چکیده به تولید پروتئین های دارویی و صنعتی ارزشمند در گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک، کشاورزی مولکولی اطلاق می شود. از مزایای انتقال ژن به ژنوم کلروپلاست در مقایسه با ژنوم هسته می توان به سطح بالای بیان، امکان بیان چند ژن در یک اپرون پلی سیسترونی، نبود اثرات خاموشی ژن و احتمال بسیار اندک انتقال افقی ژن از طریق دانه گرده اشاره نمود. سالانه میلیون ها نفر در دنیا از عوارض ناشی از بیماری های قلبی و عروقی رنج می برند. یکی از مهم ترین داروهای حذف کننده لخته برای درمان این نوع از بیماری ها، پروتئین فعال کننده ی پلاسمینوژن بافتی (tpa) است. این آنزیم پروتئازی با تبدیل پلاسمینوژن به فرم فعال پلاسمین، موجب تجزیه رشته های فیبرین لخته می گردد. فرم کوتاه شده فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (k2s) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی تر نسبت به tpa است. در تحقیق حاضر، ناقل کلروپلاستی مناسبی به کمک بررسی های بیوانفورماتیکی و با در نظر گرفتن توالی های مورد نظر مانند نواحی احاطه کننده ی اختصاصی گیاه کاهو و عناصر افزایش دهنده بیان در سطوح رونویسی و ترجمه، طراحی گردید. ناقل کلروپلاستی حاوی ژن ترکیبی plygbs::k2s، پس از همسانه سازی، از نظر ساختاری و عملکردی با استفاده از روش های مولکولی مورد تأیید قرار گرفت. به منظور انتقال ژن به کلروپلاست گیاه کاهو، سیستم کشت بافت و باززایی مستقیم نوساقه ها از سلول های تراریخت بهینه سازی شد. ناقل کلروپلاستی (pbl102) با استفاده از روش بمباران ذره ای به ریزنمونه های برگی منتقل گردید و ریزنمونه ها روی محیط گزینشگر حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین (یا استرپتومایسین) قرار گرفتند. پس از چند مرحله واکشت و باززایی، گیاهچه های تراریخت کلروپلاستی به صورت مستقیم از ریزنمونه ها باززایی شدند. نتایج ارزیابی گیاهان تراریخت کلروپلاستی در سطح dna نشان داد که ژن های انتقالی در جایگاه صحیح در ژنوم کلروپلاستی درج شده اند. همچنین، رونویسی از ژن plygbs::k2s به روش rt-pcr اثبات شد. بررسی بیان پروتئین به وسیله آزمون های sds-page، elisa، لکه گذاری نقطه ای و وسترن، تولید پروتئین نوترکیب plygbs-k2s را در کلروپلاست گیاهان کاهو تأیید نمود. کلمات کلیدی: مهندسی ژنوم پلاستیدی، ناقل کلروپلاستی، کشاورزی مولکولی، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی، گیاه کاهو

" کشاورزی مولکولی" به تولید پروتئین های دارویی و آنزیم های صنعتی ارزشمند در گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک اطلاق می شود. آنزیم لوسیفراز حشره شبتاب یکی از مهمترین آنزیم های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه های مختلف بیوتکنولوژی و بیولوژی سلولی و مولکولی بویژه در تشخیص میزان atp به منظور تشخیص آلودگی های میکروبی، تهیه کیت های تشخیص سرطان، غربالگری داروها، زیست حسگرها، همچنین در بررسی روابط برهمکنشی و تاخوردگی پروتئین ها، سنجش های آنزیمی و توالی یابی dna (pyrosequencing) استفاده می شود. ژن لوسیفراز نیز به عنوان ژن گزارشگر ایده آل در مهندسی ژنتیک به منظور بهینه سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی lampyris turkestanicus و تولید آن در گیاه توتون انجام گرفت. در این تحقیق، ژن لوسیفراز حشره شبتاب (luc) به کمک باکتریagrobacterium tumefaciens سوش lba4404 به گیاه توتون کولتیوار xanthi منتقل شد. آغازگرهای مناسب با توجه به توالی های انتهای َ3 و َ5 ژن لوسیفراز، محل های برشی ncoi و bsteii و توالی افزایش دهنده سیستم بیان گیاهی (kozak sequence) طراحی شدند. ژن مورد نظر به کمک pcr با آغازگرهای اختصاصی جداسازی و پس از عملیات هضم آنزیمی و اتصال (ligation)، در ناقل بیانی pcambia1304 همسانه سازی شد. به منظور اطمینان از همسانه سازی ژن مذکور، سازه تهیه شده با استفاده از تکنیک های مختلف مانند colony pcr، pcr ، هضم آنزیمی، توالی یابی و همردیف سازی آن در بانک اطلاعاتی (genbank)، مورد تایید قرار گرفت. سپس سازه تهیه شده توسط روش ذوب و انجماد به باکتری آگروباکتریوم منتقل شد. جهت آلوده سازی گیاهان توتون، از ریزنمونه های برگی استفاده شد. ریزنمونه¬های تلقیح شده توسط آگروباکتریوم، به محیط های کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند. گیاهچه¬¬¬¬¬¬های باززایی شده بر روی محیط کشت انتخابی، جداسازی و به محیط کشت ریشه زایی انتقال یافتند. گیاهچه ها پس از ریشه دار شدن، ابتدا به گلدان حاوی پرلایت و در نهایت به خاک منتقل شدند. بررسی مولکولی pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی¬، بر روی dna ژنومی استخراج شده از گیاهان باززایی شده، تراریخت بودن آنها را تایید نمود. از گیاهان شاهد غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی pcr استفاده گردید.