گروه آناستوموزی چهار قارچ rhizoctonia solani بیمارگر مهم و عامل بیماری مرگ گیاهچه و پوسیدگی ریشه در بسیاری از گیاهان می باشد. تاکنون هیچ گونه اطلاعاتی در ارتباط با نقش ساختار ژنتیکی و مرحله جنسی در اپیدمیولوژی ag-4 وجود ندارد. لذا این تحقیق با اهداف تعیین تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیت های r. solani ag-4 با استفاده از آغازگرهای طراحی شده توسط زالا و همکاران (2008) و فروکو و همکاران (2009) انجام شد. صد و نود وهفت جدایه از مزارع مختلف از شش استان ایران (آذربایجان غربی، اصفهان، البرز، خراسان، لرستان و همدان) جمع آوری و ساختار ژنتیکی این قارچ برای بررسی تمایز جغرافیایی با استفاده از هفت جایگاه ریزماهواره ای ارزیابی شد. اغلب ژنوتیپ های چندجایگاهی مختص هر جمعیت بوده و تعداد کمی از ژنوتیپ های چندجایگاهی مشترک بود. بین جمعیت های مختلف جریان ژنی بالا تا متوسط، بر اساس شاخص تثبیت (fst) متوسط تا بالا در مقایسه جفت جمعیت ها مشاهده شد. تنوع ژنوتیپی بالا، نسبت بخش کلونال متوسط و وجود ژنوتیپ های اختصاصی جمعیت مطابق با سیستم تولید مثلی مخلوط برای جمعیت های مورد بررسی بود. احتمال داده می شود که خروج از موازنه هاردی وینبرگ، عدم موازنه گامتی و افزایش معنی دار هموزیگوت ها در نیمی از جایگاهها یا بیش از نیمی از جایگاهها به دلیل حضور آلل های ثبت نشده و اثر والاند باشد. تاکنون نشانگر ریزماهواره ای برای بررسی تنوع ژنتیکی در این بیمارگر طراحی نشده است. در این پژوهش 11 جایگاه ریزماهواره ای چندشکل از r. solani ag-4 با استفاده از روش غنی سازی طراحی گردید. تمامی این جایگاهها برای ارزیابی تنوع ژنی در جمعیت آلوده کننده لوبیا سبز در استان اصفهان مورد استفاده قرار گرفت. تعداد کل آلل ها از سه تا هفت آلل متغیر بود. میانگین شاخص picبرای 11 جایگاه 65/0 بود که نشان داد تمام جایگاههای ریزماهواره ای چندشکلی بالایی دارند. به منظور توالی یابی ناحیه its-rdna با استفاده از آغازگرهای its4/its5 ، 13 جدایه نماینده از شش میزبان متفاوت با ژنوتیپ چندجایگاهی ریزماهواره ای مختلف انتخاب گردید. درخت حاصل از تجزیه و تحلیل این توالی ها ، جدایه های مورد بررسی را به سه زیرگروه فیلو‍‍ ‍ژنتیکی hgi ، hgii و hgiii تفکیک نمود. از میان 13 جدایه مذکور، شش جدایه به طور تصادفی از شش میزبان مختلف برای آزمون بیماریزایی تقاطعی انتخاب شد. تمام جدایه ها قادر به بیماریزایی در تمام میزبانهای مورد آزمون، با شدت بالاتر روی میزبان اصلی خود بودند که با اختصاصی شدن میزبان مطابقت داشت. به نظر می رسد که تمایز جدایه ها در سطح its-rdna با شدت بیماریزایی آنها ارتباط نداشته باشد. این پژوهش اولین تجزیه و تحلیل ژنتیک جمعیت ag-4 r. solani عامل بیماری پوسیدگی طوقه و ریشه می باشد. همچنین اولین گزارش از طراحی جایگاههای ریزماهواره ای برای ag-4 می باشد که می تواند ابزار مفیدی برای ارزیابی تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت r. solani ag-4 فراهم کند.

قارچ (tassi) goid marophomina phaseolina عامل پوسیدگی ذغالی، یک بیمارگر خاکزاد با پراکنش جهانی و دامنه میزبانی با بیش از 500 گونه در75 خانواده گیاهی می باشد. برای بررسی برخی جنبه های هیستوپاتولوژیکی مقاومت به بیمارگر، 32 جدایه قارچ از محصولات متفاوت و از مناطق مختلف خالص سازی شد. شدت بیماریزائی جدایه ها روی بذر سویا، رقم حساس ویلیامز در شرایط گلخانه با استفاده از روش مایه زنی ساقه با پلاگ حاوی بیمارگر اندازه گیری شد. بر اساس آزمون بیماریزائی، جدایه ها دارای سطوح مختلفی از پرآزاری بودند و درجه پرآزاری جدایه ها مستقل از منشا جغرافیائی بود. بررسی میزان مقاومت ژنوتیپ های مختلف سویا به بیماری با استفاده از بیماریزاترین جدایه و سه روش مختلف سنجش مقاومت (روش درون شیشه، آلوده سازی ساقه با خلال دندان و بریدن ساقه) ارزیابی شد. ژنوتیپ های سویا در سه روش، اختلاف معنی داری در سطح 1% نشان دادند. ژنوتیپ های هاچستون و ویلیامز به ترتیب با کمترین و بیشترین میزان آلودگی، به عنوان ارقام مقاوم و حساس انتخاب شدند. بررسی های هیستوپاتولوژیکی پیشرفت بیماری، اختلافات چشمگیری را بین ارقام مقاوم و حساس نشان داد. ارقام مقاوم و حساس از نظر مدت زمان لازم برای نفوذ قارچ به داخل سلول ها، نحوه پیشروی قارچ در داخل سلول، مدت زمان لازم برای تولید میکرواسکلروت و درصد کلنیزاسیون ریشه ها با یکدیگر متفاوت بودند. تخصص یافتگی میزبانی در قارچ m. phaseolina ، از طریق آلوده سازی گیاهان با جدایه های به دست آمده از همان گیاه و جدایه های حاصل از سایر محصولات و بررسی میزان کلنیزاسیون ریشه های آنها در سطح میکروسکوپی تائید شد. خصوصیات ریخت شناسی جدایه ها شامل سرعت رشد در دمای 30 درجه سانتی گراد، رنگ و شکل پرگنه، تراکم میسلیوم هوائی و فنوتیپ کلرات ثبت گردید. تنوع بسیار زیادی در خصوصیات ریخت شناسی جدایه ها مشاهده شد. اغلب جدایه ها حساس به کلرات بودند. فراوانی آناستوموز در بین تمامی جدایه ها بررسی شد. فراوانی پائینی از نظر امکان انجام آناستوموز موفق در بین جدایه های مختلف قارچ مشاهده شد. جدایه ها از نظر وجود ژن های اندوگلوکاناز 1 و2 مورد بررسی قرار گرفتند. برای این منظور با استفاده از توالی های این دو ژن، پرایمر اختصاصی آنها طراحی شد. نتایج واکنش زنجیره ای پلی مراز (pcr) وجود این دو ژن در اکثر جدایه ها را تائید نمود. بین بیماریزائی جدایه ها و ژن های اندوگلوکاناز ارتباط مشخصی وجود نداشت.

قارچ rhizoctonia solani یکی از متنوع ترین و پیچیده ترین گونه های قارچی بوده و از نظر مقایسه ریخت شناسی شبیه قارچ های ناقص بازیدیومیست است. دامنه میزبانی وسیع و فقدان صفات تشخیصی در آن، مطالعات ژنتیکی و تاکسونومیکی جمعیت های این قارچ را با مشکل مواجه ساخته است. در این پژوهش تنوع بیماریزایی 9 جدایه از قارچ رایزوکتونیا باگروه های آناستوموزی مختلف جدا شده از میزبان های مختلف روی 14 میزبان از خانواده های مختلف گیاهی که دارای اهمیت اقتصادی می باشند، شامل ذرت و گندم از خانواده گندمیان (poaceae)، فلفل، گوجه فرنگی و بادمجان از خانواده سیب زمینی (solanaceae)، گلرنگ و آفتابگردان از خانواده کاسنی (compositeae)، پسته از خانواده سماق (anacardiaceae)، عدس و ماش از خانواده بقولات (leguminaceae)، خربزه و هندوانه (cucurbitaceae) و کلزا و تربچه (brassicaceae) در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. آزمایشات با سه تکرار و در هر تکرار با 10 گیاهچه در درون پتری دیش انجام شد. شدت آلودگی و بیماری زایی میزبان بر اساس نمره دهی میزان آلودگی و علائم توسعه یافته روی ریشه ارزیابی شد. تنوع ژنتیکی جدایه های قارچ رایزوکتونیا با استفاده از نشانگرهای مولکولی rflp-pcr و rapd-pcr مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که اغلب گیاهان مورد آزمایش نسبت به بیمارگر حساس و علائم آلودگی را نشان دادند. توسعه آلودگی روی ذرت و گندم به ترتیب با درصد بیماری زایی 99/3 و 3/33 درصد کمترین مقدار بود ولی گوجه فرنگی، گلرنگ، عدس با متوسط درصد بیماری زایی بیشتر از 69 درصد بیشترین حساسیت را در آلودگی با گروه های آناستوموزی مورد آزمایش نشان دادند. نتایج حاصل از بیماری زایی در این پژوهش ارتباط نزدیکی بین گروه های آناستوموزی و بیماری زایی را نشان می دهد. نتایج حاصل از بیماری زایی روی میزبان های مختلف نشان داد که جدایه های متعلق به گروه آناستوموزی 3 ترجیحا خانواده سیب زمینی را به عنوان میزبان اصلی انتخاب کرده و سایر گروه های آناستوموزی روی تمام میزبان ها بیماری زا بودند و دامنه میزبانی برای آنها مفهوم نداشت. نتایج حاصل از نشان گرهای مولکولی با استفاده از آنزیم tru9i وab-02،ubc-280 توانست این جدایه ها را از یکدیگر تفکیک کرده و در گروه های یکسانی قرار دهد.

بیماری های قارچی شامل مرگ گیاهچه، پوسیدگی های ریشه و لکه برگی ها از عوامل عمده کاهش رشد و تولید چغندرقند در سراسر جهان به شمار می روند. بیان پروتئین های مرتبط با بیماری زایی نظیر کیتینازها، یکی از پاسخ های دفاعی گیاهان در مقابل بیمارگرها محسوب می گردد. آنزیم های کیتیناز از طریق تجزیه دیواره های سلولی قارچ ها در افزایش مقاومت گیاهان در مقابل دامنه وسیعی از بیمارگرهای قارچی نقش قابل توجهی دارند. مانیتول-1-فسفات دهیدروژناز (mtld) که توسط ژن mtld رمز می گردد، یک آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز مانیتول در گیاهان است. مانیتول از طریق پاک سازی گونه های واکنش پذیر اکسیژن (ros)، در پاسخ گیاهان به تهاجم بیمارگرها نقش موثری دارد. بر این اساس، دست ورزی ژنتیکی گیاهان با ژن های کیتیناز و mtld از راه کارهای مناسب به منظور افزایش مقاومت گیاهان در مقابل بیماری های قارچی محسوب می شود. این تحقیق با هدف تولید چغندرقند تراریخته از طریق انتقال ژن های کیتیناز لوبیا (chi) و mtld به چغندرقند صورت گرفت. دو رقم دیپلوئید چغندرقند، شامل sbsi-02 و sbsi-04، جهت دست ورزی ژنتیکی به کمک سویه agrobacterium tumefaciens lba4404 حامل ناقل ژنتیکی نوترکیب pbi121-bch دارای ژن chi تحت کنترل راه انداز camv 35s، و نیز سویه a. tumefaciens gv3101 حامل ناقل ژنتیکی نوترکیب pbird-mtd دارای ژن mtld تحت کنترل راه انداز rd29a آرابیدوپسیس، القایی با تنش غیرزیستی، به کار برده شدند و در مورد هر دو دستواره ژنتیکی از ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (nptii) به عنوان ژن گزینش گر گیاهی استفاده شد. به منظور انتقال ژن، از ریزنمونه های برگی جوانه دار که از قابلیت باززایی بالایی برخوردارند، استفاده شد. جوانه های سبز در محیط کشت msb حاوی غلظت های مختلف کانامایسین با موفقیت غربال شدند. واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr)، حضور تراژن های chi و mtld را در اغلب گیاهچه های چغندرقند مقاوم به کانامایسین تأیید نمود. آنالیز لکه گذاری نقطه ای (dot blot)، درج تراژن chi را در ژنوم لاین های تراریخته اولیه (t0) تأیید نمود. از طریق انجام آنالیز دورگه سازی سادرن، تعداد نسخه های درج شده از تراژن های chi و mtld و درج کامل کاست های ژنی مورد نظر در ژنوم لاین های تراریخته چغندرقند تأیید شد. آنالیز رونوشت برداری معکوس-واکنش زنجیره ای پلیمراز (rt-pcr)، حضور رونوشت تراژن های chi و mtld را در لاین های تراریخته نشان داد. آنالیز لکه گذاری وسترن، حضور پروتئین کیتیناز لوبیا با اندازه پیش بینی شده 31 کیلودالتون را در لاین های تراریخته آشکار نمود. آزمون نشت در ژل آگار، عملکرد بازدارندگی عصاره پروتئینی استخراج شده از برگ لاین های تراریخته با بیان پروتئین کیتیناز را بر رشد میسلیومی rhizoctonia solani ag-4 در شرایط in vitro مشخص نمود. ارزیابی مقاومت لاین های تراریخته t0 دارای ژن های chi و mtld در مقابل قارچ های بیمارگر برگی cercospora beticola و alternaria alternata و همچنین بیمارگر خاک زاد r. solani ag-2-2 مورد بررسی قرار گرفت. زیست سنجی با c. beticola در سطح گیاه کامل، افزایش سطح مقاومت لاین های تراریخته دارای ژن های chi و mtld، شامل تأخیر در ظهور علائم بیماری و کاهش متوسط قطر لکه های برگی را در مقایسه با گیاهان تیپ وحشی نشان داد. نتایج حاصل از آزمون زیست سنجی با استفاده از قطعات جدا شده برگ و نیز گیاه کامل نشان داد که لاین های تراریخته chi، و نیز لاین های تراریخته mtld که به مدت 10 روز در معرض دمای c° 5 قرار داده شده بودند، مقاومت افزایش یافته ای را به a. alternata دارا می باشند؛ هرچند که لاین های تراریخته mtld که در شرایط بدون تنش نگهداری شده بودند خسارت کمتری را در مقایسه با گیاهان تیپ وحشی، همراه با تأخیر چهار تا پنج روزه در ظهور علائم آلودگی قارچی نشان دادند. زیست سنجی با استفاده از برگ های جدا شده آشکار نمود که ژن های chi و mtld حفاظت قابل توجهی را برای لاین های تراریخته مورد بررسی در برابر r. solani ag-2-2 فراهم نموده اند. لاین های چغندرقند تراریخته و گیاهان تیپ وحشی از نظر میزان مقاومت به بیمارگرهای قارچی مورد بررسی دارای تفاوت معنی دار (01/0 ? p) بودند.