عنوان : مقایسه رشد، تمایز و پیری سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیون و مغز استخوان موش مقدمه: با وجود اینکه سلول های بنیادی مزانشیمی از منابع مختلف بافتی جدا سازی شده، تفاوت بین سلول های منابع مختلف به خوبی مشخص نیست. این موضوع در تحقیق حاضر ( مقایسه سلول های حاصل از مغز استخوان و مایع آمنیون موش سوری) مورد توجه قرار گرفته است. روشها: مایع آمنیون و مغز استخوان از موش nmri در هفته دوم بارداری جداسازی و با انجام چندین پاساژ متوالی تکثیر گردید. برای بررسی ماهیت بنیادی مزانشیمی، سلول های پاساژ سوم از لحاظ توان تمایز و مارکر های سطحی (فلوسایتومتری) بررسی شدند. سپس سلول های حاصل از دو منبع از لحاظ توان تکثیر با روش محاسبه زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی و سنجش کلون زایی و پدیده پیری با روش رنگ آمیزی بتا گالاکتوزیداز و فعالیت تلومراز مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج: سلول های حاصل از دو منبع در پاساژ سوم اغلب مورفولوژی فیبروبلاستی داشتند. این سلول ها توانستند به سه رده استخوانِ، غضروفی و چربی تمایز یابند و برخی مارکر های مزانشیمی در آنها بیان شد. بر اساس یافته ها، زمان دوبرابر شدن جمعیت سلولهای مایع آمنیون نسبت به مغز استخوان کمتر بود(p<0.05). همچنین اندازه کلونی ها در سلولهای مایع آمنیون بزرگتر بود (p<0.05). رنگ آمیزی بتا گالاکتوزیداز حاکی از این بود که در کشت سلول های مغز استخوان تعداد سلول بتا گالاکتوزیداز مثبت بیش از کشت سلول های حاصل از مایع آمنیون است(p<0.05). فعالیت آنزیم تلومراز با وجودیکه در کشت سلول های مایع آمنیون بیشتر بود ولی تفاوت آن با کشت مغز استخوان معنی دار نبود. نتیجه گیری: روی هم رفته می توان گفت که سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مایع آمنیون موش تکثیر بیشتری نسبت به سلول های مغز استخوان دارد و تعداد سلول های پیر درکشت آن کمتر از کشت مغز استخوان است. به نظر می رسد مایع آمنیون منبع مناسبی برای اخذ سلول بنیادی مزانشیمی است.

مقدمه: سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان (bm-msc) ظرفیت نوزایی و تمایز به دودمان های سلولی متعددی از بافت های مزانشیمی را دارند. این سلولها علاوه بر مغز استخوان از بافت هایی چون خون بند ناف، استخوان ترابکولار ، جفت، پانکراس، بافت چربی ، نیز جدا شده اند. تاکنون مطالعات محدودی در زمینه جداسازی این سلولها از بافت چربی سفید انجام شده است، ولی این مطالعات، بیشتر توصیفی بودند. لذا سلولهای بنیادی مزانشیمی بدست آمده از بافتهای مختلف مغز استخوان، چربی سفید و قهوه از لحاظ تکثیر و تمایز و پیری در محیط کشت مورد بررسی قرار گرفتند. روشها: سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت چربی سفید و قهوه ای و مغزاستخوان جدا شده و به رده های سلولی استخوان، غضروف و چربی تمایز داده شدند. سلولهای جدا شده از هرسه منبع در ویژگیهای رشد، تمایز و پیری با محاسبه جذب نوری رنگ،mtt ، تعداد و قطر کلونی، زمان دوبرابر شدن جمعیت، آلیزارین رد در تمایز به استخوان و محاسبه سلولهایی که برای تست بتاگالاکتوزیداز مثبت هستند و نیز اندازه گیری فعالیت آنزیم تلومراز مقایسه شدند. نتایج: در این مطالعه سلولهای بنیادی مزانشیمی موش صحرایی(رت) از بافتهای چربی سفید، قهوه ای و مغزاستخوان به طور موفق آمیزی جدا سازی و کشت شدند. سلولهای جدا شده از هر سه منبع توانایی تمایز به هر سه رده استخوان، غضروف و چربی در شرایط اختصاصی کشت را داشتند. براساس نتایجmtt ، جذب رنگ فورمازان در سلولهای چربی سفید، قهوه ای و مغزاستخوان اختلاف معنی داری نشان نداد. تعداد و قطر کلونی های ایجاد شده در محیط کشت در سلول های جداشده از بافت چربی بخصوص چربی قهوه ای بالاتر از مغزاستخوان می باشد و نیز میانگین تعداد و قطر کلنی ها در مغز استخوان، چربی سفید و چربی قهوه ای به ترتیب (20/09±6/9،70/9±1537/4) و (5/2±34/62،78/37±2570) و (7±36/9،21/93±982) می باشد. در تحقیق حاضر زمان دوبرابر شدگی جمعیت در بافت چربی به خصوص بافت چربی قهوه ای نسبت به همتای مغزاستخوان خود کمتر است(9/6±45 در مقابل 24±177/33). در بین این سه منبع، با استفاده از جذب رنگ آلیزارین رد مشخص شد که سلول های مغز استخوان از توان تمایزی بالاتری نسبت به دو گروه چربی برخوردار بودند که خود بیانگر کاربرد این سلول ها در ترمیم شکستگی های استخوانی است(p<0/05). همچنین با توجه به پیری سلولی، تعداد سلولهای چربی سفید وقهوه ای به ترتیب در پاساژهای3، 5 و7 که برای تست بتاگالاکتوزیداز مثبت بودند، نسبت به همتای مغزاستخوان خود کمتر بوده و این تفاوت در سطح 95 درصد معنی دار است. علاوه براین، بررسی آنزیم تلومراز در هر سه گروه در پاساژهای 3، 5، 7 نشان داد که سطح فعالیت آنزیم تلومراز در گروه چربی بخصوص چربی سفید نسبت به عمتای مغزاستخوان خود بیشتر است(p<0/05). بحث: روی هم رفته، باتوجه به اینکه بافت چربی یک منبع غنی از سلول های بنیادی مزانشیمی مطرح است و نیز ویژگیهای رشد و تکثیر و زنده مانی آنها در محیط کشت بهتر از مغزاستخوان است، می تواند به عنوان منبع مناسبی برای سلول های بنیادی مزانشیمی در درمان بیماریها و طب ترمیمی مورد اسفاده قرار گیرد.

چکیده سلولهای بنیادی مزانشیمی سلولهای پر توانی هستند که پتانسیل تمایزی به سه رده چربی،استخوان و غضروف را دارا هستند.یکی از کاربردهای مهم این سلولها،استفاده ازآنها در بازسازی ضایعات بافت غضروفی است. پیش از اینکه این سلولها کاربردی شوند لازم است که دو نکته در مورد آنها توجه شود، اولین نکته تمایز بهینه آنها در شرایط کشت است ونکته دوم روشن شدن مکانسیم های مولکولی تمایز به غضروف می باشد.در مطالعه حاضر با به کار گیری دو ماده مهار کننده آنزیم گلیکوژن سنتاز کیناز 3 بتا به دو موضوع مذکور پرداخته شده است. برای این منظور سلول بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان افراد داوطلب سلول درمانی برای ضایعات غضروفی تهیه شد وبا انجام سه پاساژ متوالی تکثیر گردید.ماهیت بنیادی مزانشیمی سلولها با انجام فلو سایتومتری و تست تمایز به سه رده اسکلتی مورد بررسی قرار گرفت .بهترین غلظت برای دو ماده بر اساس میزان زنده مانی سلولها تعیین شد. سپس کشت سلولها به صورت پلت ایجاد گردید و تاثیر کلرید لیتیم وsb216763 در تمایز کندروژنیک hmscs با روش رنگ آمیزی تولوئیدن بلو وreal rt-pcr بررسی گردید. با توجه به اینکه افزودن این دو ماده سبب تقویت تمایز به غضروف شد، در مرحله بعدی در گروه های تیمار شده با این مواد مسیر سیگنالدهی wnt ( ژن های بتا کاتنین، axin و sox9) با روش real time pcr مورد بررسی قرار گرفت. در انتها میزان تولید گلیکوز آمینو گلیکان (gag) در گروههای شاخص (از نظر میزان بیان ژن) مورد مقایسه قرار گرفت. در این مطالعه نتایج حاصل از گروه های مختلف، با روش های آماری مورد مقایسه قرار گرفت. بر اساس نتایج، hmscs در زمان کشت به شکل فیبروبلاستی ظاهر شدند. بر اساس فلو سایتومتری این سلولها، مارکرهای سلولهای خونی را به میزان ناچیز ومارکرهای سلولهای بنیادی مزانشیمی را به مقدار زیاد بیان کردند. سلولها توانستند به سه رده غضروف ،استخوان و چربی تمایز یابند. نتایج دوزیابی نشان داد که ،بهترین غلظت برای لیتیوم کلراید وsb216763 5میلی مولارو 13.4 میکرومولار/میلی لیتر است. در پایان دوره تمایزی، در گروه های تیمار شده با لیتیوم و sb ، بیان ژنهای اگریکان و کلاژن نوع 2 بطور معنی داری بیش از گروه کنترل بود. نتایج بررسی مسیر سیگنال دهی wnt نشان داد کهsox9 و بتا کاتنین در گروههای تیمارکلرید لیتیم و sb216763 نسبت به گروه های کنترل به میزان بیشتری بیان شده اند (p<0.05). میزان بیان اکسین در گروههای تیمار نسبت به کنترل کاهش یافته بود(0.01p<). بر اساس نتایج حاصل میزان تولیدgag در گروههای تیمار با مهار کننده ها نسبت به کنترل بطور معنی داری بیشتر بود. در مجموع نتایج ما نشان داد حضور لیتیوم کلراید وsb216763 در محیط کندروژنیک hmscs سبب تقویت تمایز به غضروف آنها می شود. این اثر تقویتی از طریق مسیر سیگنالدهی wnt اتفاق می افتد.

در سالهای اخیر پیشرفتهای بسیاری در زمینه طب ترمیمی رخ داده است. سلولهای بنیادی به دلیل دارا بودن همزمان دو ویژگی منحصر به فرد خود نوزایی و توان تمایز به رده های سلولی مختلف در سالهای اخیر مورد توجه بسیاری از محققین علوم پایه وبالینی قرار گرفته اند. گرچه مغز استخوان اولین و شناخته شده ترین منبع سلولهای بنیادی مزانشیمی می باشد? اما روش جمع آوری نمونه از مغز استخوان بسیار تهاجمی است. همچنین تعداد? توان تکثیرو تمایز این سلولها با افزایش سن کاهش می یابد. بنابراین دسترسی به منابع جایگزین سلولهای بنیادی مزانشیمی جهت مطالعات پایه ای و بالینی از اهمیت ویژه ای برخوردار است. خون بند ناف یک منبع بسیار جوان از سلول های بنیادی مزانشیمی است که به دور از مشکلات اخلاقی? خطر ایجاد واکنش های ایمنی و همچنین سرطانی شدن? مزایای هر دو منبع سلولهای بنیادی جنینی و بزرگسال را دارا می باشد. بر اساس مطالعات پیشین بین افرایش طول تلومر? ناشی از عملکرد آنزیم تلومراز و توان تکثیر سلولی ارتباط مستقیم وجود دارد. از آنجا که تا کنون گزارشی در رابطه با الگوی میزان فعالیت آنزیم تلو مراز? به عنوان یک فاکتور مستعد کننده القا نامیرایی سلولی? در سلولهای بنیادی مزانشیمی خون بند ناف طی پاساژهای متعدد در دسترس نمی باشد? در این مطالعه میزان فعالیت آنزیم تلومراز در خون بند ناف با استفاده از روش telomerase rapid amplification protocol (trap) اندازه گیری و با مغز استخوان مقایسه گردید. در این مطالعه سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از خون بند ناف و مغز استخوان بر اساس خصوصیت چسبندگی به سطح پلاستیک جداسازی گردیدند. به منظور شناسایی بیشتر سلولهای جدا سازی شده? مارکرهای سطحی اختصاصی این سلولها مورد بررسی قرار گرفتند. همچنین زمان دو برابر شدن سلولی (pdt) در طی پاساژهای مختلف ((p3- 9 در این سلولها اندازه گیری شد. توان تمایز به بافتهای استخوان غضروف و چربی تحت شرایط القایی مناسب مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمایش فلوسیتومتری نشان میدهد که سلولهای شبه فیبروبلاستی جدا شده از خون بند ناف در مقایسه با مغز استخوان به میزان بالاتری مارکرهای سطحی سلولهای بنیادی مزانشیمی شامل cd 105, cd 90, cd 73, cd 44 رابیان می کنند. بیان مارکرهای اختصاصی سلولهای رده خون ساز شامل cd 45, cd 33, cd 11b, cd 34 درهردو منبع بسیار پایین می باشد. بر اساس نتایج بافت شناسی? rt- pcr و آزمایشات بیوشیمیایی هر دو منبع تحت شرایط القایی مناسب از توان بالایی جهت تمایز به بافت استخوان و غضروف برخوردارند. در حالیکه بر خلاف سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان? بر اساس نتایج رنگ آمیزی oil red سلولهای بنیادی مزانشیمی خون بند ناف تحت شرایط لیپوژنیک از توان بسیار پایینی برای تمایز به بافت چربی برخوردارند. نتایج حاصل از اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم تلومراز با استفاده از روش trap در نمونه های حاصل از پاساژهای متعدد سلولهای بنیادی مزانشیمی خون بند ناف و مغز استخوان? نشان دهنده عدم فعالیت آنزیم تلومراز درهردو منبع سلولی می باشد. بر اساس نتایج حاصل از تحقیق حاضر میانگین زمان دو برابر شذن سلولی (pdt) برای سلولهای بنیادی مزانشیمی خون بند ناف در پاساژ 3 برابر با 0.52 ± 60.6 ساعت محاسبه گردید و در طی پاساژهای متعدد (p3- 9) اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در حالیکه pdt برای سلولهای مزانشیمی مغز استخوان در پاساژ سوم 0.86 ± 64.87 محاسبه گردید و به تدریج طی پاساژهای متعدد افزایش معنی داری را نشان می دهد ( p? 0.01). بر اساس نتایج آزمایشات بافت شناسی? بیوشیمیایی و همچنین آنالیز داده های real time pcr ? سلولهای بنیادی مزانشیمی خون بند ناف در مقایسه با مغز استخوان? پس از 21 روز کشت در شرایط القایی مناسب از توان بالاتری جهت تمایز به بافتهای استخوان و غضروف برخوردارند. به طو خلاصه بر اساس نتایج این تحقیق بر خلاف سلولهای بنیادی مزانشیمی که به تدریج پس از9 پاساژسلولی توان تکثیر خود را به میزان زیادی از دست می دهند? سلولهای بنیادی مزانشیمی خون بند ناف توان نو خود زایی خود را طی پاساژهای متعدد حفظ می کنند. آنجا که در سلول درمانی همواره با یستی تعداد زیادی از سلولهای فعال از نظر متابولیک در دسترس باشند? توان تکثیر بالا در طی پاساژهای متعدد به عنوان یک مزیت برای این منبع سلولی محسوب می شود. همچنین از آنجا که بر اساس نتایج مطالعات پیشین ارتباط مستقیمی بین میزان بیان آنزیم تلومراز و خطر سرطانی شدن سلولهای سوماتیک وجود دارد، سلولهای بنیادی مزانشیمی خون بند ناف (فاقد فعالیت تلومرازی) با توان تکثیر بالا می تواند به عنوان یک منبع سلولی مطلوب جهت کاربردهای درمانی مطرح باشند.

بدن انسان به طور خود به خود قادر به ترمیم ضایعات استخوانی کوچک است؛ لیکن معایب استخوانی بزرگ بدون مداخلات پزشکی قادر به ترمیم نیست. تلاشهای صورت گرفته در جهت رفع این نقائص، منجر به پایه گذاری علم نوین مهندسی بافت شده است. این علم با بهره گیری از سلول؛ عوامل القایی و داربست به ساخت سازه های استخوانی جهت ترمیم ضایعات می پردازد. سلولهای بنیادی مزانشیمی با خصوصیت خودنوزایی و تمایزی خود از یک طرف و کوچک مولکولها به عنوان ترکیبات شیمیایی کارآمد، ابزار مناسبی جهت القای تمایز به استخوان به شمارمی آیند. به علاوه؛ نکته ای که در ساخت یک سازه استخوانی حائز اهمیت است، پراکندگی هموژن سلولهای درون سازه و فراهم آوردن محیط فیزیکی مشابه بافت طبیعی استخوان است. سیستم کشت دینامیک با استفاده از بیوراکتور پرفیوژن علاوه بر ساخت یک سازه سلولی هموژن، با القای نیروهای مکانیکی مناسب، محیطی مشابه با کنام طبیعی سلولهای استخوان ایجادکرده و تمایز سلولهای درون سازه را تقویت کند. هدف از مطالعه حاضر، بررسی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان انسان به سلولهای استخوانی با استفاده از کوچک مولکولها در سیستم کشت استاتیک و دینامیک بود. در فاز نخست ، تلاش کردیم تا به ارزیابی غلظت مناسب و مدّت زمان اثر کوچک مولکول های سیرولیموس و پورمورفامین در افزایش روند تمایز به استخوان سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی مشتق از مغز استخوان ، در سیستم کشت استاتیک بپردازیم. بدین منظور، فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز(alp)، میزان مواد معدنی و بیان ژنهای استخوانی مورد بررسی قرار گرفت. در طی مطالعه in vivo ، سازه سلولی کلسیم فسفاتی به زیرپوست رت پیوند زده شد و هر روز با دوز مناسب از کوچک مولکول منتخب از مرحله نخست آزمایش ، تیمار گردید. نتایج با استفاده از real- time pcr و رنگ آمیزی بافتی مورد ارزیابی قرارگرفت. در فاز سوم ،سلولها با استفاده از بیوراکتور پرفیوژن درون داربست کلاژنی کشت داده شده و روند تمایز طی 21 روز در حضور کوچک مولکول منتخب بررسی شد. جهت ارزیابی نتایج از تکنیکهای فلوسایتومتری، رنگ آمیزی بافتی و real-time pcr استفاده گردید. نتایج نشان داد که سیرولیموس در غلظت های 1، 10و 100 نانومولار، طی مراحل میانی تمایز، فعالیت alp را مهار کرده و نهایتاً ترشح مواد معدنی توسط سلوها را در مراحل میانی و نهایی دوره تمایز در سیستم کشت استاتیک به تعویق می اندازد؛ برعکس پورمورفامین موجب افزایش فعالیت alp طی مراحل اولیه و میانی تمایز می شود و فاقد اثر کاهنده بر روند مینرالیزیشن است. افزایش بیان runx-2 و osteocalcin با حضور پورمورفامین (3 میکرومولار) در سیستم in vitro و افزایش بیان alp در in vivo، تایید کننده اثر مثبت این کوچک مولکول بر استخوان سازی است. نتایج فاز دوم نشان داد که سیستم دینامیک موجب افزایش تعداد سلول های استخوانی -oc+/alp-, oc+/stro-1 در حضور پورمورفامین در انتهای دوره تمایز می شود. نتایج حاکی از آن است که سیرولیموس اثر مهاری بر تمایز به استخوان سلولهای بنیادی مزانشیمی انسان ایفا می کند؛ در حالیکه پورمورفامین تمایز به استخوان را در این سلولها تقویت می نماید. به علاوه، شرایط فیزیکی محیط کشت بر پتانسیل القاکنندگی پورمورفامین در تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای استخوانی تاثیر می گذارد.

چکیده مقدمه: پستانداران از جمله موش و انسان دارای پتانسیل پایینی برای بازسازی اندام حرکتی در مقایسه با دوزیستان هستند. در فرایند بازسازی اندام ، مسیرهای سیگنال دهی بسیاری تاثیرگذار اند که یکی از اینها مسیر سیگنال دهی wnt وابسته به بتاکتنین است . هدف طرح حاضر ایجاد کشت ارگان از سر انگشت قطع شده جنین موش و القای بازسازی آن با فعال سازی مسیر سیگنال دهی wnt است. این مطالعه می تواند سر آغاز مطالعات بیشتر در این حوزه باشد.