مخمر یاروویا لیپولیتیکا سوبستراهای آب گریز نظیر آلکان ها، اسیدهای چرب، چربی ها و روغن ها را برای تولید اسیدهای آلی، آنزیم های لیپاز، پروتئین و روغن تک یاخته به خوبی تجزیه می نمایند. هدف این تحقیق بررسی تولید و بهینه سازی لیپاز خارج سلولی و اسید سیتریک به عنوان متابولیت های با ارزش از لحاظ زیست فناوری از سوبسترا های ارزان قیمت و تجدیدپذیر است. از بین روغن های گیاهی آزمایش شده به عنوان منبع کربن، روغن زیتون بهترین محیط برای تولید لیپاز و اسید سیتریک بود. سویه dsm 3286 مخمر یاروویا لیپولیتیکا در این محیط حدود 6/34 واحد در میلی لیتر آنزیم لیپاز و همچنین اسید سیتریک و پروتئین تک یاخته به عنوان محصول جانبی در این محیط به همراه عصاره مخمر تولید کرد. به منظور به دست آوردن سویه های مخمر تولیدکننده آنزیم لیپاز در سطح بالا، سویه dsm 3286 مخمر یاروویا لیپولیتیکا تحت جهش زایی با اتیل متان سولفونات و اشعه uv قرار گرفت. 20 سویه از بین 1600 جهش یافته تیمار شده با اتیل متان سولفونات و اشعه uv براساس قابلیت بالای تولید لیپاز بر روی محیط انتخابی گزینش شدند. محیط کشت صنعتی جدیدی حاوی متیل اولئات برای تولید لیپاز بهینه شد، زیرا متیل اولئات یک ترکیب ارزان قیمت و جایگزین خوبی در فرآیند تولید صنعتی است. در فرمنتور 20 لیتری حاوی محیط صنعتی جدید یکی از جهش یافته های uv پس از 24 ساعت 356 واحد در میلی لیتر (حدود 5/10 برابر نسبت به سویه وحشی) تولید نمود. برای فرآیند پایین دستی فرمول های مختلفی از مواد افزودنی به منظور خشک کردن پاششی و انجمادی لیپاز استفاده شد و سپس اثر ph ، دما و زمان ذخیره سازی بر فعالیت پودرهای آنزیمی به دست آمده بررسی گردید. توالی نوکلئوتید ژن لیپاز خارج سلولی نوع دو(lip2) در سویه وحشی و جهش یافته تعیین شد، تجزیه و تحلیل در بین توالی دو ژن تشابه زیادی نشان داد. فقط دو جایگزینی در موقعیت 362 و 385 در ناحیه اصلی کد کننده آنزیم لیپاز مشاهده شد. همچنین دو جایگزینی و دو افزایش نوکلئوتید t در ناحیه پروموتوری تعیین گردید. این اطلاعات اهداف خوبی را برای نوترکیبی dna و مهندسی متابولیک معکوس لیپاز خارج سلولی مخمر یاروویا لیپولیتیکا نشان می دهد. علاوه بر این مدل سازی سه بعدی پروتئین لیپازهای وحشی و جهش یافته تهیه و همولوژی آنها مقایسه شدند. تجزیه و تحلیل ساختارهای دوم نشان داد که آنزیم ها مشابه ساختار لیپازهای معمول دارای یک هسته محافظت شده از لحاظ ساختاری هستند که از هشت صفحه بتا موازی تشکیل شدند که با مارپیچ های آلفا از دو طرف احاطه شدند. در نهایت حامل های fdp100 و fdp101 ساخته شدند که به ترتیب دارای ژن لیپاز وحشی و جهش یافته هستند. این حامل ها را می توان به منظور بررسی بیان و مقایسه لیپازهای وحشی و جهش یافته در سایر میزبان ها استفاده نمود.

گرایش جوامع بشری برای مصرف فرآورده های معطر طبیعی موجب ترغیب محققین در استفاده از بیوکاتالیزورهای میکروبی برای سنتز محصولات معطر طبیعی گردیده است. دو روش عمده دستیابی به وانیلین طبیعی شامل استخراج مستقیم از منابع گیاهی و بیوترانسفورماسیون میکروبی می باشد. با توجه به کاربرد گسترده وانیلین و افزایش روزافزون تقاضا برای مصرف وانیلین طبیعی و همچنین از آنجایی که استخراج از منابع گیاهی بسیار پرهزینه و زمان بر بوده و به تنهایی قادر به تامین بازارهای جهانی نمی باشد، بنابراین لزوم توسعه فرآیندهای بیوتکنولوژیک جایگزین مناسب الزامی می باشد. در این پژوهش، که برای اولین بار در ایران صورت پذیرفته، کاربرد بیوترانسفورماسیون میکروبی در ایجاد وانیلین طبیعی و دیگر متوکسی فنل های باارزش از پیش سازهای فنیل پروپانوئیدی (ایزواوژنول، اوژنول و فرولیک اسید) مورد مطالعه قرار گرفته است. جداسازی و تشخیص سویه های میکروبی تولید کننده وانیلین گام نخست در انتخاب سویه های برتر برای تولید بیوتکنولوژیک وانیلین است. در این راستا، در یکسری آزمایشات غربالگری 211 سویه باکتریایی و مخمری از محیط های مختلف در ایران جدا گردید. تحمل پذیری سویه های جدا شده نسبت به سوبستراهای فنیل پروپانوئیدی و وانیلین به روش های رقت در آگار و میکروپلیت الایزا تعیین شد. غربالگری اولیه با استفاده از آنالیزهای tlc و hplc انجام شد. سویه های منتخب از نظر صفات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی و همچنین فیلوژنی و ملکولی شناسایی و تعیین توالی شدند. غلظت وانیلین و دیگر متوکسی فنل های تولید شده در مخلوط واکنش های بیوترانسفورماسیون بوسیله انواع روش های اسپکتروفتومتری و کروماتوگرافی از جمله gc-fid و hplc مورد سنجش قرار گرفت. در بخش نخست از این کار پژوهشی، از میان 82 سویه باکتری تجزیه کننده ایزواوژنول، سویه باکتری pseudomonas sp. kob10 که دارای بیشترین تولید وانیلین (1.81 گرم در لیتر با راندمان مولی 13 درصد) پس از 60 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون بود، جهت مطالعات بهینه سازی انتخاب شد. پس از بهینه سازی های انجام شده با روش های تک فاکتوری و روش آماری تاگوچی غلظت وانیلین تولیدی در سلول های رویشی سویه مذکور به 3.14 گرم در لیتر (راندمان مولی 22.5 درصد) پس از 60 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون افزایش یافت. در قسمت دیگری از این کار تحقیقی، برای اولین بار جداسازی و شناسایی میکرواورگانیسم های نمک دوست با پتانسیل بیوکانورژن ایزواوژنول به وانیلین مورد مطالعه قرار گرفته است. براساس نتایج بدست آمده، از میان 36 سویه نمک دوست غربالگری شده، سلول های در حال استراحت سویه تحمل کننده نمک psychrobacter sp. csw4 دارای بیشترین تولید وانیلین (1.28 گرم در لیتر با راندمان مولی 13.8 درصد) پس از 48 ساعت واکنش، تحت شرایط غیر بهینه شده بود. پس از بهینه سازی با استفاده از تکنیک های طرح آماری تاگوچی و روش صفحه پاسخ (rsm) غلظت وانیلین تحت شرایط سلول های در حال استراحت سویه مذکور به 2.67 گرم در لیتر (راندمان مولی 44.3 درصد ) پس از 24 ساعت واکنش بیوکانورژن افزایش یافته است. در بخش دیگری از این کار تحقیقی، برای اولین بار شناسایی سویه های مخمری با قابلیت تبدیل ایزواوژنول به وانیلین و وانیلیک اسید مورد مطالعه قرار گرفته است. براساس نتایج بدست آمده، از میان 50 سویه مخمری غربالگری شده، سلول های در حال استراحت سویه مخمری candida galli pgo6 دارای بیشترین تولید وانیلین (راندمان مولی 48 درصد) و وانیلیک اسید (راندمان مولی 19 درصد) پس از 30 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون بود. بررسی همزمان آنالیزهای uv، tlc و hplc تحت شرایط سلولهای در حال استراحت سویه مخمری pgo6 منجر به شناسایی دو متابولیت اصلی (وانیلین و وانیلیک اسید) حاصل از بیوکانورژن ایزواوژنول شد. براساس نتایج بدست آمده مسیرمتابولیسمی احتمالی ایزواوژنول در سویه مخمری pgo6 ترسیم شده است. در قسمت دیگری از این پژوهش، در راستای شناسایی سویه های باکتری با قابلیت تجزیه کنندگی سوبسترای اوژنول به متابولیت های باارزش وانیلین و وانیلیک اسید، 16 سویه باکتری غربالگری شدند و برای اولین بار بیوترانسفورماسیون اوژنول به وانیلین و وانیلیک اسید در سویه بومی pseudomonas resinovorans spr1 گزارش گردید. نتایج نشان داد که بیشترین میزان تولید وانیلین (0.24گرم در لیتر با راندمان مولی 10.3 درصد) و وانیلیک اسید (12/1 گرم درلیتر با راندمان مولی 43.7 درصد) پس از به ترتیب30 و 60 ساعت از شروع واکنش بیوترانسفورماسیون تحت سلولهای در حال استراحت سویه مذکور حاصل شده است. در ادامه این مطالعه متابولیت های اصلی حاصل از کاتابولیسم اوژنول در سلول های در حال استراحت سویه غربالگری شدهspr1 با استفاده از آنالیزهای همزمان tlc و hplc تشخیص داده شده و مسیر متابولیسمی احتمالی اوژنول در سویهspr1 ترسیم شده است. در بخش دیگری از این کار تحقیقی، با هدف شناسایی سویه های باکتری با توانایی تجزیه کنندگی سوبسترای فرولیک اسید، 27 سویه باکتری غربالگری شدند و برای اولین بار تولید موثر متابولیت های وانیلیک اسید و وانیلین در در سویه ای ازbacillus licheniformis shl1 گزارش گردید. براساس نتایج بدست آمده، سلول های در حال استراحت سویه shl1 توانایی بیوکانورژن 1 گرم فرولیک اسید را به 494 میلی گرم در لیتر وانیلیک اسید (با راندمان مولی60 درصد) پس از گذشت 45 ساعت از آغاز واکنش بیوکانورژن دارا می باشد. در قسمت دیگری از این پژوهش، کلونینگ ژن های شناخته شده مسیر کاتابولیسمی فرولیک اسید در شاتل وکتور بیانی pnz8048 به منظور تولید وانیلین نوترکیب مورد مطالعه قرار گرفته است. پلاسمید نوترکیب pnz8048-t5/ech/fcs این امکان را فراهم ساخت که بتوانیم دو ژن fcs و ech را در شاتل وکتور بیانی pnz8048 تحت کنترل پروموتور فاژی t5 در سیستم میزبانی streptococcus thermophilus بطور موفقیت آمیز کلون و بیان کنیم. براساس نتایج بدست آمده، سلول های در حال استراحت سویه مهندسی شده s. thermophilus dsm20617t قادر به تبدیل فرولیک اسید به وانیلین با راندمان مولی 62 درصد پس از 12 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون و وانیلیل الکل با راندمان مولی 18 درصد پس از 16 ساعت، تحت شرایط سلول های در حال استراحت بود. مطالعه اخیر نخستین گزارش از کاربرد باکتری های پروبیوتیک مهندسی شده در تولید وانیلین نوترکیب است. در نهایت، وانیلین طبیعی تولید شده به روش بیولوژیک در مقایسه با وانیلین استاندارد با استفاده از روش های uv، ftir، xrd و اسپکتروسکوپی جرمی مورد شناسایی قرار گرفت. با مقایسه راندمان های وانیلین و وانیلیک اسید حاصل از این تحقیق با سایر مطالعات صورت گرفته در ارتباط با بیوترانسفورماسیون پروپنیل بنزن ها، می توان امیدوار بود که سویه های بومی غربالگری شده، بعنوان بیوکاتالیزورهای میکروبی کارآمد، انتخاب مناسبی برای تولید وانیلین و وانیلیک اسید طبیعی باشند.

در این تحقیق نانوذرات مغناطیسی آهن اکسید اصلاح شده با متیل سیلان به عنوان جاذب برای استخراج همزمان ویتامین های a، 3d و e و همچنین پیش تغلیظ مقادیر کم ویتامین 3d مورد استفاده قرار گرفت. مقادیر ویتامین های استخراج شده با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (hplc) اندازه گیری شد. این نانوذرات طی سه مرحله سنتز شدند: ابتدا نانوذارت مغناطیسی fe3o4 به روش همرسوبی سنتز شدند، سپس فرآیند سل ـ ژل به منظور پوشاندن سطح نانوذرات fe3o4 با سیلیکا استفاده شد و در نهایت سطح نانوذرات سیلیکاپوش شده با استفاده از تری متوکسی متیل سیلان اصلاح گردید. ویژگی های ساختاری و خواص نانوذرات تهیه شده با استفاده از روش های مختلف نظیر پراش پرتو x (xrd)، طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (ft-ir)، آنالیز chns، مغناطیس سنجی نیروی گرادیان متناوب (agfm) و میکروسکوپی الکترونی عبوری (tem) مورد مطالعه قرار گرفت. بهینه سازی عوامل موثر بر استخراج انجام گرفت و استفاده از 2/1 میلی لیتر از عامل سیلیکا، 5/0 میلی لیتر از عامل اصلاح کننده متیل، ph نمونه برابر 0/5، 5 برابر رقیق سازی نمونه، شستشو با محلول بافر دارای 3=ph و محلول 70 درصد متانول در آب، مقدار 100 میلی گرم جاذب، واجذب با 700 میکرو لیتر thf و زمان های جذب و واجذب 1 دقیقه به عنوان مقادیر بهینه مشخص شدند. پیش تغلیظ غلظت های کم ویتامین 3d نیز با استفاده از جاذب نانوذرات مغناطیسی اصلاح شده با متیل سیلان انجام شد. در شرایط بهینه منحنی های کالیبراسیون هر یک از ویتامین ها (999/0r2?) به دست آمد و براساس آنها ارقام شایستگی روش شامل محدوده خطی کاری (00/1-20/0، 25/0-02/0 و mg ml-1 00/3- 00/1 به ترتیب برای ویتامین های a، 3d و e)، حد تشخیص (2/31، 5/0 وg ml-1 µ 1/76 به ترتیب برای ویتامین های a، 3d و e)، تکرارپذیری (8/4%rsd<) و صحت (90? ? بازیابی) محاسبه شدند که مقادیر حاصل نشانگر کارایی قابل قبول روش می باشد. مقایسه منحنی های کالیبراسیون ویتامین 3d قبل و پس از پیش-تغلیظ نشان داد که حساسیت اندازه گیری ویتامین 3d پس از پیش تغلیظ تقریبا ً7/3 برابر افزایش یافته است. سرانجام مقادیر ویتامین های محلول در چربی در شربت مولتی ویتامین، قطره ویتامین کودکان و قرص ویتامین 3d با استفاده از روش استخراج و پیش تغلیظ ارائه شده اندازه گیری شد و نتایج حاصل تطابق خوبی با مقادیر گزارش شده توسط کارخانه سازنده داشت.

در این تحقیق از روش کروماتوگرافی مایع با برهمکنش های آب دوستی (hilic) و مشتق سازی پیش از ستونی با روش کروماتوگرافی مایع فاز معکوس (rplc) جهت جداسازی و انداره گیری همزمان ویتامین های محلول در آب استفاده شده است. از روش های طراحی آزمایش جهت بهینه سازی فاکتور های موثر بر فرایند جداسازی همزمان ویتامین های محلول در آب با استفاده از روش hilic استفاده شده است. این روش جداسازی به عنوان ابزاری جهت جداسازی و اندازه گیری ترکیبات با آب دوستی زیاد به کار گرفته شده است. اثر عوامل مختلف بر جداسازی ویتامین های محلول در آب شامل، درصد استونیتریل، ph، غلظت آمونیوم-استات، سرعت جریان و دما با استفاده از روش طراحی مرکب مرکزی مورد بهینه سازی قرار گرفتند. شرایط بهینه برای جداسازی ویتامین های محلول در آب شامل 87% استونیتریل، ph برابر با 3/4، غلظت آمونیوم استات 88/18 میلی مولار، سرعت جریان 78/0 میلی لیتر در دقیقه و دمای 42 درجه سانتیگراد می باشد. در شرایط بهینه منحنی کالیبراسیون هریک از ویتامین-ها با میزان خطی بودن مناسب (999/0<r2) به دست آمد و بر اساس آنها ارقام شایستگی روش شامل محدوده خطی کاری (1500-300، 4000-500، 2/1-2/0، 25-3، 400-50 و 1-?g.ml 120-40 به ترتیب برای ویتامین های 3b، c، 12b، 9b، 5b و 7b و 1-?g.ml 500-50 برای سه ویتامین 1b، 6b و 2b)، حد تشخیص (1-?g.ml 64/90-04/0)، دقت (8/4 >rsd) و صحت (98% <درصد بازیابی) محاسبه شدند. مقادیر حاصل نشانگر کارایی قابل قبول روش در تعیین مقدار ویتامین های محلول در آب در اغلب نمونه های دارویی می-باشد. سرانجام مقدار هفت ویتامین محلول در آب در قرص مولتی ویتامین اندازه گیری شد و نتایج حاصل تطابق خوبی با مقادیر گزارش شده توسط کارخانه سازنده داشت. دو ویتامین بیوتین (7b) و پانتوتنیک اسید (5b) به دلیل جذب ضعیف در محدوده فرابنفش-مرئی (uv-vis) و همچنین مقادیر بالای سایر ویتامین ها با استفاده از روش hilic قابل شناسایی و تعیین مقدار نبودند. جهت اندازه گیری این دو ویتامین از روش مشتق سازی پیش از ستون و rplc استفاده شد. به منظور مشتق سازی از واکنش گروه عاملی کربوکسیلیک اسید دو ویتامین 5b و 7b با فنیل هیدرازین استفاده شد. آمید تشکیل شده از واکنش اسید و آمین در حضور 1- اتیل 3- (3-دی متیل آمینو پروپیل) کربو دی ایمید (edc) و هیدروکسی بنزوتری آزول (hobt) دارای جذب مناسبی در ناحیه uv می باشد. در مرحله بعد بهینه سازی عوامل موثر بر مشتق سازی انجام گرفت و استفاده از نسبت مولی 14 برابر مقدار edc، 5 برابر هیدروکسی بنزو تری آزول hobt، 2 برابر فنیل هیدرازین نسبت به دو ویتامین و زمان 10 دقیقه به عنوان مقادیر بهینه انتخاب شد. در شرایط بهینه فوق، منحنی کالیبراسیون به روش افزایش استاندارد برای هر یک از ویتامین ها رسم شد و سپس حد تشخیص (3/0 و 1-?g.ml 6 به ترتیب برای ویتامین 5b و 7b )، دامنه خطی (30-2 و 1-?g.ml 400-50 به ترتیب برای ویتامین 7b و 5b)، دقت (7/3rsd< ) و صحت (98> درصد بازیابی) محاسبه شد. سرانجام مقادیر ویتامین های بیوتین و پانتوتنیک اسید در قرص مولتی ویتامین اندازه گیری شد و نتایج حاصل تطابق خوبی با مقادیر گزارش شده توسط کارخانه سازنده داشت.

با توجه به آزمایش هائی که انجام گرفت، استفاده از جاذب اصلاح شده با نرمال هگزان آمین کارائی بالاتری در استخراج مورفین نشان داد و بهینه سازی عوامل موثر بر استخراج با استفاده از این جاذب انجام گرفت. شرایط بهینه شامل استفاده از محلول 35? گلوتار آلدهید، 2 میلی مول از نرمال هگزان آمین،ph نمونه برابر با 8، 5/0 میلی لیتر محلول 5 میلی گرم بر لیتر مورفین، شستشو با محلول دارایph برابر با 8، میزان 300 میلی گرم جاذب، واجذب با 6 میلی لیتر متانول و زمان جذب و واجذب 6 دقیقه بدست آمد. هم چنین در شرایط بهینه نمودار کالیبراسیون مورفین بدست آمد و بر اساس آن ها ارقام شایستگی روش شامل محدوده خطی کاری (0/10-5/0 میلی گرم بر لیتر) ( 999/0 r2?)، حد تشخیص(095/ 0 میلی گرم بر لیتر)، صحت (بازیابی<90?) و تکرارپذیری) 8/4 (%rsd? و محاسبه شدند که مقادیر حاصل نشانگر کارائی قابل قبول روش می باشد. در نهایت مقدار مورفین افزوده شده به بزاق به عنوان نمونه حقیقی توسط این روش اندازه گیری شد و نتایج حاصل با مقدار افزوده شده تطابق مناسبی داشت.