سیستم nadp- تیوردوکسین متشکل از nadph، nadp- تیوردوکسن ردوکتاز (ntr) و تیوردوکسین h (trx h)است که با احیا باندهای دی‎سولفیدی پروتئین های هدف شرکت کننده در فرآیندهای مختلف سلولی، نقش مهمی را در سلول ایفا می کند. مولکول‎های trx زمانی که از طریق nadph به وسیله تیوردوکسین ردوکتاز به فرم احیا درمی آیند، به عنوان فاکتورهای رشد سلولی عمل کرده و از فرآیند مرگ سلولی برنامه‎ریزی شده، جلوگیری می کنند. با احیاء ریبونوکلئوتیدها به دی اکسی ریبونوکلئوتید ها، در سنتز dna دخالت دارند و با تاثیر بر فاکتورهای رو نویسی، در بیان ژن اثر می‎گذارند. با احیاء تیو ردوکسین پراکسیداز‎ ها منجر به شکسته شدن مولکول 2o2h به مولکولo 2h شده و در نتیجه به عنوان آنتی اکسیدان عمل می?کنند. سیستم h ntr/trx در گیاهان به دلیل وجود ایزوفرم های چندگانه از ntr وh trx در مقایسه با پروکاریوت‎ها و جانوران، پیچیده تر است. بدین ترتیب سوالی در رابطه با میزان اختصاصی بودن عمل هر یک از ایزوفرم های ntr در واکنش با ایزوفرم های trx h مطرح می‎گردد. با جستجو در پایگاه ژنومی برنج (oryza sativa)، نه ژن کدکننده برای trx h و چهار ژن کدکننده برای ntr شناسایی شد. هدف از این تحقیق، تولید فرم‎های نوترکیب خالص از ntrهای گیاه برنج است که ما را به بررسی روابط متقابل میان ایزوفرم‎های مختلف ntr و ایزوفرم‎های trx h از گیاه برنج و ارگانیسم‎های دیگر، قادر خواهد ساخت. ‎‎در این تحقیق به شرح جداسازی، همسانه سازی، بیان، خالص‎سازی و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی دو توالی کامل cdna کد کننده دو ntr برنج به نام های osntr1 و osntr2 پرداخته ‎شده‎ است. پلی پپتیدهای حاصل از این توالی کدکننده، شباهت بالایی را به ntrهای نوع سیتوزولی و میتوکندریایی گیاهی (a/b ntr) نشان می دهند که دارای دومین متصل به fad، nadp و جایگاه فعال در ساختار خود هستند. در تحقیق حاضر، توالی کدکننده osntr1 با استخراج rna از بافت ساقه هفت روزه وانجام rt-pcrجداسازی گشت و در پلاسمید blunt pjet1/2 همسانه سازی شد. از آنجا که بیان osntr2 در بافت‎های هفت روزه برنج تایید نگردید، توالی کدکننده osntr2 توسط شرکت genescript سنتز و در پلاسمید puc57 قرارگرفت. با توجه به این‎که، جایگاه های برشی ecor i و hind iii در دو طرف توالی کدکننده osntr1 و osntr2 تعبیه شده بود، پس از برش قطعات orf با این آنزیم های برشی ، این قطعات در ناقل بیانی pet28a همسانه سازی شدند. توالی ها پس از این که از طریق توالی یابی مورد تایید قرارگرفتند، به میزبان بیانی rosetta (de3) ( سویه ای از باکتری e.coli) منتقل شدند و به منظور تولید پروتئین های نوترکیب با iptg القا گشتند. بیان پروتئین های نوترکیب از طریق sds-page بررسی ‎شد و هریک از پروتئین های نوترکیب osntr1 و osntr2 هم در فاز محلول و هم غیر محلول مشاهده شدند که بخش عمده آن ها در فاز نامحلول قرار می گرفت. از این رو با بهینه سازی شرایط کشت از طریق کاهش دما و کاهش غلظت iptg به کار رفته در محیط کشت، حلالیت پروتئنین های نوترکیب افزایش یافت. در مرحله بعد پروتئین های his6-osntr1 و his6-osntr2 با کمک کروماتوگرافی جذبی بر روی ستون نیکل با موفقیت خالص سازی شدند. پروتئین های خالص شده زرد رنگ و دارای الگوی اسپکتروفوتومتری مشابه با دیگر فلاووپروتئین ها بودند. بدین ترتیب، تولید فرم های نوترکیب خالص در مقیاس بزرگ ازهر دو ایزوفرم osntr1 و osntr2 امکان مقایسه فعالیت کینتیکی این پروتئین ها و همچنین مقایسه برهمکنش آن ها را با فرم های نوترکیب سه ایزوفرم ostrx h از گیاه برنج که به موازات این تحقیق تولید شده اند، در آینده فراهم خواهد ساخت.

تیوردوکسین ها ( trxs) پروتئین های کوچکی با وزن مولکولی kda 14-12 هستند که در تمام پروکاریوت ها و یوکاریوت ها یافت می شوند. این پروتئین ها با داشتن یک گروه تیول – دی سولفید در جایگاه فعالشان (wcg/ppc)، در احیاء برگشت پذیر پیوند های دی سولفیدی نقش دارند. ایزوفرم های مختلفی از trx در گیاهان وجود دارد. ایزوفرم های f، m، x و y در کلروپلاست، trx o در میتوکندری و نوع h در سیتوزول، یافت می شوند. trxh دارای اهمیت اساسی در رشد و نمو گیاه است. در سیتوزول، الکترون ها توسط تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به nadph (ntr)، از nadph به trxh منتقل می شوند. در ژنوم برنج، 30 جایگاه ژنی با 54 مدل ژنی برای trx وجود دارد. از این میان، 9 ژن، کد کننده ی trxh می باشد. علی رغم تحقیقات زیادی که بر روی سیستم ntr/trxh در گیاهان صورت گرفته است، وظیفه و عملکرد هر ایزوفرم به طور اختصاصی مشخص نمی باشد. در تحقیق حاضر، توالی ژن کد کننده ی ایزوفرم ostrxh23، با استفاده از روش rt-pcr، از اندام هوایی گیاهچه های 7 روزه ی برنج oryza sativa رقم l2 ( 7 روز پس از جوانه زنی بذر)، جداسازی و سپس در پلاسمید خطی pjet، همسانه سازی شد. جهت تولید پروتئین نوترکیب، این ژن در پلاسمید بیانی pet-15b، که دارای پروموتر t7 و ناحیه ی کد کننده ی his-tag بود، همسانه سازی شد. پلاسمید بیانی نوترکیب حاصل، به سویه ی مناسبی از باکتری escherichia coli به نام rosetta (de3) منتقل شد. با تحریک پروموتر t7 به وسیله ی iptg، میزان مناسبی از پروتئین نوترکیب his6-ostrxh23 تولید گردید. از طرفی، ژن های کد کننده ی ایزوفرم های ostrxh1 و ostrxh20، که قبلا" در پلاسمید puc57، همسانه سازی شده بودند نیز در پلاسمید بیانی pet-15b مورد همسانه سازی قرار گرفته و پس از انتقال به سویه ی rosetta (de3)، شکل نوترکیب پروتئین های his6-ostrxh1 و his6-ostrxh20 نیز تولید گردید. با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی، سه پروتئین الحاقی حاصله خالص سازی شدند و خصوصیات شیمیایی و کینتیکی آن ها مقایسه شد. جهت بررسی فعالیت کینتیکی پروتئین های نوترکیب تولید شده، از انسولین به عنوان سوبسترای عمومی trx و همچنین dtt به عنوان عامل احیا کننده استفاده شد. سپس با استفاده از برنامه ی excel، نمودار جذب نور در a650بر حسب زمان رسم و شیب خط محاسبه شد. نتایج نشان داد، هر سه ایزوفرم نوترکیب تولید شده، فعال بودند، به طوریکه در مقایسه با نمونه ی شاهد، جذب نور در a650، افزایش پیدا کرد. در بین سه ایزوفرم مورد مطالعه، ostrxh23 با a650/min معادل 0588/0 دارای بیشترین فعالیت و ostrxh1 با a650/min معادل 022/0، دارای کمترین میزان فعالیت بود. با توجه به اینکه در انتهای آمین ostrxh20، دو اسید آمینه ی سیستئین و در انتهای آمین ostrxh1 و ostrxh23، یک سیستئین وجود داشت، وجود این سیستئین ها در محلی غیر از جایگاه فعال، احتمال اینکه، بعضی از مولکول های این سه ایزوفرم، با استفاده از پیوند های دی سولفیدی، به شکل دایمر و برخی دیگر به شکل مونومر باشند را تقویت کرد که الکتروفورز نمونه ها بر روی ژل sds-page در شرایط عدم حضور dtt این مطلب را تایید نمود. همچنین تجزیه و تحلیل درخت فیلوژنتیک ترسیم شده برای ایزوفرم های مختلف trxh در گیاهان مختلف نشان داد که ایزوفرم ostrxh23 در حالیکه با ایزوفرم های ostrxh1 و ostrxh20، دارای 37 درصد شباهت در توالی است، اما با ایزوفرم tatrxh3 از گیاه گندم و hvtrxh1 از گیاه جو دارای قرابت بسیار بیشتری، یعنی 73 تا 76 درصد، شباهت در توالی است. ostrxh1 دارای شباهتی در حدود 80 درصد با lctrxh، گیاهی از جنس چاودار وحشی بود. وجود تفاوت های مشاهده شده در توالی ها و همچنین آزمایش های صورت گرفته در محیط in vitro، می تواند نشان دهنده ی عملکرد های متفاوت این تیوردوکسین ها در سیستم گیاهی باشد. کلمات کلیدی: برنج، تیوردوکسین، همسانه سازی، بیان ژن، کروماتوگرافی جذبی، فعالیت کینتیکی، درخت فیلوژنتیک

آلودگی فلزات سنگین در اثر عوامل طبیعی یا فعالیت های صنعتی، پیامدهای مخرب چشمگیری را بر محیط زیست و سلامت موجودات زنده به همراه دارد. به همین دلیل، در سلول های موجودات زنده مکانیسم های مختلفی به منظور تعدیل غلظت فلزات وجود دارد. از جمله این مکانیسم ها می توان به کلاته شدن فلزات توسط پروتئین هایی با قابلیت بالا در اتصال به فلزات اشاره کرد. متالوتیونین ها (mt) خانواده ای از پروتئین های کوچک با وزن مولکولی کمتر از 10 کیلودالتون و غنی از آمینواسیدهای سیستئین هستند که ظرفیت بالایی برای اتصال به فلزات سنگین از طریق گروه های تیول سیستئین های خود دارند. در ژنوم گیاه برنج، 13 جایگاه ژنی کدکننده ی پروتیئن های mt شناسایی شده است که براساس الگوی توزیع سیستئین ها درتوالی آمینواسیدی، در دو کلاس i و ii طبقه بندی می شوند. بیشتر مطالعات بر روی mt ها در گیاهان به بررسی بیان این ژن ها در بافت های مختلف محدود شده است و تحقیقات اندکی تاکنون بر روی نقش هر ایزوفرم mt در سطح پروتئین صورت گرفته است. تحقیق حاضر با هدف مقایسه نقش دو ایزوفرم osmti-1b و osmtii-1a به ترتیب متعلق به کلاس i و ii ژن های mt برنج، در ایجاد تحمل به تنش فلزات سنگین و هم چنین تنش های اکسیداتیو انجام شد. توالی کد کننده ی این ایزوفرم ها سنتز و در ناقل بیانی pet41a همسانه سازی شد. پس از تائید صحت همسانه سازی با استفاده از توالی یابی، دستواره های تولید شده به میزبان بیانی e. coli سویه ی rosetta(de3) منتقل شدند. با القاء بیان پروتئین توسط iptg، میزان قابل توجهی از پروتئین های gst (نمونه ی شاهد)، gst-osmti-1b و gst-osmtii-1a تولید شد. تحمل سویه های بیان کننده ی پروتئین های نوترکیب به فلزات سنگین از طریق ترسیم منحنی رشد باکتری ها در حضور نمک های cuso4، znso4، cdcl2و nicl2 و هم چنین اندازه گیری میزان تجمع فلز در داخل سلول های باکتری و کاهش آن از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنجی نشر اتمی پلاسمای جفت شده القائی (icp-aes) بررسی شد. با خالص سازی پروتئین های نوترکیب، امکان بررسی تمایل و ظرفیت اتصال آن ها به فلزات مختلف در مقایسه با نمونه ی شاهد فراهم گردید. به این منظور از روش های مختلف شامل بررسی تغییر در الگوی جذب نور، تعیین محتوای یون های فلزی توسط دستگاه icp و همچنین واکنش با معرف اِلمن استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی تحمل سویه های نوترکیب به فلزات نشان داد بیان پروتئین gst-osmti-1b موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلزات کادمیوم، نیکل و روی می شود، در حالی که در سلول های بیان کننده ی پروتئین gst-osmtii-1a تنها افزایش تحمل اندکی در برابر فلزات نیکل و روی مشاهده گردید. هیچ کدام از دو ایزوفرم osmt موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلز مس نشد. از واکنش معرف المن با پروتئین های نوترکیبی که چه در محیط داخل سلول های باکتری و چه پس از خالص سازی در معرض فلزات قرار گرفته بودند، مشخص گردید تمایل پروتئین gst-osmti-1b برای فلزات بررسی شده به ترتیب cd/ni>z>cu می باشد. همچنین با اندازه-گیری میزان فلزات اتصال یافته به پروتئین های نوترکیب مشخص شد هر مول از پروتئین gst-osmti-1b، ظرفیت اتصال به 25/6، 86/4 و 9/4 مول از فلزات نیکل، کادمیوم و روی را دارد. در مقایسه با gst-osmti-1b، فلزات اتصال یافته به پروتئین gst-osmtii-1a قابل چشم پوشی بود که حاکی از عدم تمایل این پروتئین در اتصال به فلزات بررسی شده می باشد. به منظور بررسی نقش دو ایزوفرم osmti-1b و osmtii-1a در پاکسازی گونه های فعال اکسیژنی (ros)، نحوه ی رشد باکتری های بیان کننده ی پروتئین های نوترکیب در مقایسه با شاهد در محیط های کشت حاوی هیدروژن پراکسید (h2o2) واتانول بررسی شد. بیان هر دو پروتئین نوترکیب، به مقدار قابل توجهی رشد سلول های باکتری را در حضور h2o2 افزایش داد، در حالی که در ببرابر تنش اتانول تأثیر مشخصی نداشت. نتایج این تحقیق به خوبی تفاوت نقش دو ایزوفرمosmti-1b و osmtii-1a، متعلق به کلاس i و ii برنج، را نشان داد که می تواند بیانگر نقش اختصاصی آن ها در گیاه برنج نیز باشد.

تیوردوکسین ها (‏trxs‏) پروتئین هایی با وزن مولکولی کم هستند که با توالی آمینواسیدی ‏wc(g/p)pc‏ در جایگاه فعال ‏قابل تشخیص می باشند. ‏trx‏ ها با کمک سیستئین های جایگاه فعال و از طریق احیای برگشت پذیر باند های دی سولفیدی در ‏فرآیند های متعدد اکسیداسیون- احیا شرکت می کنند. برخلاف پستانداران، باکتری ها و قارچ ها، گیاهان دارای ایزوفرم های ‏مختلفی از ‏trx‏ می باشند. ایزوفرم های مختلف ‏trx‏ در گیاهان بر اساس ساختار اولیه و مکان قرارگیری در سلول ‏دسته بندی می شوند. تیوردوکسین های ‏f، ‏m، ‏x‏ و ‏y‏ در کلروپلاست ، ‏trxo‏ در میتوکندری و ایزوفرم های ‏trxh‏ در ‏چندین اندامک سلولی واقع شده اند. در گیاهان عالی ایزوفرم های متعددی از ‏trxh‏ وجود دارند. در ژنوم برنج (‏oryza ‎sativa‏)، نه ژن کدکننده ی ‏trxh‏ شناسایی شده است. همردیف سازی چندگانه بین این ایزوفرم ها، تفاوت قابل توجهی بین ‏ایزوفرم ‏ostrx20‎‏ و هشت ایزوفرم دیگر نشان داد. توالی جایگاه فعال این هشت ایزوفرم از موتیف عمومی جایگاه فعال ‏trxها (‏wcg/ppc‏) تبعیت می کند در حالی که در جایگاه فعال ‏ostrx20‎‏ آمینواسید ‏gly/pro‏ با ‏thr‏ جایگزین ‏شده است. به علاوه در نزدیکی جایگاه فعال، در دیگر ایزوفرم های ‏trxh، آمینواسید حفاظت شده ی ‏asp‏ حضور دارد که ‏در ‏ostrx20‎‏ با آمینواسید بازی ‏lys‏ جایگزین شده است. درتحقیق حاضر، برای مطالعه ی نقش حیاتی آمینواسید های ‏حفاظت شده ی ‏gly‏ و ‏asp‏ در فعالیت احیایی ‏trxh، با استفاده از روش موتاسیون زایی هدایت شده ‏thr55‎‏ و ‏lys48‎‏ به ‏ترتیب با ‏gly‏ و ‏asp‏ در ‏ostrx20‎‏ و ‏gly41‎‏ با ‏thr‏ در ‏ostrx23‎‏ جایگزین شدند. به این منظور و بر اساس این روش ‏واکنش ‏pcr‏ با استفاده از ناقل ‏pet-15b‎‏ حاوی ژن کدکننده ی ‏ostrx20‎‏ طبیعی- به عنوان ماده ی اولیه ی ژنتیکی- ‏انجام شد. محصول ‏pcr‏ بعد از تیمار با آنزیم ‏dpni‏ به باکتری ‏ecoli‏ سویه ی ‏dh5?‏ منتقل شد. بعد از تأیید ‏موتاسیون زایی با استفاده از توالی یابی و هضم آنزیمی به کمک آنزیم برشی مناسب، پلاسمید های حاوی ژن جهش یافته به ‏باکتری ‏e.coli‏ سویه ی ‏rosetta (de3)‎‏ انتقال داده شدند. پروتئین های جهش یافته ی نوترکیب ‏ostrx20(t55g)‎، ‏ostrx20(k48d)‎، ‏ostrx20(t55g)(k48d)‎‏ و ‏his6-ostrx23(g41t)‎‏ پس از القای ‏iptg‏ در فاز محلول تولید شدند. ‏پروتئین های نوترکیب موجود در فاز رویی به روش کروماتوگرافی جذبی و با استفاده از ستون های ‏his-trap‏ ‏خالص سازی شدند. ایزوفرم های ‏trxh‏ جهش یافته ی نوترکیب نیز مانند پروتئین طبیعی از نظر توانایی احیای انسولین- ‏سوبسترای عمومی ‏trx‏ - درphهای مختلف بررسی شدند. به علاوه قابلیت احیای جهش یافته ها توسط ‏osntr1‎‏ ‏آزمایش و با پروتئین طبیعی مقایسه شد. نتایج نشان داد که فعالیت ‏ostrx20(wt)‎‏ در پاسخ به تغییرات ‏ph‏ پایدار نبوده در ‏حالی که جهش یافته های ‏ostrx20(t55g)‎، ‏ostrx20(k48d)‎‏ و ‏ostrx20(t55g)(k48d)‎‏ در برابر این تغییرات پایدار ‏بودند. مطابق با این، جایگزینی ‏gly41‎‏ با ‏thr‏ در ایزوفرم ‏ostrx23‎، منجر به از دست رفتن پایداری ‏ostrx23‎‏ در ‏phهای مختلف شد. به علاوه نتایج نشان داد که جایگزینی ‏thr55‎‏ با ‏gly‏ و ‏lys48‎‏ با ‏asp، تاحدودی باعث بهبود ‏برهم کنش ‏osntr1‎‏ و ‏ostrx20‎‏ شد. بر این اساس برهم کنش ‏osntr1‎‏ و ‏ostrx23‎‏ نیز با جایگزینی ‏gly41‎‏ با ‏thr‏ به مقدار قابل ملاحظه ای کاهش پیدا کرد. به منظور مطالعه ی نقش ‏cysهای انتهای آمینو در ‏ostrx20‎‏ و ‏ostrx23‎، هرکدام از ‏cysها با ‏ser‏ به روش موتاسیون زایی هدایت شده جایگزین شد. نتایج نشان داد درحالی که ‏پروتئین های ‏ostrx20(wt)‎‏ و ‏ostrx23(wt)‎‏ به صورت مخلوطی از فرم مونومر و دایمر حضور دارند، جهش یافته ها ی ‏‎ ‎ostrx20(c3s)(c4s)‎‏ و ‏ostrx23(c11s)‎‏ تنها به فرم مونومر دیده شدند. فعالیت احیایی جهش یافته ها در واکنش با ‏انسولین نیز تقریباً مشابه با پروتئین طبیعی بود. این نتایج نشان می دهد که ‏cys3‎‏ و ‏cys4‎‏ درانتهای آمینوی ‏ostrx20‎‏ و ‏cys11‎‏ درانتهای آمینوی ‏ostrx23‎، نقشی کلیدی در دایمر شدن این پروتئین ها از طریق تشکیل باند های دی سولفیدی ‏دارند.‏

جوانه زنی بذر غلات شامل تجزیه اندوخته ذخیره شده در آندوسپرم نشاسته ای است که مواد غذایی لازم برای حمایت از رشد گیاهچه را تأمین می کند. لایه آلرون نقش مهمی در جوانه زنی ایفا می کند. این لایه به سیگنال های هورمونی تولید شده از جنین پاسخ می دهد و آنزیم های هیدرولیتیک را تولید می کند، که به درون آندوسپرم نشاسته ای ترشح شده و باعث تجزیه ترکیبات ذخیره شده می شود. در تحقیق حاضر، الگوی زمانی و مکانی آنزیم های آلفا آمیلاز و لیمیت دکستریناز (ld) در لایه های آلرون جدا شده از بذر جو که در زمان های مختلف (6 تا 72 ساعت) و در حضور هورمون های جیبرلیک اسید (ga)، آبسیزیک اسید (aba) و سالیسیلیک اسید (sa) انکوباسیون شدند، مشخص شدند. ترشح پروتئین کل از لایه آلرون به درون سوپرناتانت به وسیله وسترن بلات مشخص شد و زمان ترشح آنزیم ld با آنزیم آلفا آمیلاز متفاوت بود که به نظر می رسد به مرگ برنامه ریزی شده (pcd) در لایه آلرون بستگی دارد. زمان ترشح آنزیم آلفا آمیلاز از لایه آلرون به سوپرناتانت قبل از pcd مشاهده شد. مقدار پروتئین کل در لایه های آلرون تیمار شده با غلظت mm 1 هورمون sa بطور قابل ملاحظه ای کاهش یافت در حالیکه مقدار پروتئین کل در لایه های آلرون تیمار شده با غلظت µm 20، بیشتر از لایه-های آلرون انکوبه شده در محیط کشت تیمار شاهد بود که به دلیل توقف ترشح پروتئین از لایه آلرون در پاسخ به هورمون sa و انباشته شدن پروتئین در لایه آلرون می باشد. لایه های آلرون هم چنین با ترکیب هورمون های ga + aba و ga + sa تیمار شدند و ظهور آنزیم های آلفا آمیلاز و ld هم در لایه آلرون و هم در سوپرناتانت بررسی شدند. نتایج نشان می دهد اگرچه مقدار کم از این دو آنزیم در لایه های آلرون تیمار شده با هر یک از هورمون های aba و sa وجود دارد، ترشح دو آنزیم به سوپرناتانت فقط در حضور هورمون ga می تواند صورت بگیرد. علاوه بر این در این تحقیق فعالیت آنزیمی apx به عنوان یکی از آنزیم های درگیر در چرخه آسکوربات - گلوتاتیون در پروتئین های محلول از لایه آلرون آنالیز شد. نتایج نشان می دهد که فعالیت آنزیمی apx در لایه های آلرون تیمار شده با هورمون ga بعد از زمان 48 ساعت بطور قابل ملاحظه ای کاهش یافت در حالیکه این تغییرات در لایه های آلرون تیمار شده با هر یک از هورمون های aba یا sa مشاهده نشد.

مونوترپنوئیدها ساده ترین دسته ترپنوئیدها می باشند و تنها از 10 اتم کربن (دو واحد ایزوپرن) تشکیل شده اند و عمده ترین اجزا روغن های ضروری گیاهی را تشکیل می دهند. بیش تر اعضای این خانواده از ترکیبات طبیعی، توسط مونوترپن سینتازها یا سیکلازها که تبدیل جرانیل دی فسفات را به والد حلقوی اسکلت مونوترپن های متعدد کاتالیز می کند، ساخته می شوند. جرانیل دی فسفات یک ترکیب غیر حلقوی حدواسط 10 کربنه در بیوسنتز ایزوپرنوئیدها می باشد. در گذشته بیشتر مطالعات به روی تولید یک مسیر هترولوگوس خاص برای تولید مونوترپنوئیدها در escherichia coli متمرکز شده بود اما امروزه میکرواورگانیسم های یوکاریوتی مانند مخمر ساکارومایسس سرویزیه به دلیل مشخصات خاصشان به عنوان یک میزبان میکروبی مناسب برای بیان ژن های فعال یوکاریوتی مورد توجه قرار گرفته اند. ساکارومایسس سرویزیه قادر به تولید و ترشح کارآمد مونوترپن ها نمی باشد که علت عمده آن عدم حضور آنزیم های مونوترپن سینتاز در این میکرواورگانیسم است. در این مطالعه به وسیله ابزار مهندسی متابولیک مسیر بیوسنتز ایزوپرنوئیدها در مخمر ساکارومایسس سرویزیه، با بیان ژن تولیدکننده آنزیم لینالول سینتاز تغییر داده شد. این آنزیم از جرانیل پیروفسفاتی که طی مسیر موالونات در مخمر تولید می شود، به عنوان سوبسترا استفاده کرده و آن را به لینالول تبدیل می کند. لینالول یک مونوترپن غیرحلقوی است که در رایحه گل های بسیاری از گیاهان یافت می شود و علاوه بر مصرف گسترده در صنعت، در درمان سرطان سینه و لوسمی نیز کاربرد دارد. ژن لینالول سینتاز از گیاه اسطوخودوس به وکتورهای بیانی متفاوتی از ساکارومایسس سرویزیه وارد شد. این وکتورهای بیانی تحت کنترل 4 پروموتور ساختاری با قدرت های متفاوت ناشی از ژنهای کدکننده سیتوکروم c اکسیداز (cyc1)، الکل دهیدروژناز(adh)، گلیسر آلدهید 3 فسفات دهیدروژناز(gpd) و فاکتور طویل سازی ترجمه 1 آلفا(tef) ، می باشند. سپس این وکتورهای بیانی به درون مخمر ساکارومایسس سرویزیه انتقال داده شدند و حضور ژن لینالول سینتاز با آنالیز pcr به روی dna ژنومی مخمر تائید شد. میزان بیان ژن فعال لینالول سینتاز در مخمرهای دستورزی شده توسط اندازه گیری انتشار لینالول با استفاده از میکرو استخراج فاز جامد اندازه گیری شد. نتایج به دست آمده میزان بیان لینالول در مخمرها را تا میزان 4 میکروگرم در لیتر تائید کرد. همچنین سیستم های بیانی متشکل از پروموتورهای ذکر شده که با ترمیناتور(خاتمه دهنده) cyc1 همراه بودند با یکدیگر مقایسه شدند و مشخص شد که میزان بیان ژن لینالول سینتاز در وکتورهای بیانی با پروموتور gpd نسبت به بقیه بیشتر است. میزان بیان ژن مذکور تحت تاثیر پروموتور tef بیشتر از adh بود ولی نشانه ای از بیان ژن در وکتورهای تحت کنترل پروموتور cyc1 ارزیابی نگردید.

سیستم تیوردوکسین وابسته به nadph (nts) که متشکل از nadph، تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به nadph (ntr) و تیوردوکسین h (trx h) می باشد، با احیای باندهای دی سولفیدی در پروتئین های هدف درگیر در فرآیندهای مختلف سلولی، دارای یک نقش تنظیمی پس از ترجمه در سلول است. بر خلاف سلول های پروکاریوت و پستانداران، گیاهان یک سیستم ntr/trx پیچیده شامل چندین ایزوفرم ntr و trx h دارند. بنابراین سوال مهمی که باید پاسخ داده شود این است که آیا برهم کنش بین ایزوفرم های مختلف ntr و trx h اختصاصی است یا خیر. با جستجو در پایگاه اطلاعاتی ژنوم برنج (oryza sativsa l.)، ما نه ژن بالقوه که trx h را رمز می کنند و چهار ژن بالقوه که ntr را رمز می کنند شناسایی کردیم. فرم های تراریخت دو ایزوفرم osntr (osntr1 و osntr2) و سه ایزوفرم ostrx h (ostrx1، ostrx20 و ostrx23) به طور دگرساخت در باکتری e. coli به صورت پروتئین های his-tag با مقادیر قابل توجه تولید و سپس با استفاده از کروماتوگرافی جذبی خالص سازی شد. این کار امکان بررسی برهم کنش in vitro بین ایزوفرم های مختلف ntr و trx h از یک موجود زنده را فراهم ساخت. به این منظور، پارامترهای کینتیکی osntrها در برهم کنش با سه ایزوفرم ostrx با استفاده از آزمون dtnb تعیین شد. نتایج این آزمون نشان داد که بر خلاف ostrx1 و ostrx23، ایزوفرم ostrx20 توسط osntr احیاء نشد. هر دوی osntr1 و osntr2 پنج برابر تمایل بیشتری به ostrx1 نسبت به ostrx23 داشتند. با این حال مقدار kcat برای هر دو ایزوفرم ostrx تقریباً مشابه بود. این نتایج نشان می دهد که برهم کنش ایزوفرم های ntr و trx در nts اختصاصی است. به علاوه، برای بررسی امکان احیای ایزوفرم های ostrx توسط گلوتاتیون (gsh)، احیای انسولین در حضور gsh و هر یک از ایزوفرم های ostrx اندازه گیری شد. ostrx20 به طور موثری توسط gsh احیاء شد که نشان می دهد احتمالاً سیستم گلوتاتیون مسئول احیای ostrx20 است. همچنین، در مطالعه ی حاضر تحمل سلول های بیان کننده ی پروتئین های تراریخت در پاسخ به تنش های اکسیداتیو مانند h2o2 و اتانول نسبت به شاهد از طریق رسم نمودار رشد آن ها مقایسه شد. در مقایسه با سویه های بیان کننده ی osntr2، سویه های بیان کننده ی osntr1 میزان رشد بیشتری در حضور h2o2 و اتانول داشتند. علاوه بر این، سویه های بیش بیان کننده ی ostrx23 و ostrx1 به ترتیب در مقایسه با ostrx20 میزان تحمل بیشتری در حضور h2o2 نشان دادند، در حالی که میزان تحمل اتانول تفاوت قابل ملاحظه ای بین این سویه ها نداشت. ما همچنین برای اولین بار سویه هایی تولید کردیم که پس از تلقیح iptg قادر به بیان هم زمان osntr1 با هر یک از ایزوفرم های ostrx بود. برای این منظور محصول های pcr تولید شده متشکل از پروموتر، جایگاه اتصال ریبوزوم و هر یک از ژن های رمزکننده ی ایزوفرم های ostrx به پلاسمید pet-28a حاوی ژن osntr1 الحاق شد. به این ترتیب سه ساختواره حاوی ژن های رمزکننده ی osntr1/ostrx1، osntr1/ostrx20 و osntr1/ostrx23 تولید و به باکتری e. coli انتقال داده شد. آماده سازی این سویه ها ما را قادر ساخت تا در محیط in vivo به بررسی برهم کنش osntr1 با هر یک از ایزوفرم های ostrx بپردازیم. از بین این سویه ها، تحمل سویه ی هم بیانی osntr1/ostrx1 در پاسخ به تنش h2o2 بیشتر از سویه های بیان کننده ی osntr1 یا ostrx1 تنها بود. این نتایج نشان می دهد که osntr1 برهم کنش بالاتری با ostrx1 در محیط in vivo دارد که در توافق با نتایج آزمون های in vitro است.

وجود فلزات سنگینی همچون کادمیوم در منابع آبی باعث بروز مشکلات زیست محیطی متعدد و تهدید سلامت عمومی شده است. در بین روش هایی مثل جذب، رسوب دهی شیمیایی، تعویض یون و اسمز معکوس، که برای حذف آلودگی های فلزی مورد استفاده قرار می گیرند، استفاده از روش جذب به دلیل سادگی، هزینه کم، کارایی بالا و انعطاف پذیری در طراحی و عمل عمومیت بیشتری دارد. امروزه از جاذب هایی در مقیاس نانو به ویژه نانوذرات مغناطیسی مثل نانوذرات اکسید آهن(fe3o4) که قابلیت جداسازی مغناطیسی دارند، استفاده می شود. یکی از عوامل مهم در تعیین ظرفیت این نانوذرات، گروهای عاملی موجود بر سطح آنها می باشد. با بهره گیری از قابلیت تثبیت پروتئین بر نانوذرات می توان پروتئین های کلاته کننده فلزات سنگین، مثل متالوتیونین را بر سطح این نانوذرات تثبیت کرد و انتظار داشت که قابلت جذب فلز در آنها بهبود یابد. هدف از این تحقیق تثبیت پروتئین متالوتیونین برنج (ایزوفرم osmti-ib) بر سطح نانوذرات اکسید آهن پوشش دار شده با سیلیکا (fe3o4@sio2) و بررسی تاثیر این پروتئین بر ظرفیت جذب کادمیوم (cdcl2.h2o) توسط نانوذرات بود. ایزوفرم osmti-ib به صورت نوترکیب در باکتری تراریخت escherichia coli سویه rosetta (de3) تولید و فعال بودن پروتئین برای جذب کادمیوم به وسیله تست dtnb و اندازه گیری محتوی کادمیوم پروتئین به وسیله طیف سنجی جذب اتمی (aas) تائید شد. به منظور تثبیت پروتئین از نانوذرات آمین دار شده به وسیله ان - (2-آمینو اتیل) -3- آمینوپروپیل تری متوکسی سیلان (eds) استفاده شد. بعد از فعال سازی سطح نانوذرات آمین دار شده به وسیله گلوتارآلدئید، پروتئین به صورت کوالانسی بر سطح نانوذرات تثبیت و درصد ظرفیت بارگذاری پروتئین (w/w%) بر نانوذرات 5/1 ± 4/40 % محاسبه شد. بعد از قرار دادن نانوذرات حاوی پروتئین و نانوذرات بدون پروتئین به مدت دو ساعت در معرض کادمیوم مقدار باقیمانده کادمیوم با طیف سنجی جذب اتمی اندازه گیری و ظرفیت جذب این نانو ذرات محاسبه شد. مقایسه ظرفیت جذب کادمیوم بر نانوذرات حاوی پروتئین و نانوذرات بدون پروتئین نشان داد که نانوذرات حاوی پروتئین به دلیل دارا بودن مقادیر بیشتری از جایگاه های اتصال کادمیوم ظرفیت جذب بیشتری داشتند. در نانوذرات بدون پروتئین کئوردیناسیون بین یون کادمیوم و گروه آمین عامل جذب کادمیوم بر سطح نانوذرات بود و در نانوذرات حاوی پروتئین، گروه های تیول موجود در پروتئین، یون های کادمیوم را از طریق پیوندهای مرکاپتیدی جذب کردند. تاثیر زمان بر مقدار جذب نشان داد که با افزایش زمان در هر دو نانوذره ظرفیت جذب افزایش یافت. در این رابطه بررسی مدل های سینتیکی فرآیند جذب نشان داد که در هر دو جاذب، فرآیند جذب به وسیله مدل سینتیکی شبه مرتبه دوم کنترل گردید. بررسی اثر غلظت اولیه کادمیوم بر ظرفیت جذب نشان داد که با افزایش غلظت، ظرفیت جذب تا حدی که نانوذرات به حد اشباع درآیند، افزایش یافت. بررسی مدل های ایزوترم نشان داد که مدل لانگمیر با داده های آزمایشگاهی توافق بهتری داشت و با استفاده از این مدل مقدار حداکثر ظرفیت جذب نانوذرات حاوی پروتئین و نانوذرات بدون پروتئین به ترتیب mg/g 88/474 و mg/g 8/315 محاسبه شد. بررسی تاثیر ph بر ظرفیت جذب نانوذرات نشان داد که در هر دو نانوذره با کاهش ph ظرفیت جذب کاهش یافت که علت آن افزایش h+ و در نتیجه افزایش فرم پروتونه گروهای آمین و گروهای تیول و همچنین رقابت بین h+ و cd2+ برای اتصال به سطوح جذب بود. بررسی قابلیت بازیابی و استفاده مجدد از نانوذرات نشان داد که نانوذرات حاوی پروتئین بعد از سه مرتبه استفاده مجدد، بیش از 70 % از فعالیت اولیه خود را حفظ کردند و این مقدار کاهش فعالیت می توانست مربوط به تغییر در ساختمان پروتئین یا از دست رفتن نانوذرات حین مراحل بازیابی باشد. این بررسی در نانوذرات بدون پروتئین نشان داد که این ذرات بعد از چهار مرتبه استفاده مجدد، بیش از 70 % از فعالیت اولیه خود را حفظ کردند. کاهش ظرفیت جذب در این ذرات می توانست مربوط به جداشدن پوشش سیلیکا یا از دست رفتن نانوذرات حین مراحل بازیابی باشد. نتایج این تحقیق نشان داد که تثبیت ایزوفرم osmti-ib متالوتیونین بر سطح نانوذرات ظرفیت جذب در این نانوذرات را بهبود بخشید.

متالوتیونین ها (mt) گروهی از پروتئین های غنی از آمینواسیدهای سیستئین و با وزن مولکولی کم (5 تا 10 کیلودالتون) هستندکه می توانند از طریق گروه تیول آمینواسیدهای سیستئن به فلزات متصل شوند. بیشتر مطالعات بر روی mt ها در گیاهان به بررسی بیان این ژن ها در بافت های مختلف محدود شده است و تحقیقات اندکی تاکنون بر روی نقش و ساختار mt ها صورت گرفته است. تحقیق حاضر با هدف حذف انتهای کربوکسی از ایزوفرم osmti-1b متعلق به تیپ یک mt برنج و تولید فرم موتاسیون یافته n-osmti-1b و بررسی نقش آن در ایجاد تحمل به تنش فلزات کادمیوم و نیکل در مقایسه با فرم طبیعی آن (osmti-1b) انجام شد. به منظور تولید قطعه ژنیn-osmti-1b از ژن osmti-1b پرایمراختصاصی طراحی و ژن مورد نظر توسط pcr تکثیر و در ناقل بیانی pet41a همسانه سازی گردید. پس از تائید صحت همسانه سازی با استفاده از توالی یابی، دستواره تولید شده به میزبان بیانی e. coli سویه ی rosetta(de3) منتقل شد. با القاء بیان پروتئین توسط iptg، میزان قابل توجهی از پروتئین gst-n-osmti-1b تولید شد. تحمل سویه های بیان کننده ی پروتئین های gst-osmti-1b و gst-n-osmti-1b به فلزات سنگین از طریق ترسیم منحنی رشد باکتری ها در حضور نمک های cdcl2 و nicl2 و هم چنین اندازه گیری میزان کاهش فلز از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (aas) بررسی شد. با خالص سازی پروتئین نوترکیب، امکان بررسی تمایل و ظرفیت اتصال آن به فلزات کادمیوم و نیکل در مقایسه با فرم طبیعی gst-osmti-1b فراهم گردید. به این منظور از روش های مختلف شامل بررسی تغییر در الگوی جذب نور و همچنین واکنش با معرف اِلمن استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی منحنی رشد سویه ی موتاسیون یافته به فلزات نشان داد که بیان پروتئین gst-n-osmti-1b موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلزات کادمیوم و نیکل می شود. اندازه گیری میزان فلز کاهش یافته از محیط کشت توسط طیف سنجی جذب اتمی نشان داد سویه ی موتاسیون یافته قادر است 4/7 % از فلز کادمیوم و 63/3 % نیکل را از محیط کشت جذب کند که این میزان برای سویه بیان کننده پروتئین کامل gst-osmti-1b برای کادمیوم 71/11 % و برای نیکل 22/8% بود. مقایسه مقدار فلز جذب شده در این دو سویه نشان داد که این میزان در سویه بیان کننده پروتئین gst-n-osmti-1b به دلیل حذف انتهای کربوکسی که موجب کاهش ظرفیت جذب فلز می شود، کمتر می باشد. برای بررسی قابلیت اتصال پروتئین gst-n-osmti-1b به کادمیوم و نیکل در شرایط درون سلولی از واکنش پروتئین های موتاسیون یافته تولید شده در محیط حاوی فلز و بدون فلز با معرف المن استفاده شد. نتایج نشان داد که سرعت اولیه واکنش معرف المن با پروتئین در فرم بدون فلز بیشتر از پروتئین های حاوی کادمیوم و نیکل بود که این موضوع بیانگر جذب این دو فلز توسط پروتئین می باشد ولی نسبت به پروتئین gst-osmti-1b این واکنش از سرعت کمتری برخوردار است که علت آن کمتر بودن گروه های تیول آزاد آن می باشد. برای بررسی واکنش المن با پروتئین هایی که به صورت مستقیم در معرض فلز قرار گرفته بودند، ابتدا فرم عاری از فلز (آپو پروتئین) آنها با استفاده از روش اسیدی کردن تولید و سپس در معرض فلزات کادمیوم و نیکل قرار گرفتند که نتایج بدست آمده در شرایط درون سلولی را تائید کردند. همچنین بررسی تغییر در الگوی جذب نور پروتئین موتاسیون یافته نتایج جذب کادمیوم و نیکل را توسط این پروتئین تائید کرد. به طور کلی نتایج بدست آمده، فعالیت پروتئین موتاسیون یافته را در جذب فلز حتی بدون انتهایی کربوکسی تأیید می کند که این موضوع بیانگر قابلیت اتصال انتهای آمینو به طور مستقل از انتهای کربوکسی به فلز می باشد.

مخمر ساکارومایسس سرویزیه به عنوان مهمترین مخمر صنعتی و اصلی ترین میکروارگانیسم مولد بیواتانول مطرح است. سویه های صنعتی مخمر طی فرآیند تخمیر، در معرض انواع تنش ها نظیر شوکهای اسمزی، تنش های اکسایشی و سمیت ناشی از متابولیت های ثانویه قرار گرفته که این مسئله منجر به کاهش عملکرد فراورده زیستی مورد نظر می شود. اتانول یک بازدارنده ی رشد در مخمر است که غلظت پایین آن سبب مهار تقسیم سلولی، کاهش حجم سلول و کاهش سرعت رشد شده و غلظت بالای آن سبب کاهش انرژی سلولی و افزایش مرگ سلولی می شود. بنابراین تخمیر موفق زمانی اتفاق می افتد که از سویه های مقاوم مخمر به غلظت های بالایی از اتانول استفاده شود. همچنین تحقیقات نشان داده است که در مخمر در مقادیر کم اکسیدانی، بیان تعداد بیشماری از ژن های دخیل در سم زدایی ros نظیر تیوردوکسین، کاتالاز و گلوتاتیون ردوکتاز افزایش می یابد. این افزایش سنتز آنتی اکسیدان ها، تشکیل دهنده ی اساس واکنش های سازگار بوده که در نهایت منجر به القای مقاومت در مخمر می شود. ولی در دوزهای بالای تنش، سلول های مخمر قادر به مقاومت نبوده و چنین شرایطی منجر به مختل شدن سیستم دفاعی آنها می شود. در این مطالعه به منظور مقاومت مخمر در برابر تنش های اکسایشی، ژن کد کننده متالوتیونین تیپ i برنج، ایزوفرم osmti-1b، که قبلا بیان آن به همراه شریک الحاقیgst در باکتری اشرشیاکلای منجر به مقاومت سلول های تراریخته در برابر پراکسید هیدروژن و کادمیوم شده بود، ابتدا به تنهایی در ناقل بیانی gpd که یک ناقل شاتل است همسانه سازی شد و به سویه ی 5dمخمر ساکارومایسس سرویزیه انتقال یافت. از آنجایی که سویه ی تولید شده مقاومت چندانی به تنش های اکسایشی نشان نداد، بنابراین به منظور افزایش بیان، حلالیت و پایداری osmti-1b در سلول های مخمر، توالی کدکننده ی گلوتاتیون- اس- ترنسفراز (gst) در ابتدای آن قرار داده شد. نهایتا دستواره ی gpd-gst-osmti-1b به سلول های مخمر ساکارومایسس سرویزیه انتقال یافت و سویه 5d-gpd-gst-mt تولید شد. پس از تایید بیان پروتئین gst-osmti-1b به کمک روش وسترن بلات در سویه 5d-gpd-gst-mt ، به منظور سنجش مقاومت ایجاد شده در این سویه، غلظت های مختلف پراکسید هیدروژن، کادمیوم و اتانول به محیط های کشت آن و سویه ی شاهد اعمال شد. نتایج حاصل از مقایسه ی منحنی های رشد در شرایط اعمال تنش بیانگر مقاومت سویه 5d-gpd-gst-mt، نسبت به غلظت های 3 میلی مولار پراکسید هیدروژن، 0.9 میلی مولار کادمیوم و 10% اتانول در مقایسه با سویه ی شاهد بود. همچنین کشت سویه های 5d-gpd-gst-mt و شاهد در محیط حاوی کادمیوم و سپس اندازگیری غلظت کادمیوم موجود در محیط در زمان هایt0 (بلافاصله پس از افزودن کادمیوم به محیط) و t1(پنج ساعت پس از افزودن کادمیوم به محیط) مشخص کرد که افزایش تحمل ایجاد شده در سویه 5d-gpd-gst-mt احتمالا به دلیل تجمع فلز در داخل سلول های مخمر حاوی gst-osmti-1b و نقش این پروتئین در کلاته کردن فلز کادمیوم بوده است.

متالوتیونین ها (mt) گروهی از پروتئین های غنی از آمینواسیدهای سیستئین و با وزن مولکولی کم (5 تا 10 کیلودالتون) هستندکه می توانند از طریق گروه تیول آمینواسیدهای سیستئن به فلزات متصل شوند. بیشتر مطالعات بر روی متالوتیونین ها در گیاهان به بررسی بیان این ژن ها در بافت های مختلف محدود شده است و تحقیقات اندکی تاکنون بر روی نقش و ساختار متالوتیونین ها صورت گرفته است. تحقیق حاضر با هدف حذف انتهای آمینی از ایزوفرم osmti-1b متعلق به تیپ p1 متالوتیونین برنج و تولید فرم موتاسیون یافته c-osmti-1b و بررسی نقش آن در ایجاد تحمل به تنش فلزات کادمیوم، نیکل، روی و مس، در مقایسه با فرم طبیعی آن (osmti-1b) انجام شد. به منظور تولید قطعه ژنیc-osmti-1b از ژن osmti-1b، پرایمراختصاصی طراحی، و ژن مورد نظر توسط pcr تکثیر و در ناقل بیانی pet41a همسانه سازی گردید. پس از تائید صحت همسانه سازی با استفاده از توالی یابی، دستواره تولید شده به میزبان بیانی e. coli سویه ی rosetta (de3) منتقل شد. با القاء بیان پروتئین توسط iptg، میزان قابل توجهی از پروتئین gst-c-osmti-1b تولید شد. تحمل سویه های بیان کننده ی پروتئین-های gst-osmti-1b، gst-n-osmti-1b و gst-c-osmti-1b به فلزات سنگین کادمیوم و نیکل، و فلزات ضروری روی و مس، از طریق ترسیم منحنی رشد باکتری ها در حضور نمک های cdcl2.h2o ، nicl2.6h2o، znso4.7h2o و cuso4 تعیین شد. همچنین اندازه گیری میزان کاهش فلز کادمیوم از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (aas) بررسی شد. با خالص سازی پروتئین نوترکیب، امکان بررسی تمایل و ظرفیت اتصال آن به فلزات کادمیوم، نیکل، روی و مس، در مقایسه با فرم gst-osmti-1b و gst-n-osmti-1b فراهم گردید. به این منظور از روش های مختلف شامل بررسی تغییر در الگوی جذب نور و همچنین واکنش با معرف اِلمن استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی منحنی رشد سویه ی موتاسیون یافته به فلزات نشان داد که، بیان پروتئین gst-c-osmti-1b موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلزات کادمیوم، نیکل، روی و مس می شود. اندازه گیری میزان فلز کاهش یافته از محیط کشت توسط طیف سنجی جذب اتمی نشان داد سویه ی موتاسیون یافته قادر است ppm 4/63 از فلز کادمیوم را در محیط کشت جذب کند، که این میزان برای سویه بیان کننده پروتئین کامل gst-osmti-1b و gst-n-osmti-1b، به ترتیب ppm 4/93 و 2/44 بود. مقایسه مقدار فلز جذب شده در این سویه-ها نشان داد که میزان جذب فلز در سویه بیان کننده پروتئین gst-c-osmti-1b، تقریباً برابر با سویه بیان کننده پروتئین gst-osmti-1b می باشد. این امر می تواند به دلیل ایجاد ساختار فشرده تر حاصل از حذف انتهای آمینی باشد. برای بررسی واکنش المن با پروتئین هایی که به صورت مستقیم در معرض فلز قرار گرفته بودند، ابتدا فرم عاری از فلز (آپو پروتئین) آنها با استفاده از روش اسیدی کردن تولید، و سپس در معرض غلظت اشباع از یون های کادمیوم، نیکل و روی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که سرعت اولیه واکنش معرف المن با پروتئین در فرم بدون فلز بیشتر از پروتئین های حاوی کادمیوم، نیکل و روی بود، که این موضوع بیانگر جذب این فلزات توسط پروتئین می باشد. همچنین بررسی تغییر در الگوی جذب نور پروتئین موتاسیون یافته نتایج جذب کادمیوم، نیکل، روی و مس را توسط این پروتئین تائید کرد. به طور کلی نتایج بدست آمده، فعالیت پروتئین موتاسیون یافته را در جذب فلز حتی بدون انتهایی آمینی تأیید می کند؛ که این موضوع بیانگر قابلیت اتصال انتهای کربوکسی غنی از سیستئین osmti-1b، به طور مستقل از انتهای آمینی به فلز می باشد.