مقایسه دو روش mpn-pcrو real-time pcr در شمارش باکتری لیستریا مونوسایتو ژنز در شیر

لیستریا مونوسایتوژنز یک پاتوژن غذایی مهم و عامل لیستریوزیس در انسان و حیوان است. از آنجاکه این باکتری می تواند شرایط سخت محیطی را تحمل نماید، به عنوان یک تهدید مهم در صنایع غذایی مطرح است. شیوع گاه به گاه لیستریوزیس به خصوص در اثر مصرف لبنیات در سال های اخیر سبب شده است که شناسایی و تشخیص آلودگی مواد غذایی به این باکتری مورد توجه قرار گیرد. در مطالعه حاضر دو روش mpn-pcr و real-time pcr با هدف کمیت سنجی باکتری لیستریا مونوسایتوژنز تلقیح شده به شیر استریل بررسی و با یکدیگر مقایسه شدند. به این منظور، تعداد cfu/ml 107 از باکتری لیستریا مونوسایتوژنز به همراه 8 گونه ی باکتریایی مختلف دیگر به شیر استریل تلقیح شدند. پس از آماده سازی رقت های متوالی از سوسپانسیون اولیه، از هر رقت در سه لوله حاوی محیط غنی کننده لیستریا تلقیح شد. پس از 48 ساعت گرمخانه گذاری، برای انجام آزمایشmpn-pcr ، لوله های کدر ازسه رقت متوالی حاوی cfu/ml 101، 100 و 1- 10 انتخاب و پس از استخراج dna، آزمون pcr با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن prfa لیستریا مونوسایتوژنز انجام گردید. برای انجام آزمون real-time pcr از سوسپانسیون اولیه باکتریایی تهیه شده در شیر، با غلظت cfu/ml 107 از هر 8 باکتری و لیستریا مونوسایتوژنز، dna ژنومیک، استخراج و از محصول استخراج، رقت های متوالی در بافر tris تهیه گردید. مجددا با استفاده از پرایمر های اختصاصی ژن prfa با روش evagreen real-time pcr بدون غنی سازی اولیه، توانایی این روش در شمارش تعداد باکتری ها در نمونه هایی که بطور دستی آلوده شده بودند، بررسی شد. کلیه آزمایشات با سه بار تکرار انجام شدند و میانگین تعداد شمارش شده توسط هر روش، به طور جداگانه محاسبه گردید. بر اساس یافته های مطالعه حاضر روش mpn-pcr در تعیین میزان آلودگی های پایین دقیق تر از روش real-time pcr می باشد ( به ترتیب cfu/ml 10 و cfu/ml 104). به نظر می رسد این ضعف آزمون real-time pcr به دلیل عدم کارایی %100 روش استخراج می باشد، که سبب شده است میزان dna copy بدست آمده از استخراج برابر با تعداد باکتری های موجود در نمونه نباشد. اما از آنجا که در روش mpn-pcr تعداد کپی های dna جهت تایید مثبت بودن نتیجه آزمایش اهمیت ندارد و تنها حضور و یا عدم حضور dna copy مورد نظر تعیین کننده است، مشکل ناشی از عدم استخراج 100 درصدی در مورد این آزمون مطرح نیست. با توجه به این موارد به نظر می رسد در بررسی آلودگی های باکتریایی مواد غذایی، همچون آلودگی های لیستریایی، که اغلب در شمار پایین نیز خطرساز هستند، mpn-pcr روشی کارآمد و قابل اعتماد باشد.