نتایج نشان دهنده کاهش اتصال باکتری به اپی تلیوم روده موش های ایمن بود.

هلیکوباکتر پیلوری یک باکتری گرم منفی اسپیرال و میکروآئروفیل است که در لایه مخاطی معده انسان تکثیر یافته و ایجاد عفونت می نماید. عفونت ایجاد شده توسط این باکتری که با تخریب بافت پوششی معده همراه است، منجر به التهاب مزمن معده می گردد که می تواند سبب ایجاد زخم های معده و دوازدهه گردد. مشکلات ناشی از درمان با آنتی بیوتیک ها باعث شده است که محققین رویکردهای جدیدی برای درمان عفونت های ناشی از h.pylori به کار گیرند، که از جمله آنها درمان های اختصاصی با آنتی بادی ها می باشد. آنزیم اوره آز به عنوان یکی از مهمترین عوامل بیماری زا و آنتی ژنیک این باکتری، هدف مناسبی برای این منظور است. هدف از این مطالعه بررسی اثر igy خوراکی تولید شده بر علیه آنزیم urec از باکتری h.pylori برای درمان موش های مبتلا به زخم معده می باشد. در این تحقیق پس از انتقال سازواره نوترکیب به باکتری e.coli سویه bl21de3، پروتئین نوترکیب مورد نظر بیان شد. پروتئین نوترکیب از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبیni-nta تخلیص و در نهایت پس از تزریق به مرغ نژاد لگ هورن سفید، igy تولید شده از زرده تخم مرغ با ترسیب به کمک پلی اتیلن گلیکول تخلیص شد و با سنجش الایزای غیر مستقیم مورد ارزیابی قرار گرفت. تعداد 109 باکتری در محیط bhi (lµ 400) سه بار بصورت یک روز در میان به معده موش های c57bl/6j تلقیح شد. به موش های شاهد، به همان میزان، محیط کشت مایع bhi تلقیح گردید .هشت هفته پس از آخرین تلقیح از موشها خونگیری و سرم آنها جدا شد و میزان آلودگی توسط elisa مورد ارزیابی قرار گرفت. شدت التهاب معده توسط تست پاتولوژیکی بررسی شد. موشهای آلوده به مدت 28 روز هر کدام توسط mg 60 از igy حل شده در lµ500 pbs به صورت خوراکی مورد تیمار قرار گرفتند. بررسی های sds-page نشان داد که پروتئین نوترکیب به خوبی بیان و تخلیص شده است. نتایج بدست آمده از الایزای غیرمستقیم نشان دهنده تیتر بالای آنتی بادی در سرم و زرده تخم مرغ ها می باشند. همچنین نتایج elisa نشان دهنده ایجاد آلودگی به میزان 53% توسط h.pylori در موشهای c57bl/6jبود. نتایج پاتولوژی وجود التهاب در معده موشهای آلوده را تائید کرد. کاهش چشمگیری در تیتر آنتی بادی موشهای آلوده و درمان شده با igy در مقایسه با موشهای آلوده و تیمار نشده، دیده شد. با توجه به نتایج این تحقیق تولید آنتی بادی های مرغی در مهار وکنترل التهاب و عفونت معده توسط هلیکوباکتر پیلوری موثر بوده و از آنجایی که تولید انبوه این نوع آنتی بادی آسان و اقتصادی می باشد، igy می تواند جایگزین مناسبی برای آنتی بیوتیک ها در درمان عفونت هلیکوباکتر پیلوری باشد.

عفونت با باکتری escherichia coli o157:h7 می تواند منجر به اسهال خونی یا سندرم اورمی همولیتیک با آسیب کلیوی (بیماری نادر اما کشنده) شود. پروتئین های intimin ، tir و espa فاکتورهای بیماری زای بیان شده توسط لوکوس lee باکتری e.coli انتروهموروژیک هستند. این باکتری به پروتئین espa به عنوان رابطی برای انتقال tir به سلول میزبان نیاز دارد و intimin در سطح قرار می گیرد که باکتری را به tir منتقل شده متصل می کند. در این تحقیق dna واکسن متشکل از ژن های eae, tir و espa برای بررسی ایمنی زایی مورد تزریق قرار گرفتند. ژن مولتی مر برو روی سه وکتور یوکاریوتی paav-mcs-gfp و pci-neo و pegfp-n1 کلون شد. paav-mcs-gfp و pegfp-n1 برای بررسی بیان ژن در سلول های t.293 مورد استفاده قرار گرفتند. و دو وکتور paav-mcs-gfp و pci-neo و به عنوان dna واکسن به کار رفتند. گروه های تست چهار بار با 50 میکروگرم paav-mcs-gfp و pci-neo مورد تزریق درون ماهیچه ای قرار گرفتند. موش های کنترل تحت همان شرایط وکتور pci-neo و pbs دریافت کردند. خون گیری قبل از تزریقات انجام شد. تیتراسیون سرم نشان داد که موش های balb/c تست تزریق شده با dna واکسن در مقایسه با گروه های کنترل به طور موفقیت آمیزی ایمن شده اند و در چالش با باکتری e.coli o157:h7 به صورت دهانی، محافظت نشان دادند. وکتورهای حاضر dna واکسنی بوجود آوردند که ایمنی محافظتی را به تنهایی یا در ترکیب با دیگر شیوه ها ایجاد می کنند. روش کار به شرح زیر بود: 1- طراحی وسنتز ژن نوترکیب وپرایمرهای اختصاصی آن 2- همسانه سازی قطعه ی موردنظر در وکتور dna واکسن و تراریخت نمودن آن در میزبان موقت 3- تخلیص وکتور همسانه سازی شده از میزبان موقت به مقدار زیاد 4- تزریق آن به موش وسنجش ایمنی زایی از طریق الایزا 5- خوراندن باکتری e.coli o157:h7 به موش و بررسی ایمنی زایی dna واکسن 6- انتقال وکتور dna واکسن به سلولهایt293 در محیط کشت و بر رسی بیان با استفاده از مارکر فلورسانس gfp که در زیر میکروسکوپ فلورسانت به رنگ سبز فسفوری دیده می شود.

عفونت های اسهالی یکی از شایعترین بیماری ها در سراسر جهان هستند.دو جنس shigella و escherichia اعضای مهم خانواده انتروباکتریاسه ها ( enterobacteriaceae) و عامل اصلی اسهال های عفونی می باشند. شیگلا از طریق تهاجم به سلول های اپی تلیال روده باعث ایجاد اسهال وشیگلوزیس می شوند.یکی از کلیدی ترین پروتئین هایی که در تهاجم نقش دارد ipac است. باکتری های دیگری از جمله etecو ehecاز جمله عوامل عمده در ایجاد اسهال هستند.عامل بیماریزائی اصلی در etec ، cfa/iاست که از دو زیر واحد cfab و cfaeتشکیل شده است. در باکتری ehec، اولین مرحله برای عفونت زایی،اتصال پروتئینی به نام intimin به لایه اپی تلیال میباشد که توسط ژن eae کد می شود. بنابراین با تولید واکسنی شامل این سه پروتئین شاید بتوان از اتصال سه باکتری مذکور ومتعاقبا ایجاد اسهال جلوگیری کرد. هدف از این تحقیق طراحی و تولید پروتئین کایمر(cii) از سه ژن cfab, eae و ipac که بتواند برعلیه این سه باکتری ایمنی ایجاد کند. ژن کایمر ;cii که شامل نواحی ایمونوژیک سه پروتئین فوق بود طراحی و بهینه سازی کدونی شد. آنالیزهای بیوانفورماتیکی و ایمونوانفورتیکی بر روی ژن نوترکیب کایمر انجام شد. بعد از سنتز، این ژن در e. coli کلون و بیان شد. به منظور بررسی ایمنی زایی cii، موش، خوکچه هندی ورده سلولی caco-2 به عنوان مدل برای چالش باکتری های ehec،shigella وetec به ترتیب، انتخاب شدند. نتایج حاکی از این بود که پروتئین cii پاسخ ایمنی قوی القا میکند. بنابراین این پروتئین کایمر می تواند به عنوان یک کاندید واکسن بر علیه طیف گسترده ای از عفونت های اسهالی مورد مطالعه بیشتری قرار گیرد.

بوتولینوم یکی از سمی ترین موادی است که بر روی سیستم اعصاب محیطی تاثیرگذار است که باعث ایجاد فلج شل حاد می شود.بنابراین تشخیص سریع و درمان نوروتوکسین های بوتولینوم ضروری به نظر می رسد.آنتی بادی ها به عنوان ابزارهای مهمی در تحقیقات، تشخیص و درمان بیماری ها شناخته شده اند.نانوبادی های جزء آنتی بادی های زنجیره سنگین شتری هستند که در مقایسه با آنتی بادی های کلاسیک دارای ویژگی های خاصی هستند.بلوغ تمایلی آنتی بادی ها کاربرد آنها را در پزشکی و پروژه های تحقیقاتی تسهیل کرده است.با نمایش قطعات آنتی بادی ها در سطح فاژ، می توان فاژهای مخصوص آنتی ژن را جداسازی نمود. برای انجام غنی سازی مراحل غربالگری چندین بار تکرار می شود.در تحقیق گذشته، نانوبادی اختصاصی علیه نوروتوکسین کلستریدیوم بوتولینوم نوع e به دست آمد.در این تحقیق هدف بهبود تمایل این نانوبادی به وسیله ی تکنیک زنجیره پلی مراز مستعد خطا است.بدین منظور کتابخانه ای جهشی از ژن نانوبادی علیه نوروتوکسین کلستریدیوم بوتولینوم نوع e با بهره گیری از واکنش زنجیره پلی مراز مستعد خطا ساخته شد.بدین منظور قطعات vhh کلون شدند و برای انجام مراحل غربالگری بر سطح فاژ به نمایش گذاشته شدند.فاژهای متصل شده باکتری را آلوده می کنند و برای مرحله بعدی غنی سازی و نیز آنالیز میزان اتصال مجددا تکثیر داده می شوند.بعد از انجام فاژ-الایزا و انتخاب چند کلونی، بیان نانوبادی به انجام رسید.نتایج الایزای تمایلی نشان از افزایش 8 درصدی در تمایل این نانوبادی داشت.