آفتابگردان به خاطر داشتن مصارف مهم خوراکی، دارویی، صنعتی و... در بین سایر دانه های روغنی جایگاه ویژه دارد. از آنجایی که عمده ارزش تغذیه ای واقتصادی این گیاه در بذور آن نهفته است و بذور منابع مهم پروتئین، کربوهیدرات و روغن می باشند، اصلاح ژنتیکی در راستای بهبود کیفیت و کمیت صفات مرتبط با دانه ی آفتابگردان اهمیت پیدا کرده است. در مهندسی ژنتیک این صفات و هدفگیری بذر آفتابگردان، نیاز به استفاده از راه اندازهای اختصاصی بذر است. بنابراین همسانه سازی آن ضرورت این تحقیق را آشکار میسازد. در این تحقیق جداسازی و همسانه سازی راه انداز اختصاصی از ژن آلبومین در دو رقم بنام های آلتار و r21×330 انجام گرفت. بدین منظور ابتدا بر اساس مطالعات بیوانفورماتیک و با استفاده از نرم افزارهایoligo5 و primer3 آغازگرهای اختصاصی طراحی شد. پس از تکثیر قطعات مورد نظر با پی سی آر، محصولات حاصله پس از برش با آنزیمهای برشی hindiii و bamhi و سوار کردن در پلاسمید pbluescript ii ks همسانه سازی شدند. تایید کلنی های تراریخته و مثبت (سفید) بواسطه داشتن قطعه راه انداز، با کلنی پی سی آر و استفاده از آنزیم های برشی و الکتروفورز ژل آگارز، انجام شد. پس از توالی یابی کلون ها، تفاوت ها و تشابهات قطعه راه انداز همسانه سازی شده با اطلاعات موجود در شبکه بررسی شد. نتایج حاصل از بررسی های بیوانفورماتیکی نشان داد که راه انداز همسانه سازی شده در نواحی گوناگون دارای تغییرات نوکلئوتیدی درج، حذف و جایگزینی است. با این توصیف که محل این تغییرات شامل جعبه ی tata و جعبه ی caat و ناحیه ی utr و ناحیه آغاز ترجمه نمی گردد. با بررسی بیان این راه انداز می توان تاثیر تغییرات نوکلئوتیدی را در میزان و نحوه بیان مشاهده نمود. همچنین عملکرد و کارایی ناحیه utr در بیان ژن مشخص خواهد گردید.

علیرغم اینکه همه سلول های یک موجود زنده دارای ژنوم یکسانی هستند، تمایز سلول ها، تشکیل بافتهای مختلف و تداوم عمل آنها نیازمند بیان اختصاصی برخی ژن ها در بافتها و شرایط مختلف است؛ راه اندازهای ژنی یکی از اصلی ترین وظایف را در این مورد برعهده دارند. با توجه به اهمیت ذرت به عنوان یک گیاه زراعی و یک گونه مدل مهم در مطالعات ژنتیکی، جداسازی بخش راه اندازی ژن های آلفا-زئین به عنوان راه اندازهای اختصاصی بذر، در این تحقیق هدف گیری شد. این راه اندازها چه در تولید پروتئین های نوترکیب و چه در تغییر کیفیت و خصوصیات بذر/دانه ذرت می توانند حائز اهمیت باشند. به منظور جداسازی این راه اندازهای اختصاصی ، ابتدا اطلاعات موجود در پایگاه داده های نوکلئوتیدی، جمع آوری شده، سپس اقدام به طراحی آغازگرهای اختصاصی از توالی های مرتبط گردید و از آنها برای تکثیر راه اندازها توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده شد. برای تهیه ماده آزمایشی گیاهی، بذور دو رقم 704 و ذرت شیرین در شرایط گلخانه ای کشت شده و با استفاده از روش ctab از گیاهان دو برگی dna کل استخراج شد. پس از ارزیابی محصولات تکثیری و استخراج آنها از ژل، اقدام به همسانه سازی آنها در ناقل pgem-t easy vector گردید. سپس باکتری های سویه dh5? با استفاده از روش tss مستعد شده و با محصول واکنش اتصال تراریخت شدند. برای گزینش کلنی های موردنظر از آمپی سیلین و تست آبی- سفید در حضور x-gal و iptg استفاده شد. حضور قطعه مورد نظر در پلاسمید نیز توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز کلنی ها و برش آنزیمی تأیید شد. پس از توالی یابی، نتایج بدست آمده با اطلاعات موجود در شبکه مقایسه شده و تفاوت ها و شباهت های آنها مشخص گردید.

با توجه به یافته های جدید در زمینه اهمیت روغن در تغذیه انسان و نیز موارد صنعتی کاربرد آن، گیاهان روغنی به عنوان یکی از منابع عمده تامین کننده روغن، مورد توجه محققین قرار گرفته است. سطح زیر کشت کلزا به عنوان یک گیاه روغنی در کشور به ویژه در سال های اخیر در حال گسترش بوده است با توجه به این امر بهبود کیفیت روغن حاصل، از طرق مختلف از جمله دستکاری ژنتیکی گیاه، نیز بایستی مورد توجه قرار بگیرد. تحقیق حاضر در راستای امر فوق، به عنوان گام موثر در بهبود کیفیت روغن کلزا انجام گرفته است. بدین صورت که ابتدا از طریق بانک های اطلاعاتی dna، توالی ژن هایfad2 و fatb درگیر در سنتز اسیدهای چرب در کلزا و گیاهان مشابه مورد بررسی قرار گرفت و برای تکثیر اختصاصی آن ها آغازگرهای مورد نیاز با استفاده از نرم افزار پرایمر- بلاست طراحی و برای سنتز سفارش داده شد. به منظور تکثیر قطعات ژنی از دستگاه ترمال سایکلر استفاده گردید. قطعات تکثیر یافته با روش pcr پس از خالص سازی از ژل آگارز با وکتور pgemt-easy اتصال و بعد از همسانه سازی توسط باکتری e. coli ، توالی یابی گردید و پس از اطمینان از توالی همسانه سازی شده، اقدام به همسانه سازی این قطعات در یک وکتور دوگانه بعنوان سازه rnai گردید و در نهایت پس از تایید قطعات مورد هدف، آگروباکتریوم حاوی سازه rnai با روش ذوب و انجماد تهیه گردید که سازه مذکور شامل رشته سنس و آنتی سنس قطعات fatb و fad2 تحت راه انداز 35s و پایان دهنده nos می باشد ؛ که گام موثری در جهت تولید گیاه کلزا با محتوای اسیداولئیک بالا در تحقیقات آینده محسوب می-گردد

آندوسپرم غلات دارای اهمیت اقتصادی و تغذیه ای فراوانی بوده و منبع انرژی و پروتئین برای جوامع انسانی و حیوانات اهلی به شمار می رود. استفاده از تغییر ژنتیکی در جهت بهبود ساختار و ترکیبات آندوسپرم، نیازمند راه-اندازهای ژنی مناسب برای بیان ترا ژن ها به میزان و الگوی مطلوب می باشد. از این رو در این پژوهش جداسازی راه-اندازهای اختصاصی ژن های زیرواحدهای گلوتنین با وزن مولکولی بالا (hmw-gs) از گندم نان و دوروم مورد توجه قرار گرفت. با طراحی آغازگرهای اختصاصی و بکارگیری آن ها بر روی dna ژنومی، طی واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) قطعات راه انداز به طول 954 و 545 جفت باز از گندم نان رقم نیک نژاد و قطعات راه انداز به طول 961 و 548 جفت باز از گندم دوروم رقم دنا تکثیر یافت. سپس این قطعات به حامل pgem-t انتقال یافته و کلنی های سفید (تست آبی- سفید)، جهت تایید حضور قطعه، از طریق کلنی pcr و هضم آنزیمی تست شدند که هر دو روش وجود قطعه را ثابت نمود. پس از توالی یابی و تایید مولکولی قطعات، قطعه راه انداز 954 جفت بازی جداسازی شده از گندم نان، به حامل بیان ژن گیاهی انتقال داده شده و با استفاده از روش آنزیمی، حضور قطعه راه انداز در پلاسمید بیانی تایید گردید. بررسی توالی های همسانه سازی شده، با نرم افزارهای blast و clustalw، شباهت بسیار این توالی را با سایر راه اندازهای ژن های پروتئین های ذخیره ای شناخته شده آشکار نمود. نتایج تجزیه های فیلوژنتیکی نشان داد قطعات 954 و 545 جفت بازی جداسازی شده از گندم نان و راه انداز 961 جفت بازی جداسازی شده از گندم دوروم متعلق به گروه ژنی glu-b1-1 و راه انداز 548 جفت بازی جداسازی شده از گندم دوروم جزء ژن های glu-a1-1 می باشند. استفاده از راه اندازهایی که فقط در برخی از بافت ها عمل می کنند، می تواند در رسیدن به اهداف اختصاصی از جمله تولید پروتـئین های نوترکیب در بذر ویا بافت های ویـژه بـذری، انجام تحقیقات پایه و اصلاح کمی و کیفی گندم بسیار سودمند باشد.

وجود سازه اختصاصی بذر برای تغییر ژنتیکی پروفایل پروتئین های ذخیره ای دانه ذرت از مهمترین نیازهاست که در این تحقیق هدف گیری شده است. پروتئین های ذخیره ای غالب دانه ذرت، یعنی زئین ها که60% پروتئین های ذخیره ای دانه ذرت را تشکیل می دهند ، از نظر محتوای اسیدآمینه های ضروری مانند لیزین و تریپتوفان دارای کمبود هستند که این امر منجر به کیفیت غذائی پائین دانه ذرت می شود. از طریق شناسایی موتانت ها یا دستکاری های ژنتیکی انجام شده، نشان داده شده است، دانه هایی که میزان پروتئین های زئین آنها کاهش یافته، میزان کل اسیدآمینه های لیزین و تریپتوفان در آنها افزایش پیدا کرده است. زیرخانواده 19-kdaاز کلاس آلفا زئین 40% از کل پروتئین های زئین را تشکیل می دهد و تقریبا بصورت کامل از اسیدآمینه های لیزین و تریپتوفان تهی است. هدف از اجرای این تحقیق تولید سازه پلاسمیدی rnai (rna interference) اختصاصی بذر برای خاموشی ژن های مربوط به زیرخانواده 19-kdaاز کلاس آلفا زئین از طریق فناوری rnai می باشد تا از این طریق موجبات کاهش پروتئین های زئینی فقیر از اسیدآمینه های ضروری و به دنبال آن افزایش پلیوتروپیک پروتئین های غیر زئینی غنی از اسیدآمینه های لیزین فراهم گردد. بمنظور ساخت سازه مورد نظر، رشته همسو و ناهمسو ژن مورد نظر که هر دو تحت تنظیم یک راه انداز اختصاصی آندوسپرم بذر ذرت قرار دارند و توسط یک رشته غیر مشابه جدا می شوند در یک سازه با همدیگر همسانه سازی شدند. برای این کار در ابتدا قطعات مورد نظر شامل قطعه 19pro&s (رشته همسو حاوی راه انداز اختصاصی آندوسپرم بذر) و قطعه 19as (رشته ناهمسو) بوسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر و پس از تایید اندازه آنها بوسیله الکتروفورز ژل آگارز، بصورت جداگانه در حامل همسانه سازیpgem-t شرکت promega همسانه-سازی شدند. سپس قطعه 19as که تا پیش از این در حامل یاد شده همسانه سازی شده بود با برش توسط آنزیم های برشی sac i و pst i از حامل خارج و پس از استخراج از ژل آگارز بوسیله کیت استخراج از ژل شرکت bioneer، در حامل همسانه سازی حاوی قطعه 19pro&s تهیه شده از قبل و در پایین دست این قطعه و بصورت ناهمسو با آن درج شد. بعد از رونویسی این توالی تشکیل یک مولکول rna دورشته ای سنجاق سری را می دهد که آغازگر فرایند rnai است. در طول ساخت سازه مورد نظر صحت قطعات با استفاده از توالی یابی تایید شدند. آنالیزهای مقایسه ای کاست ساخته شده با نتایج ثبت شده با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی انجام گرفت.

امروزه تکنولوژی انتقال ژن به یک ابزار بنیادی برای تحقیقات پایه ای در بسیاری از مطالعات گیاهی تبدیل شده است. پایین بودن سطح بیان ژن های انتقالی به گیاهان تراریخته از مهمترین فاکتورهای محدود کننده مهندسی ژنتیک گیاهی است. بنابراین فعالیتهای تنظیمی پروموترها در رونویسی برای بهبود کارائی سیستم تراریخت گیاهی مورد مطالعه قرار می گیرد. به دلیل اهمیت سیب زمینی به عنوان چهارمین غذای مصرفی بعد از گندم، برنج و ذرت این تحقیق روی گیاه مزبور انجام شد. از آنجایی که غده سیب زمینی قسمت خوراکی و مصرفی این گیاه محسوب می شود شناسایی وجداسازی راه انداز اختصاصی آن هدف اصلی این تحقیق می باشد. همچنین از آنجاییکه وجود توالی سیگنال پپتید موجب انتقال پروتئین های نوترکیب به اندام مورد نظر می شود شناسایی و جداسازی این توالی نیز به همراه ناحیه پروموتری هدف گیری شد. در این تحقیق ابتدا اطلاعات مربوط به راه انداز اختصاصی ژن از گیاهان مختلف جمع آوری شده وبا راه اندازهای اختصاصی غده سیب زمینی از نظر توالی نوکلئوتیدی مورد مقایسه قرار گرفت و با استفاده از قسمتهای مشترک و مورد نظر از این راه اندازها آغازگرهایی طراحی شد و برای تولید سفارش داده شدند. برای دسترسی به نواحی مورد نظر پس از استخراجdna از گیاه سیب زمینی، واکنش زنجیره ای پلی مراز با استفاده ازآغازگرهای اختصاصی انجام پذیرفت. بعد از تکثیر قطعات مورد نظر،این قطعات در پلاسمید pgem- t همسانه سازی شدند و باکتری های تراریخت تولید شد و پلاسمیدهای استخراج شده از آنها از طریق آنزیم های برشی مورد تایید قرار گرفتند و نهایتا برای تعیین توالی آنها اقدام شد. توالی های حاصله مجددا مورد بررسی های بیوانفورماتیکی قرار گرفته و نتیجه گیری های لازم یعنی شباهت قطعات همسانه سازی شده با اطلاعات موجود در ncbi تایید شدند.

چکیده: مولکول های افی بادی، داربست های پروتئینی کوچکی (حدود 7 کیلودالتون)می باشند، که از دومین b پروتئینa استافیلوکوکوس spa)) مشتق شده اند. این مولکول ها، پروتئین های مهندسی شده غیرایمنوژنیک با 58 آمینواسید و سه مارپیچ می باشند و مانند آنتی بادی ها ی مونوکلونال ، به تعداد زیادی از پروتئین ها و پپتیدهای هدف از جمله گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (her2) با تمایل پیوندی بالا متصل می شوند. امروزه این مولکول ها در پژوهش های بیوشیمیایی، کاربردهای تشخیصی و درمانی به ویژه در تشخیص سرطان کاربرد دارند. پس از بررسی آخرین مطالعات انجام گرفته و دسترسی به توالی قطعه dna همسانه سازی شده از سویه 1112 استافیلوکوکوس اورئوس الزام به طراحی و ایجاد تغییرات گوناگون مولکول افی بادی با 5 مارپیچ به منظور افزایش تمایل پیوندی به گیرنده her2 برای تصویربرداری از سطح سلول های سرطانی شد. پس از بررسی های بیوانفورماتیکی، برای سنتز به شرکت generay کره جنوبی ارسال گردید. در دو انتهای ژن مورد نظر دو جایگاه برشی ndei و xhoi قرار داده شد. جهت خارج سازی ژن، واکنش هضم آنزیمی با استفاده از دو آنزیم برشی فوق انجام شد. بعد از برش و آماده سازی ناقل (pet-26b) ، قطعه ژن مورد نظر توسط فرایند تخلیص از ژل آگارز طی یک واکنش اتصال با استفاده از آنزیم لیگاز به ناقل منتقل گردید. پس از خاتمه واکنش اتصال، تراریختی باکتریایی صورت گرفت. برای تراریختی باکتریایی، سلول های مستعد دریافت پلاسمید، تهیه گردید. برای تهیه این سلول ها، از محلول tss استفاده شده و وارد کردن پلاسمیدهای نوترکیب در سلول های باکتریایی و تکثیر آن در باکتری با استفاده از روش شوک حرارتی صورت گرفت. سپس سلول های تراریخته، کشت و کلون های حاصل مورد گزینش و غربالگری قرار گرفتند. از کلنی های حاصل اقدام به جداسازی پلاسمید به روش لیز قلیایی صورت گرفته و تأیید قطعات همسانه سازی شده با آنزیم های برشی، صورت گرفت. پس از مشاهده قطعه مورد نظر در ژل و تطبیق اندازه آن با نوار نشانگر وزنی مولکولی، جهت تأیید توالی نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر برای توالی یابی ارسال گردید. به منظور بررسی بیان پروتئین، ناقل حامل قطعه به باکتری e. coli سویه bl21 منتقل گردید. مقایسه کل پروتئین استخراج شده از باکتری های تراریخت و شاهد با استفاده از روش sds-page مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نهایی نشان داد که بیان افی بادی سنتزی در سیتوپلاسم ، تأثیر منفی بر رشد باکتری های تراریخته نمی گذارد.

دارپینها )پروتئینهای تکرار انکرین طراحی شده( گروه جدیدی از داربستهای پروتئینی کوچک غیرایمنولوژیک با پتانسیل غلبه بر محدودیتهای پادتنهای مونوکلونال هستند که از ژنوم انسان مشتق شده است. این مولکولها، پروتئینهای غیرایمنولوژیک مهندسی شده میباشند، که به تعداد زیادی به پروتئینها و پپتیدهای هدف از جمله گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی ) her2 ( با تمایل پیوندی بالا متصل میشوند و از روشهای نوین درمانی محسوب می شوند

چکیده ندارد.