نام پژوهشگر: فاطمه صومی
فاطمه صومی منصوره میر ابوالفتحی
چکیده قارچ fusarium graminearum با فرم جنسی ( giberella zea) عامل بیماری پوسیدگی جیبرلایی خوشه در ذرت میباشد که سبب کاهش کیفیت و تجمع مایکوتوکسینهای don و zon در ذرت میگردد. اهداف تحقیق شامل تعیین ارتباط میان تولید داکسی نیوالنول و میزان کمی dna جدایه توکسین زای قارچ fusarium graminearum در خوشه ذرت با استفاده از تکنیک real time pcr و تفکیک این قارچ از دیگر گونه های فوزاریوم من جمله f.verticillioides,f.proliferatum,f.semitectum که دانه های ذرت موجود در ایران را در اواخر زمان برداشت کلونیزه می کنند، می باشد. بدین منظور در ابتدا تکنیک pcr با استفاده از جفت پرایمر اختصاصی قارچ f.graminearum انجام گرفت و باند اختصاصی bp300 مشاهده گردید. برای ارزیابی کمی dna با استفاده از تکنیک real time pcr، جفت پرایمری که تولید کننده باند 100bpبود استفاده گردید. برای افزایش تولید don توسط جدایه f.graminearum، جدایه روی محیط pdb کشت داده شد و پس از 15 روز در دمای 25 درجه سانتی گراد میزان don به وسیله تکنیک hplc+iac اندازه گیری شد. برای تعیین میزان تولید توکسین در بلال، آزمایش گلخانه ای صورت گرفت. بدین طریق که دانه های ذرت در گلخانه کاشته شدند. پس از ظهور بلال ها، تمامی آن ها با 2 میلیلیتر از ماکرو کنیدیومهای قارچی (سوسپانسیون قارچی) از طریق روش آلودهسازی کاکل مایهزنی شدند. 7 روز پس از مایه زنی و آلودهسازی ذرتها، میزان don، ppm 2 تخمین زده شد. سپس برای تعیین ارتباط بین میزان تولید dna قارچی و don تولید شده، آزمایش گلخانهای انجام شد. بدین ترتیب که ابتدا، دانههای ذرت درگلخانه کشت داده شدند. 7 روز پس از ظهور کاکل، تمامی بلالها با 2 میلیلیتر از ماکرو کنیدیومهای قارچی از طریق روش آلودهسازی کاکل مایهزنی شدند.. این آزمایش 9 بار تکرار شد و در هر تکرار از 5 بلال استفاده گردید. یک، دو، سه، چهار، شش، هفت، نه، دوازده، پانزده و هجده روز پس از مایهزنی، بلال ها از ریشه جدا شده و در فریزر در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. دانههای هر کدام از بلال ها جدا شدند ( در این آزمایش از دانههای بلال استفاده گردید نه چوب بلال، زیرا در چوب میزان تجمع توکسین بیشتر است). دانههای جدا شده به طور تصادفی به 2 قسمت تقسیم شدند. نیمی از دانهها برای استخراج dna و نیمی برای استخراج don مورد استفاده قرار گرفتند. به طور هم زمان dna قارچی نمونهها با استفاده از روش استخراج dna، استخراج گردید و don موجود در نمونه با استفاده از آب استخراج گردید و هر نمونه با استفاده از ستون ایمنو افینیتی که به آنتی بادی منوکلونال تعبیه شده بود خالص گردید و غلظت don نمونه ها با استفاده از روش hplc تخمین زده شد و منحنی استاندارد با معادله 176/16 x+085/19 y= و رگرسیون 9998/0r= رسم گردید. و نمونههای dna استخراج شده با استفاده از دستگاه light cycle system با استفاده از تکنیکsyber green تخمین زده شدند و منحنی استاندارد با معادله 49/30 x + 353/3- y= با رگرسیون 994/0 r= توسط دستگاه رسم گردید. نتایج حاصل از real time pcr و hplc ارتباط مثبتی بین دادههای don و dna تولید شده توسط جدایه قارچی با معادله148/3- x016/5 y= با رگرسیون 949/0 r= نشان داد.