acinetobacter baumannii یک پاتوژن فرصت طلب مهم است که به عنوان عامل تعداد زیادی از عفونت های بیمارستانی شناخته می شود. تمایل گونه های بیمارستانی به تولید بیوفیلم و ارتباط بیوفیلم با عفونت زایی و مقاومت این باکتری به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها، به خوبی شناخته شده است. آنتی بادی های مونوکلونال علیه عوامل سطحی، می تواند برای مهار بیوفیلم و در نتیجه کمک به حل مشکلات ناشی از عفونت های این باکتری مورد استفاده قرار گیرد. مطالعه ی حاضر، به منظور غلبه بر تهدیدات ناشی از این پاتوژن، برای یافتن دومین های عمل کردی و حفظ شده از یک پروتئین سطحی دخیل در تولید بیوفیلم، با استفاده از ابزار بیوانفورماتیک، طراحی شده است. بیوفیلم پروتئین a. baumannii (bap) دارای یک هسته ی متشکل از تکرار های متوالی از هفت الگوی مختلف است که از a تا g نام گذاری شده اند. حفظ شده ترین قسمت ها و نیز دومین های هومولوگ با بالاترین امتیاز در همین هسته ی تکراری خصوصاً a ، b ، c و d یافت می شوند. توالی های مرتبط با bap از بانک های اطلاعاتی موجود استخراج شده و با توالی bap هم-ردیف شدند. فایل های هم ردیفی برای ساخت درخت های فیلوژنتیک به کار گرفته شدند. در این مطالعه محل قرار گیری پروتئین در خارج سلول و وجود سیگنال هدف سیستم ترشحی نوع اول در انتهای کربوکسیل پروتئین پیش بینی شد. همچنین ساختار های دوم و سوم پروتئین پیش بینی شد.در نهایت چهار ناحیه ی حفظ شده ی مهم از نظر ساختاری و عمل کردی از این پروتئین انتخاب گردیده و برای آن ها چهار جفت پرایمر طراحی شد. مطالعه ی آنتیژنسیته و حلالیت نشان می دهد که این نواحی کاندیدای مناسبی برای تولید آنتی بادی هستند.

اشریشیا کلی انتروهموراژیک (ehec) o157:h7 عامل بیماری التهاب روده خون ریزی دهنده می باشد و مهم ترین مخزن این باکتری گاو است. با وجود شیوع کم این باکتری، شدت بیماری های ناشی از اشریشیا کلی بیماری زای روده ای، نگرانی هایی راجع به ایجاد واکسن های موثر پدید می آورد(?). پس از تولید سمی شبیه شیگاتوکسین، ابتدایی ترین عامل بیماری زایی ehec o157:h7 کلونیزاسیون آن بر اپی تلیوم روده است که منجر به ایجاد آسیب های اتصال/تخریب توسط پروتئین های کدشده از جزایر بیماری زایی می گردد. این ژن ها از جمله شامل tir است که پروتئین کدشده از آن، به غشای سیتوپلاسمی سلول اپی تلیال میزبان وارد شده به عنوان گیرنده ی intimin- پروتئین سطحی ehec- عمل می کند. در این پژوهش قطعه ای کایمر با به کار بردن اپی توپ های موثر intimin (int282c) و tir(tir105) که با توالی [(eaaak)4] به عنوان اتصال دهنده به هم پیوسته بودند، ساخته شد. این سازه سنتز شد و روی وکتور pet28a+ زیرهمسانه سازی شد و در اشریشیا کلی bl21 با استفاده از iptg القا گردید. پروتئین کایمر نوترکیب خالص شده، به موش ها تزریق شد و افزایش معنادار آنتی بادی به کمک elisa مورد سنجش قرار گرفت. برای سنجش اثر آن به عنوان کاندیدایی برای حفاظت در برابر باکتری های زنده، بر اتصال باکتری به لایه ی اپی تلیال روده، چالش با استفاده از ehec o157:h7 انجام شد. در پانزده روز پس از خوراندن ???? باکتری به موش ها، ریزش باکتری به کمک تهیه سریال های رقت در ? گرم مدفوع مورد شمارش قرار گرفت. نتایج بیان گر کاهش سریع تر تعداد e. coli o157:h7 در مدفوع موش های گروه تست در مقایسه با گروه کنترل بود. سرانجام برش های بافتی از سکوم و کولون آماده شده و بین دوگروه مقایسه شد. تعداد باکتری های اتصال یافته در بافت های موش های ایمن شده(گروه تست) کم تر از تعداد آن در بافت های موش های ایمن نشده(گروه کنترل) بود.

هلیکو باکتر پیلوری helicobacter pylori باکتری گرم منفی اسپیرال و میکروآیروفیل است که در لایه مخاطی معده انسان تکثیر و ایجاد عفونت می نماید، در این مطالعه زیر واحد c آنزیم اوره آز و یک ناحیه bp610 از انتهای کربوکسیلی آن بعنوان کاندید واکسن بر علیه هلیکو باکتر پیلوری انتخاب ، بصورت نوترکیب تولید و پس از بررسی با sds-page تخلیص شد. ایمنی زائی هر دو پروتئین پس از تزریق به موش ماده c57bl6/jوتکمیل دوره ایمن سازی مورد ارزیابی قرار گرفت. تیتر بالای آنتی بادی تولید شده نشان دهنده شناسایی زیر واحدc آنزیم اوره آز توسط هر دو پروتئین می باشدو امکان استفاده از هر دو نوع پروتئین به عنوان کاندید واکسن را مطرح می نماید. در ادامه این مطالعه ، cfu109 از باکتری هلیکوباکترپیلوری جدا شده از بیماران ایرانی سه بار در مدت پنج روز، از طریق گاواج به معده هر موش تلقیح شد. موش های کنترل نیز محیط کشت مایع فاقد باکتری را دریافت نمودند. شش هفته پس از آخرین تلقیح تولید آنتی بادی به روشelisa ارزیابی شد. به منظورسنجش التهاب از معده موش های ایمن وکنترل نمونه برداری و مورد ارزیابی پاتولوژیکی قرار گرفتند. نتایج بدست آمده از مطالعات پاتولوی نتایج elisa را تائید کرد.

سلول های باسیلوس لیکنی فرمیس از طریق به دام اندازی در ریزمهره های کلسیم آلژینات تثبیت شدند و بیوکاتالیست های تثبیت شده برای تولید پروتئاز قلیایی به روش batch های تکرار شونده مورد استفاده قرار گرفتند. روش تثبیت با تاکید بر پایداری بیدها به روش آماری فاکتوریل کامل بهینه سازی شد که دو فاکتور نوع آلژینات و غلظت کلرید کلسیم هر کدام در سه سطح و در دو سرعت هم خوردن محیط مورد آزمایش قرار گرفتند. همچنین تاثیر بهینه سازی محیط کشت تولید با استفاده از روش تاگوچی و به دام اندازی سلول ها در بیدهای کلسیم آلژینات بر تولید پروتئاز قلیایی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بهینه سازی محیط کشت و تثبیت سلولی هر دو می توانند باعث افزایش تولید پروتئاز قلیایی شوند به طوری که بهره وری حاصل در این شرایط در مقایسه با حالت سلول های آزاد در محیط قبل از بهینه سازی، 3/7 برابر افزایش یافت. روش batch های تکرار شونده با استفاده از شرایط بهینه شده تثبیت نیز برای 12 سیکل به طور موفقیت آمیز مورد استفاده قرار گرفت. واژگان کلیدی: باسیلوس لیکنی فرمیس، پروتئاز قلیایی، تثبیت سلولی، بهینه سازی، روش آماری فاکتوریل کامل، روش تاگوچی

acinetobacter baumannii یک پاتوژن فرصت طلب مهم است که به عنوان عامل تعداد زیادی از عفونت-های بیمارستانی شناخته می شود. تمایل گونه های بیمارستانی به تولید بیوفیلم و ارتباط بیوفیلم با عفونت زایی و مقاومت این باکتری به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها، به خوبی شناخته شده است. آنتی بادی های ایجاد شده علیه عوامل سطحی، می تواند برای مهار بیوفیلم و در نتیجه کمک به حل مشکلات ناشی از عفونت های این باکتری مورد استفاده قرار گیرد. مطالعه ی حاضر، به منظور غلبه بر تهدیدات ناشی از این پاتوژن با استفاده از زیر واحد 371 اسید آمینه ای از بخش های عملکردی و حفاظت شده از یک پروتئین سطحی دخیل در تولید بیوفیلم، برای ایجاد ایمنی در موش آزمایشگاهی، طراحی شده است. در این پژوهش موش های balb/c ، در سه نوبت با تزریق زیرپوستی پروتئین نوترکیب خالص، ایمن شده، هفت روز پس از آخرین یادآوری با سوش بیمارستانی آلوده شدند. مقایسه ی میزان بقا و آسیب های بافت کبد حیوانات ایمن با گروه کنترل، بیانگر نقش حفاظتی موأثر این ایمنی زایی است. در ضمن واکنش آنتی بادی ها علیه این زیر واحد با سویه های مختلف a. baumannii نشانه ی حفظ شدگی این زیر واحد در سویه های مختلف تولید کننده ی بیوفیلم است. این نتایج، به همراه اثر کاهنده ی این آنتی بادی ها بر روی تشکیل بیوفیلم a. baumannii ، نشان می دهد که این پروتئین می تواند گزینه ی مناسبی برای تولید یک واکسن جدید نوترکیب باشد.

سری سل لاین های رازی اولین رده های سلولی نامیرا در جهان می باشند که براساس خصوصیت قطع ارادی و بازیابی دم که در مارمولک ها رایج است تولید شده اند. در این مطالعه رده سلولی رازی دو که دومین سلول بنیادی تولید شده از دم جکوی دم خشن (cyrtopodion scabrum)است از نظر خصوصیات بیولوژیک و برخی جنبه های کاربردی مورد بررسی قرارگرفت. روش کار بدین صورت بود که هویت رده سلولی رازی دو از لحاظ عدد کاریوتایپ، آنالیز ایزوآنزیم، بررسی ژن آلدولاز و سرعت رشد طی پاساژهای مختلف تعیین گردید. همچنین میزان تومورزایی و خواص ضد سرطانی این رده سلولی نیز از طریق آزمون آگار و بررسی اثر عصاره رده سلولی رازی دو روی میزان رشد سلول های سرطانی کولون بررسی شد. از جنبه کاربردی نیز توانایی این رده سلولی در تکثیر ویروس آنفلوانزای پرندگان، ویروس نیوکاسل و تک یاخته درون سلولی نئوسپورا کانینوم مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده نشان داد که عدد کاریوتایپ این رده سلولی 58 و مدت زمان دو برابر شدن تعداد سلول ها 18 ساعت می باشد. آزمون آلدولاز، ایزو آنزیم و کاریوتایپ نیز منشاء این رده سلولی را که جکوی دم خشن بود تأیید کردند. تیتر ویروس آنفلوانزا و نیوکاسل کشت شده روی این رده سلولی به ترتیب به 1280 و 256 واحد ha در 50 میکرولیتر رسید. در مورد نئوسپورا گرچه این تک یاخته به سلول وارد می شد لیکن سرعت تکثیر آن بسیار کند بود . در مجموع با توجه به نتایج بدست آمده می توان اعلام کرد که رده سلولی رازی دو جزء سریعترین رده های سلولی از نظر رشد می باشد و با داشتن خواص ضد سرطانی همراه با توان بالای تکثیر ویروس های آنفلوانزای پرندگان و نیوکاسل می تواند به عنوان یک رده سلولی جدید در تحقیقات تولید واکسن برای این ویروس ها بطور جدی مطرح گردد.

خاموش سازی ژن القاء شده توسط ویروس (vigs)، فن آوری است که از ویروس های نوترکیب برای خاموش کردن ژن های درون زاد بر اساس یک روند خاموش سازی پس از رونویسی عمل می کند. vigs روشی سریع و قوی برای ژنومیکس کاربردی می باشد، که نیاز به انتقال پایدار ندارد. به طور معمول برای vigs، از ناقل های ویروسی دربردارنده یک توالی همولوگ با ژن درون زاد استفاده می-شود. این ناقل عامل ایجاد خاموشی ژن هدف در میزبان گیاهی از طریق یک راهکار تخریب rna وابسته به همولوژی می باشد. ما از ناقل ویروسی (tobacco rattle virus) trv برای خاموش سازی ژن pds با دو روش همولوگوس و هترولوگوس استفاده کردیم. این ناقل دارای مزایایی مانند طیف گسترده میزبان، تهاجم سلولی یکنواخت و علائم خفیف بیماری می باشد. ژن فیتوئن د سچوراز یک آنزیم مهم محدود کننده سرعت در مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدها را کد می کند. بنابراین خاموش سازی این ژن سطح بیان را کاهش می دهد و روی محتوای کاروتنوئیدی سلول اثر می گذارد و در نهایت منجر به فنوتیپ ظاهری سفید شدگی نوری می شود. گیاه شاهبیزک (atropa belladonna) و تاتوره (datura stramonium) از گیاهان دارویی مهم می باشند، که مطالعه ژن های مسیر بیوسنتز آلکالوئیدها در آن از اهمیت زیادی برخوردار است. در این پژوهش، از فناوری vigs هترولوگوس و همولوگوس برای خاموش سازی ژن نشانگر فیتوئن دسچوراز ( (pdsدر این گیاهان استفاده کردیم. ناقل های trv نوترکیب، حامل ژن برون زاد از nicotiana benthamiana و ژن های درون زاد همسانه سازی شده از تاتوره و شابیزک بودند که به گیاهان تاتوره و شاهبیزک تزریق شدند. نتایج نشان داد که گیاهان آلوده شده با ناقل های ویروسی در هفته سوم بعد از تزریق شروع به سفید شدگی نوری کردند. نتایج بدست-آمده بیانگر کاهش مقدار کلروفیل ها و کارتنوئیدها در برگ های هر دو گیاه ما نسبت به گیاه شاهد و کنترل منفی بود. از روش سنجش بیان نیمه کمی برای بررسی بیان ژن هدف در تاتوره استفاده شد و نتایج کاهش بیان ژن pds در نمونه های خاموش سازی شده را نسبت به گیاهان کنترل نشان داد. نتایج ما همچنین اثرگذاری ناقل ویروسی روی محتوای آلکالوئید کل در تاتوره را نشان داد. این اولین گزارش درباره خاموش سازی ژن با روش vigs در گیاهان شاهبیزک و تاتوره می باشد و می تواند ابزار مفیدی برای بررسی عملکرد ژن های هدف برای مهندسی متابولیسم در این گیاهان باشد.

هیدرولیز اسید رقیق سبب آزاد سازی قند های موجود در ساختار همی سلولزی می شود، اگر چه در این میان سبب ایجاد ترکیبات ممانعت کننده ای مانند فورفورال و مشتقات شکست لیگنین می شود. بنابراین داشتن میکرارگانیسمی با فعالیت زایلانازی و مقاوم نسبت به ترکیبات ممانعت کننده می تواند سبب افزایش بازده تولید اتانول شده و قیمت تولید آن را قابل رقابت با بنزین کند. به منظور جداسازی مخمر های تجزیه کننده زایلان، محیط های طبیعی مانند زمین های کشاورزی و بقایای پوسیده ی گیاهان نمونه برداری شدند. اتانول تولیدی به منظور انتخاب مخمر برتر اندازه گیری شد و 5 مخمر برتر با روش های مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شدند. اتانول تولیدی مخمر های برتر در محیط حاوی هیدرولیزات باگاس نیشکر مورد ارزیابی قرار گرفت و مخمر 26 به عنوان سویه ی برتر انتخاب شد. طراحی آزمایشات جهت انتخاب بهترین محیط که حاوی ترکیبات ارزان قیمت جهت تولید اتانول باشد، انجام شد. نتایج حاکی از آن بود که ایجاد سازش در سوش 26 در محیط های حاوی هیدرولیزات باگاس ×2 (دوبار تغلیظ) سبب بهبود تولید اتانول شد. درنتیجه ی توانایی رشد بهتر و مصرف قند، غلظت اتانول تولیدی در نهایت بهg/lit 6 رسید.

اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک علت اصلی اسهال درکشورهای در حال توسعه است. دو شاخص ویرولانس etec عبارت است از: کلونیزاسیون در روده ی کوچک و تولید انتروتوکسین ها. اتصال با واسطه ی آنتی-ژن های فاکتورهای کلونیزاسیون انجام می شود و پس از اتصال، باکتری یک یا چند انتروتوکسین تولید می کند و نتیجه ی این وقایع ترشح مایعات به صورت اسهال است. فیمبریه ی cs3 یکی از شایع ترین آنتی ژن های فیمبریال یافت شده در ایزوله های کلینیکی است. کلاستر ژنی مسئول بیوسنتز cs3 شامل ژن های csta-csth است. ثابت شده است که csth کدکننده ی زیرواحد اصلی فیمبریه است و نقش اساسی در اتصال باکتری به سلول های اپی تلیال روده ی کوچک دارد. این زیرواحد یک کاندید فرضی در توسعه ی واکسن محسوب می شود. بر اساس مطالعات اپیدمیولوژی و کلینیکی، بهترین کاندید واکسن برای etec، واکسنی است که شامل فاکتورهای کلونیزاسیون و هم چنین انتروتوکسین باشد. زیرواحد b توکسین حساس به حرارت که توسط بیشتر ایزوله های etec تولید می شود، در مقایسه با زیرواحد a این توکسین خصوصیات ایمنولوژیک بیشتری دارد. در مطالعه ی حاضر، ما یک پروتئین کایمر (csth-ltb) طراحی نموده ایم که می تواند به عنوان یک واکسن کاندید بر علیه این پاتوژن در نظر گرفته شود؛ به طوری که شامل هر دو عامل ویرولانس etec باشد. توالی ژن های کدکننده ی csth و eltb از بانک ژن به دست آمد و توسط نرم افزارهای بیوانفورماتیکی اپتیمایز شد. توالی ژن کایمر با اتصال این دو توسط لینکری مناسب ساخته شد. ژن سنتتیک که در وکتور puc57 سنتز شد، در وکتور pet28a زیرهمسانه سازی گردید. زیرهمسانه سازی با آنالیز برش آنزیم های محدودکننده تایید شد. بیان پروتئین نوترکیب در باکتری e.coli bl21de3 انجام و توسط وسترن بلات با آنتی بادی ضد his tag تایید شد. پروتئین های تخلیص شده برای تولید آنتی بادی به موش های سوری نژاد balb/c و خرگوش تزریق شد. تست الایزا با استفاده از سرم حیوان برای تعیین تولید آنتی بادی انجام گرفت. کارآمدی آنتی بادی توسط سنجش لوپ ایلئال خرگوش و اتصال به سلول های caco-2 تایید شد. آنالیزهای ایمنولوژیک تولید تیترهای بالای آنتی بادی اختصاصی را در حیوانات ایمن نشان داد. آنتی بادی ضد پروتئین کایمر، توانست به فیمبریه ی cs3 متصل و مانع از اتصال باکتری گردد. نتایج نشان می دهد پروتئین کایمر نوترکیب می تواند به عنوان یکی از مهم ترین اجزای واکسن علیه etec در نظر گرفته شود.

اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک (etec) علت اصلی اسهال درکودکان زیر 5 سال در کشورهای در حال توسعه و همچنین عامل مهم اسهال مسافرتی می باشد. بنا براین طراحی و تولید واکسن بر علیه این بیماری از اهداف سازمان جهانی بهداشت می‏باشد. انتروتوکسین و فاکتورهای کلونیزاسیون دونوع از فاکتور‏های اصلی ویرولانس etec هستند که فاکتورهای کلونیزاسیون، برای اتصال به سلول‏های اپیتلیال روده ضروری‏اند. از شایعترین فاکتورهای کلونیزاسیون می‏توان به cs6 اشاره نمود. cs6 از دو زیر واحد ساختاری cssa وcssb تشکیل شده است که در اتصال باکتری به سلول های روده نقشی اساسی دارند. از جهتی، نیمی از اشرشیاکلی‏های انتروتوکسیژنیک بیان کننده انتروتوکسین حساس به حرارت(lt) هستند. طراحی و تولید واکسن های بر علیهetec بر اساس دو راهکار جلوگیری از اتصال به سلولهای روده و جلوگیری از فعالیت توکسین است. بنابراین در این مطالعه یک پروتئین نوترکیب متشکل از زیر واحد های cssa وcssb و blt به عنوان کاندیدای واکسن طراحی شد. اطلاعات این 3 ژن از بانک ژن استخراج و به وسیله لینکر، یک ساختار کایمر سه تایی ایجاد شد. توالی کد کننده با استفاده از ترجیح کدونی در ecoli طراحی شد. سپس در وکتور puc57سنتز ودر وکتور بیانی pet28a زیرهمسانه سازی و بیان شد. صحت پروتئین نوترکیب به وسیله آزمایش وسترن بلات تایید و پروتئین با ستون کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گشت. مطالعه ایمنی زایی پروتئین کایمر تخلیص شده در موش و خرگوش انجام شد. نتایج تست الایزا با سرم موش و خرگوش برای تعیین تولید آنتی بادی نشان دهنده تولید تیتر بالای آنتی بادی بود. همچنین پیش انکوبه کردن سلولهای روده ای caco-2 با سرم حیوانات مدل ایمن شده، اتصال باکتری را به این سلول ها تا حد قابل توجهی کاهش داد. کارایی آنتی بادی بر علیه lt نیز با تست سنجش لوپ ایلئال خرگوش تایید گشت.با توجه به نتایج به دست آمده، پروتئین کایمر نوترکیب می‏تواند به عنوان یک پروتئین ایمونوژن از اجزای مهم واکسن بر علیه etec باشد.

چکیده مخمر پیکیا پاستوریس یک میزبان برجسته برای تولید پروتئین های نوترکیب است و در مقایسه با دیگر سیستم های بیانی مزایای فراوانی دارد. از جمله اینکه این سیستم به عنوان یک یوکاریوت، قادر است تعداد زیادی از تغییرات پس از ترجمه همچون پردازش پروتئولتیک، فولدینگ صحیح، تشکیل پیوند های دی سولفیدی و گلیکوزیلاسیون پروتئین ها را انجام دهد. همچنین قادر به استفاده از متانول به عنوان تنها منبع کربن در غیاب گلوکز و ترشح پروتئین های تولید شده به محیط می باشد. با وجود این مزایا پیکیا پاستوریس می تواند یک جایگزین عالی برای سیستم بیانی اشرشیا کلی باشد. در این پژوهش، آنتی بادی زنجیره سنگین شتری علیه نوروتوکسین بوتولینوم نوع e در پیکیا پاستوریس بیان و سپس تخلیص گردید. ژن vhh دروکتور ppink-hc کلون و در ابتدا به باکتری اشرشیا کلی(top10) منتقل شد. وکتور™ pichiapink حاوی ژن vhh به منظور ورود به ژنوم مخمرخطی شد و به سلول های مستعد مخمری منتقل گردید. تعدادی از کلونی های ترانسفورم شده انتخاب و در محیط کشت بیانی مخمر(bmgy ) کشت داده شد. vhh نوترکیب درپیکیا پاستوریس بیان شد. بیان پروتئین به وسیله sds-page آنالیز گردید و مشاهده شد که میزان بیان پروتئین در مخمر پیکیا پاستوریس نسبت به باکتری اشرشیا کلی بالاتر است. کارایی نانوبادی بیان شده در مخمر، در بدن موجودات زنده (موش) مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین مقایسه ای میان کارایی نانوبادی بیان شده در مخمر و باکتری صورت پذیرفت. نانوبادی بیان شده در مخمر توانست در بدن موش های مورد آزمایش، دوز کشنده 50 درصد توکسین را، در 25 درصد موش ها تا 4 برابر افزایش دهد. همچنین نانوبادی بیان شده در باکتری توانست زمان زنده ماندن موش ها را به دو برابر افزایش دهد. در پایان مشخص شد که نانوبادی بیان شده در مخمر در جهت مهار توکسین کارایی بهتری دارد.

در طول دو دهه گذشته مخمرمتیلوتروفیک پیکیا پاستوریس به عنوان یکی از موفق ترین سیستم های بیانی جهت تولید انواعی از پروتئینهای نوترکیب مورد استفاده قرار گرفته است. این مخمر قابلیت انجام بسیاری از تغییرات پس از ترجمه ای یوکاریوتی مانند گلیکوزیلاسیون، تشکیل پیوندهای دی سولفیدی و در نتیجه فولدینگ صحیح پروتئین دارد. با وجود این مزایا، پیکیا پاستوریس می تواند یک جایگزین عالی برای سیستم بیانی اشرشیا کلی باشد. در این پژوهش، آنتی بادی زنجیره سنگین شتری علیه زیر واحد urec آنزیم اوره آز هلیکوباکترپیلوری در پیکیا پاستوریس بیان و سپس تخلیص گردید. ژن vhh دروکتور ppink-hc کلون و در ابتدا به باکتری اشرشیا کلی، سویه top10 منتقل شد. سپس وکتور حاوی ژن vhh به منظور ورود به ژنوم مخمرخطی شد و به سلول های مستعد مخمری منتقل گردید. تعدادی از کلونی های ترانسفورم شده انتخاب و در محیط کشت بیانی مخمر (bmgy,bmmy) کشت داده شد وvhh نوترکیب درپیکیا پاستوریس بیان شد. بیان پروتئین به وسیله sds-page آنالیز گردید و مشاهده شد که میزان بیان پروتئین در مخمر پیکیا پاستوریس نسبت به باکتری اشرشیا کلی بالاتر است. در نهایت کارایی نانوبادی بیان شده در شرایط invitro مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین مقایسه ای بین کارایی نانوبادی بیان شده در باکتری و مخمر صورت گرفت و مشخص شد که نانوبادی بیان شده در مخمر در جهت مهار آنزیم اوره آز کارایی بهتری دارد.

دست ورزی آنتی بادی های مهم از نظر کلینیکی، می تواند در بهبود تشخیص و درمان موثر باشد. فرایند بلوغ افینیتی توانایی قابل توجهی در بهبود کارایی آنتی بادی ها دارد. یکی از راه های پیشنهادی استفاده از روش جهش زای pcr مستعد خطا برای افزایش افینیتی آنتی بادی ها می باشد. در تحقیق پیش رو این روش، روی آنتی بادی زنجیره سنگین شتری (vhh، نانوبادی) ایجاد شده علیه زیرواحد urec آنزیم اوره آز h.pylori اعمال شد. اوره آز مهم ترین عامل بیماری زایی h.pylori است و جایگاه فعال آنزیم در زیرواحد بزرگ آن (urec) قرار دارد. این vhh به عنوان مولکول پایه برای ساخت یک کتابخانه ی نمایش فاژی بزرگ و متنوع از vhhهای تصادفی مورد استفاده قرار گرفت. کتابخانه ی فاژی حاوی نانوبادی های جهش یافته، در معرض چندین مرحله غربالگری علیه آنتی ژن urec در فاژ الایزا قرار گرفت و یک vhh جهش یافته با افینیتی بالاتر از نوع اولیه جدا شد. این vhh به میزان 5/1 برابر نسبت به vhh اولیه فعالیت اتصالی بیشتری به آنتی ژن هدف نشان داد. به علاوه، این vhh جهش یافته، عملکرد بهتری در مهار فعالیت اوره آزی به خصوص در غلظت های کم آنتی بادی داشته است، در حالی که اختصاصیت و پایداری دمایی خود را حفظ می کند.

ca ix (کربونیک انهیدراز9) عضوی از خانواده کربونیک انهیدرازهاست که به عنوان مارکر تشخیصی در تومورهای هیپوکسیک شناخته شده است. این آنزیم علاوه بر تنظیم ph –که مشخصه اصلی تمام کربونیک انهیدرازها می باشد- و شرکت در فرآیندهای تومورزایی، در چسبندگی سلول نیز نقش بازی می کند. تاکنون تلاش های زیادی در جهت تشخیص و/یا درمان بر اساس شناسایی و/یا ممانعت از عمل این آنزیم انجام گرفته است. در این پژوهش با استفاده از تخلیص لنفوسیت های شتر تک کوهانه ایمن شده علیه جایگاه فعال ca ix، کتابخانه فاژمیدی حاوی ژن های vhh ساخته شد. پس از آن بالاترین vhh متصل به فاژ با بیشترین تمایل با استفاده از روش غنی سازی جدا و درون وکتوری بیانی زیرهمسانه سازی گردید. vhh حاصل تخلیص و در تست الایزا با ca ix نوترکیب و سلول های هلا استفاده شد. vhh به دست آمده مولکول های ca ix را بر روی سلول های هلا شناسایی کرد و بر روی سلول های pc3 به عنوان کنترل ایمنی نداشت.

آنژیوژنز فرایندی است که در طی آن رگ های خونی جدید در بدن تشکیل می شود. تشکیل رگ های جدید در یک تومور سرطانی باعث می شود مواد غذایی و اکسیژن بیشتری به سلول های تومور رسیده و تومور از حالت توده ی سلول های جهش یافته و بی ضرر تبدیل به یک تومور بدخیم شود. این تومور می تواند به بافت های دیگر حمله نموده و منجر به متاستاز شود. یکی از مهم ترین عوامل آنژیوژنز در بدن فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf) می باشد. مهار عملکرد vegf باعث توقف آنژیوژنز و متاستاز تومورها می گردد. آنتی بادی های زنجیره سنگین شتری نوع خاصی از آنتی بادی بوده که در شترهای خانواده camelidae یافت می شوند. ناحیه اتصال به آنتی ژن این آنتی بادی ها تحت عنوان vhh یا نانوبادی، دارای خصوصیات منحصر به فردی از جمله پایداری بالا در برابر گرما، مواد کائوتروپیک و ph بوده و به دلیل داشتن اندازه کوچک قابلیت نفوذ موثرتری به بافت ها را دارند. این خصوصیت باعث می شود بتوانند اپی توپ های پنهان یا غیر عادی را شناسایی کنند. تکنیک نمایش فاژی تکنیک پرقدرتی برای مهندسی نمودن پپتیدها و پروتئین ها می باشد. این تکنیک قابلیت نمایش کتابخانه هایی با میلیون ها و حتی میلیاردها پپتید یا پروتئین مختلف را دارد. هدف از پروژه حاضر تولید نانوبادی های مشتق از آنتی بادی زنجیره سنگین شتری بر علیه فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf-a) با استفاده از تکنیک نمایش فاژی می باشد. برای این کار ناحیه اتصال به رسپتور vegf-a سنتز شده در وکتور pet28a کلون گردید. پس ازبیان آن، پروتئین حاصل به عنوان ایمونوژن در پنج نوبت به شتر تزریق شد. پس از ایمن شدن شترها و کنترل ایمنی با آزمایش الایزا، لنفوسیت ها از خون محیطی استخراج شده و تخلیص rna آن انجام شد. در مرحله بعد با استفاده از rt-pcr، cdna ساخته شد. طی دو مرحله pcr (nested pcr) قطعات کد کننده vhh سنتز شدند. در pcr اولیه باندهای 600، 700 و 900 جفت بازی و در pcr ثانویه دو باند 400 و 500 جفت بازی در ژل مشاهده شد. قطعه 400 جفت بازی حاصل ازpcr دوم (vhh) در وکتور فاژمیدی pcomb3x کلون گردید. قطعه و وکتور هر دو با آنزیم sfii برش داده شده بودند. این عمل برای ساخت کتابخانه فاژی انجام می شود.

باکتری اشریشیاکولی انتروتوکسیژنیک، یکی از عوامل شایع اسهال در بین کودکان است. فاکتورهای کلونیزاسیون و توکسین حساس به حرارت، مهمترین کاندیدای واکسن علیه etec می باشند. پروتئین های کایمریک دربردارنده اپی توپ ها و یا ادجوانها سبب افزایش احتمال بروز پاسخ ایمنی هومورال و یا سلولی می شود. فرض ما بر این بود که پروتئین کایمر دربردارنده فاکتورهای کلونیزاسیون شایع و زیر واحد ltb به عنوان کاندید واکسن خوراکی می تواند سبب محافظت در برابر اتصال باکتری و عملکرد توکسین گردد. به منظور دستیابی به رایجترین فاکتورهای کلونیزاسیون از سویه های ایرانی، فنوتیپ و ژنوتیپ سویه های etec جدا شده از کودکان ایرانی مشخص شد. بر اساس پروفایل سویه هایetec ، ژن کایمر کدکنندهcfab ، csth، cota وltb طراحی گردید. مدلسازی به منظور پیش بینی ساختار سوم پروتئین کایمر انجام گرفت. ژن l2c3 بهینه سازی کدونی شد و در وکتور بیانی e.coli، همسانه سازی گردید. پروتئین نوترکیب با روش امولسیون دو گانه در پلیمر plga انکپسوله و خصوصیات فیزکیوشیمایی نانوذره ها ارزیابی شد. ایمنوژنیسیتی خوراکی پروتئین کپسوله شده بررسی گردید. شیوع باکتری etec 11/7 درصد بود. بیشتر سویه های جدا شده دارای توکسین lt و st بودند. فاکتورهای کلونیزاسیون cfa/i، cs2، cs3 و cs5 در برخی از سویه ها شناسایی گردید. 2/97 درصد از اسیدهای آمینه پروتئین کایمریک مورد نظر در محدوده مجاز نمودار راماچاندران قرار داشتند. نانوذرات غیر تجمعی و دارای شکل نسبتاً کروی با میانگین اندازه 9/256 بودند. کارائی انکپسوله کردن پروتئین کایمر 4/1±96/81 درصد بود. وزن مولکولی و خاصیت آنتی ژنیسیتی پروتئین رها شده از نانوذرات تغییری نکرد. ایمنی سازی موشها از راه خوراکی سبب القای پاسخ آنتی بادی igg سرمی و iga مدفوعی شد. ایمن سازی سبب ایجاد محافظت در برابر اتصال باکتری etec به سلولهای caco-2 گردید. اثر توکسین بر میزان camp و تجمع مایع در لوپهای روده به واسطه ممانعت از اتصال سم به گیرنده gm1 مهار شد. این یافته ها نشان می دهد انتقال پروتئین l2c3 در نانوذرات plga سبب بروز پاسخ ایمنی عمومی و مخاطی شده و می تواند به منظور توسعه ی ترکیب چندگانه برای مقابله با etec مورد استفاده قرار گیرد.

سرطان پروستات یکی از رایج ترین بدخیمی های مردان و آنتی ژن غشایی اختصاصی سلول های سرطانی پروستات(psma) که بیانش در این سرطان افزایش میابد، یک مارکر مولکولی بسیار اختصاصی برای تشخیص و درمان سرطان پروستات است. به سبب ویژگی های منحصر به فرد آپتامر ها، در چند دهه ی اخیر استفاده از آپتامر ها در مطالعات سرطانی افزایش یافته است. آپتامر ها مولکول های rna یاdna تک رشته ای هستند که طی فرایند تکاملی ایجاد میشوند و با پیشرفت فرایند، کتابخانه از توالی هایی با ساختار خاص و قابلیت اتصال به هدف مورد نظر غنی میشود. آپتامر ها برای اهداف متنوعی از مولکول های بسیار ساده تا سیستم های پیچیده ای چون سلول های زنده ایجاد شده اند. در این مطالعه ما برای نخستین بار توانستیم با استفاده از روش cell-selex (تکامل سیستماتیک لیگاند ها با استفاده از غنی سازی نمایی) تعدادی آپتامر اختصاصی علیه مولکول هدف (psma) بدست آوردیم. بدین منظور توالی های تک رشته شده با استفاده از آنزیم لامبدااگزونوکلئاز با سلول های هدف(lncap) انکوبه شدند. توالی های متصل نشده شسته و توالی های متصل شده با استفاده از یک خراشنده سلولی به صورت کمپلکس با سلول جدا شدند. حرارت کمپلکس آپتامر- سلول سبب جدا شدن آپتامر از سلول ها میشود. پس از سانتریفیوژ، توالی های متصل شده تعیین غلظت شده و selex معکوس روی رده ی سلولی pc-3 به منظور حذف توالی های متصل شونده به هر دو رده ی سلولی انجام شد. این کار سبب غنی تر شدن توالی های متصل شونده به psma می گردد. فرایند selexتا 10 مرتبه تکرار شد با این تفاوت که هر بار شرایط انتخاب سخت تر می شد. توالی های حاصل از selex دهم کلون شدند. مطالعات فلوسایتومتری روی 8 کلون حاصل از selex دهم نشان داد،که شدت فلوئورسنت سلول های هدف انکوبه شده با 5 آپتامر بیش از 70% بوده که از بین شدت فلوئورسنت سلول های lncap انکوبه شده با آپتامرb1 نزدیک به 80% بود. کلون های ذکر شده تعیین توالی شدند. ما براین باوریم که این نشانگرها می توانند برای تشخیص زود هنگام بیماری و ارسال هدفمند دارو مورد استفاده قرار بگیرند.

باکتری e.coli o157:h7سروتیپ شایعی ازاشرشیاکلی انتروهموراژیک (ehec) ویک پاتوژن مشترک بین انسان ودام است که منجربه طیف وسیعی ازبیماریها درانسان از اسهال آبکی یا خونی تاعوارض سیستمیک تهدیدکننده زندگی شامل سندرم اورمی همولیتیک(hus) بامشخصه های کم خونی همولیتیک،ترومبوسیتوپنی ونارسایی کلیه میشود.بیشترین شیوع e.coli o157:h7بواسطه ی غذا یا آب آلوده رخ می دهد .گاوها بعنوان مخزن اولیه ومهمe.coli o157:h7تشخیص داده شده وبعنوان منبع عفونت ehecدر نظر گرفته می شوند.اشرشیاکلی انتروهموراژیک(ehec)میتواند ضایعات a/e رابر روی سلولهای پستانداران تشکیل دهد.espa،intimin و tirفاکتورهای پروتئینی بیماریزا وکلیدی هستند که منجربه ایجاداین ضایعات میشوند .espaیک ساختار رشته ای را ایجاد میکند که پلی را برای انتقال گیرنده منتقل شونده اینتیمین(tir)به درون سلول میزبان تشکیل می دهد. اینتیمین بعنوان فاکتور چسبنده اولیه از ehecتعریف می شود وبرای القای ضایعات a/eضروری است.در کار قبلی پروتئین کایمریکeitشاملespa(e)،iintimin(i)وtir(t)ساخته شد وویژگیهای ایمنی زایی آن مورد مطالعه قرار گرفت .در کاراخیر،ما پروتئین نوترکیب eitرابه منظور طراحی یک نانوواکسن حفاظت کننده تجویز شونده از مسیر بینی علیه ehecبه کار بردیم.کیتوسان ومشتق محلول در آب آن(tmc) بعنوان پلیمر های زیستی چسبنده به مخاط،باویژگی های جالبی مانندتوانایی باز کردن اتصالات محکم بین سلولهای اپیتلیالی،کاندیدهای مناسبی برای فراهم کردن نانوواکسن ها هستند .ماازتکنیک الکتروسپرینگ بعنوان یک روش جدیدبرای ساختن ذرات پروتئین نوترکیب eitهمراه شده با کیتوسان وtmcدر ابعادنانومتری استفاده کردیم.موش ها بوسیله تجویز پروتئین نوترکیب eitاز مسیربینی(در دوگروه تست1وتست2) یا به صورت تزریق داخل صفاقی (در گروه کنترل3)ایمن شدند.پاسخ های ایمنی اختصاصی پروتئین نوترکیب eit(iggوiga) بوسیله الایزای غیر مستقیم اندازه گیری شدند .تنها تجویز از مسیربینی فرمولاسیون های کیتوسان ونیزtmcالکترواسپری شده در دو گروه تست،تیترهای موثروقابل مشاهده یigaترشحی (s-iga)راایجاد کرد.تجویز از مسیر بینی نانوواکسن توانست ریزش مدفوعی باکتری را در موشهای به چالش کشیده با e.coli o157:h7 کاهش دهد.ازآنجاکه توسعه ی واکسن های مخاطی به منظور پیشگیری از بیماریهای عفونی،نیازمند تحویل موثرآنتی ژن است،این پژوهش میتواند استراتژی جدیدی برای توسعه ی واکسن علیهe.coli o157:h7 باشد .

اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک (etec) از علل اصلی اسهال در کشورهای در حال توسعه و نیز کودکان می باشد. از مهمترین فاکتورهای حدت etec می توان انتروتوکسین و فاکتورهای چسبندگی (cfa) را نام برد. cfa/i اولین و رایج ترین فاکتور چسبندگی است. این فیمبریه دارای هزاران کپی از زیر واحد cfab و یک یا چند کپی از زیر واحد فرعی چسبنده cfae می باشد که در اتصال ارگانیسم به سلول های روده نقشی اساسی دارند. خاصیت ایمنی زایی زیرواحد b انتروتوکسین حساس به حرارت(lt) در مطالعات زیادی به اثبات رسیده است. فاکتورهای کلونیزاسیون و توکسین حساس به حرارت، مهمترین کاندیدای واکسن علیه etec می باشند. بنابراین در این مطالعه پروتئین نوترکیب متشکل از cfae، cfab و blt به عنوان کاندیدای واکسن طراحی شد. توالی ژن های این 3 پروتئین از بانکncbi استخراج و به وسیله لینکر، یک توالی کایمر تریمر ایجاد شد. توالی کد کننده با استفاده از ترجیح کدونی در e.coli طراحی شد سپس روی ناقل بیانی pet28a+ کلون شد. پس از انتقال سازه نوترکیب به میزبان اشرشیاکلی سویه bl21de3، بیان پروتئین و بهینه سازی آن انجام شد. نتایج بیان با sds-page بررسی و پروتئین نوترکیب از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبی با کمک ستون ni-nta تخلیص شد. مطالعه ایمنی زایی پروتئین کایمر تخلیص شده در موش سوری نژاد balb/c انجام شد. برای تعیین تولید آنتی بادی igg تست الایزا با سرم موش انجام شد که نتایج نشان دهنده تولید تیتر بالای آنتی بادی بود. پیش انکوبه کردن سلولهای روده ای ht29 با سرم موش های ایمن شده، اتصال باکتری را به این سلول ها تا حد قابل توجهی کاهش داد. با توجه به نتایج به دست آمده، پروتئین کایمر نوترکیب می‏تواند به عنوان یک پروتئین ایمونوژن از اجزای مهم واکسن بر علیه etec باشد.

دو جنس شیگلا و اشریشیا (etec و ehec) اعضای مهم خانواده انتروباکتریاسه ها و عامل اصلی اسهال های عفونی می باشند. شیگلا از طریق تهاجم به سلول های اپی تلیال روده باعث ایجاد اسهال خونی (شیگلوزیس) می شود. یکی از کلیدی ترین پروتئین هایی که در تهاجم باکتری نقش دارد پروتئین ipac است. عامل بیماریزائی اصلی در etec ، گروه آنتی ژنی cfa/i است که از دو زیر واحد cfab و cfae تشکیل شده است. در باکتری ehec، اولین مرحله برای عفونت زایی، اتصال پروتئینی به نام intimin به لایه اپی تلیال می باشد که توسط ژن eae کد می شود. بنابراین با طراحی ایمونوژنی شامل سه پروتئین ipac، cfab و intimin شاید بتوان از اتصال سه باکتری مذکور ومتعاقبا ایجاد اسهال جلوگیری کرد. از آنجایی که این باکتری ها در مخاط روده کلونیزه می شوند، ایمن سازی مخاطی نقش مهمتری را ایفا می کند. نانوژل ها به عنوان یکی از بستر های مناسب برای انکپسوله کردن مولکول های زیستی مطرح می باشند و پلیمر کیتوسان از مناسب ترین پلیمر ها برای ساخت این حامل های مولکول های زیستی است. بسته بندی داروها در حامل های خاص شامل نانوژل ها علاوه بر حفاظت آنها در برابر عوامل محیطی و افزایش فعالیت زیستی آنها در فراهم کردن غلظت های مناسب از دارو در محیط نیز موثر می باشند. در این تحقیق ابتدا پروتئین های cfab، intimin و ipac به صورت سه پروتئین مجزا و یک پروتئین کایمر c? که دربردارنده نواحی حفاظت کننده این سه پروتئین می باشد، بیان و تخلیص شدند. در ادامه نانوژل کیتوسان با نسبت 4:1 از کیتوسان: tpp تهیه و پروتئین ها در درون آنها بارگذاری شدند. خصوصیات ساختاری نانوژل ها با روش های sem و dls بررسی گردید. گروه های موشی و خوکچه هندی با پروتئین های cfab، intimin، ipac و c? به صورت تزریقی و نیز به فرم کپسوله به صورت خوراکی ایمن شدند. پس از بررسی تولید آنتی بادی، سلولهای caco2، موشها و خوکچه های هندی به ترتیب با باکتری های etec، ehec و shigella flexneri به چالش کشیده شدند. حفاظت کنندگی ایمن سازی از مسیر خوراکی در حیوانات آزمایشگاهی بیشتر از مسیر تزریقی بود. کلید واژه: کیتوسان، نانوژل، etec ، ehec، shigella ، cfab ، intimin و ipac

سم بوتولینوم (bont) که توسط باکتری کلستریدیوم بوتولینوم تولید می شود، به لحاظ ایمنی شناسی 7 سروتیپ مختلف (a-g) دارد و در بین این ها تیپ های a، b و e بوتولیسم انسانی ایجاد می کند. بیماری بوتولیسمی که از طریق bont/e ایجاد می شود، به واسطه سرعت جابجایی و چیدمان خود سریع تر از سایر سروتیپ ها عمل می کند. روند تکاملی ایمنی زایی نواحی مختلف bont ثابت می کند که دومین c-ترمینال یا گیرنده hc از bont در حیوانات ایمنی را برمی انگیزد. خانواده شترها و گروهی از کوسه ها که از دسته ماهیان غضروفی هستند آنتی بادی ویژه ای که فقط دارای زنجیره سنگین می باشد را تولید می کند که مزایای زیادی را ایجاد می نماید و از طریق اتصال بین دو یا تعداد بیشتری از قطعات ویژه ای از آن که نانوبادی هم نامیده می شود می توان به افزایش ظرفیت اتصال به آنتی ژن کمک کرد. این هدف از طریق استراتژی های مختلفی امکان پذیر است که می توان به برقراری اتصالات شیمیایی و از جمله باند دی سولفید اشاره کرد. در این تحقیق سه مرحله pcr طراحی شدتا از طریق اتصال قطعه ای که از بخش لولای طبیعی این آنتی بادیها استخراج شده به آن امکان اتصال دو قطعه از طریق باند دی سولفید در فضای پری پلاسمی به وجود اید

عفونت با هلیکوباکتر پیلوری، عامل اصلی ایجاد سه بیماری مهم دستگاه گوارش فوقانی می باشد اوره آز مهمترین عامل بیماری زایی هلیکوباکتر پیلوری است. مشکلات ناشی از استفاده آنتی بیوتیک ها و واکسن ها جهت درمان هلیکوباکترپیلوری، مطالعات را به سمت استفاده از آنتی بادی سوق داده است. نانوبادی ها به دلیل اندازه کوچک شان، برای ساخت ملکول های بزرگ تر مانند دیابادی ها بسیار مناسب هستند. بنابراین ازطریق اتصال دو نانوبادی به یکدیگر و ساخت دیابادی می توان نواقصی نظیر اثر درمانی ضعیف نانوبادی ها به دلیل سایز کم و به دنبال آن پاکسازی سریع از طریق خون را کاهش داد. هدف این پژوهش تهیه دیابادی علیه زیرواحد urec آنزیم اوره آز هلیکوباکتر پیلوری، از نانوبادی های مشتق شده از زنجیره سنگین شتری می باشد. دو نانوبادی مونومر باید از طریق برقراری پیوند دی سولفید در فضای پری پلاسمی باکتری به یکدیگر متصل شوند. برای این منظور پروب hinge که حاوی کدون اسید آمینه های سیستئین می باشد، به انتهای 3 ژن متصل گردید. سپس جایگاه های برش آنزیمی مناسب وارد شدند و به فریم مناسب جهت کلون در وکتور ترشحی pet22b تبدیل شدند. قطعات ایجاد شده به وکتور ترشحی pet22b الحاق شدند. وکتور های نوترکیب به باکتری e.coli bl21de3 منتقل شدند. با بیان کلون ها، دو نانوبادی به فضای پری پلاسمی باکتری ترشح شدند و پروتئین دیابادی از طریق برقراری پیوند دی سولفید تشکیل شد.