همسانه سازی ناحیه رمز کننده افیبادی از استافیلوکوکوس اورئوس

چکیده: مولکول های افی بادی، داربست های پروتئینی کوچکی (حدود 7 کیلودالتون)می باشند، که از دومین b پروتئینa استافیلوکوکوس spa)) مشتق شده اند. این مولکول ها، پروتئین های مهندسی شده غیرایمنوژنیک با 58 آمینواسید و سه مارپیچ می باشند و مانند آنتی بادی ها ی مونوکلونال ، به تعداد زیادی از پروتئین ها و پپتیدهای هدف از جمله گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (her2) با تمایل پیوندی بالا متصل می شوند. امروزه این مولکول ها در پژوهش های بیوشیمیایی، کاربردهای تشخیصی و درمانی به ویژه در تشخیص سرطان کاربرد دارند. پس از بررسی آخرین مطالعات انجام گرفته و دسترسی به توالی قطعه dna همسانه سازی شده از سویه 1112 استافیلوکوکوس اورئوس الزام به طراحی و ایجاد تغییرات گوناگون مولکول افی بادی با 5 مارپیچ به منظور افزایش تمایل پیوندی به گیرنده her2 برای تصویربرداری از سطح سلول های سرطانی شد. پس از بررسی های بیوانفورماتیکی، برای سنتز به شرکت generay کره جنوبی ارسال گردید. در دو انتهای ژن مورد نظر دو جایگاه برشی ndei و xhoi قرار داده شد. جهت خارج سازی ژن، واکنش هضم آنزیمی با استفاده از دو آنزیم برشی فوق انجام شد. بعد از برش و آماده سازی ناقل (pet-26b) ، قطعه ژن مورد نظر توسط فرایند تخلیص از ژل آگارز طی یک واکنش اتصال با استفاده از آنزیم لیگاز به ناقل منتقل گردید. پس از خاتمه واکنش اتصال، تراریختی باکتریایی صورت گرفت. برای تراریختی باکتریایی، سلول های مستعد دریافت پلاسمید، تهیه گردید. برای تهیه این سلول ها، از محلول tss استفاده شده و وارد کردن پلاسمیدهای نوترکیب در سلول های باکتریایی و تکثیر آن در باکتری با استفاده از روش شوک حرارتی صورت گرفت. سپس سلول های تراریخته، کشت و کلون های حاصل مورد گزینش و غربالگری قرار گرفتند. از کلنی های حاصل اقدام به جداسازی پلاسمید به روش لیز قلیایی صورت گرفته و تأیید قطعات همسانه سازی شده با آنزیم های برشی، صورت گرفت. پس از مشاهده قطعه مورد نظر در ژل و تطبیق اندازه آن با نوار نشانگر وزنی مولکولی، جهت تأیید توالی نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر برای توالی یابی ارسال گردید. به منظور بررسی بیان پروتئین، ناقل حامل قطعه به باکتری e. coli سویه bl21 منتقل گردید. مقایسه کل پروتئین استخراج شده از باکتری های تراریخت و شاهد با استفاده از روش sds-page مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نهایی نشان داد که بیان افی بادی سنتزی در سیتوپلاسم ، تأثیر منفی بر رشد باکتری های تراریخته نمی گذارد.