انتقال ژن های کیتیناز و مانیتول-1-فسفات دهیدروژناز (mtld) به چغندرقند و ارزیابی مقاومت لاین های تراریخته در مقابل بیمارگرهای قارچی

بیماری های قارچی شامل مرگ گیاهچه، پوسیدگی های ریشه و لکه برگی ها از عوامل عمده کاهش رشد و تولید چغندرقند در سراسر جهان به شمار می روند. بیان پروتئین های مرتبط با بیماری زایی نظیر کیتینازها، یکی از پاسخ های دفاعی گیاهان در مقابل بیمارگرها محسوب می گردد. آنزیم های کیتیناز از طریق تجزیه دیواره های سلولی قارچ ها در افزایش مقاومت گیاهان در مقابل دامنه وسیعی از بیمارگرهای قارچی نقش قابل توجهی دارند. مانیتول-1-فسفات دهیدروژناز (mtld) که توسط ژن mtld رمز می گردد، یک آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز مانیتول در گیاهان است. مانیتول از طریق پاک سازی گونه های واکنش پذیر اکسیژن (ros)، در پاسخ گیاهان به تهاجم بیمارگرها نقش موثری دارد. بر این اساس، دست ورزی ژنتیکی گیاهان با ژن های کیتیناز و mtld از راه کارهای مناسب به منظور افزایش مقاومت گیاهان در مقابل بیماری های قارچی محسوب می شود. این تحقیق با هدف تولید چغندرقند تراریخته از طریق انتقال ژن های کیتیناز لوبیا (chi) و mtld به چغندرقند صورت گرفت. دو رقم دیپلوئید چغندرقند، شامل sbsi-02 و sbsi-04، جهت دست ورزی ژنتیکی به کمک سویه agrobacterium tumefaciens lba4404 حامل ناقل ژنتیکی نوترکیب pbi121-bch دارای ژن chi تحت کنترل راه انداز camv 35s، و نیز سویه a. tumefaciens gv3101 حامل ناقل ژنتیکی نوترکیب pbird-mtd دارای ژن mtld تحت کنترل راه انداز rd29a آرابیدوپسیس، القایی با تنش غیرزیستی، به کار برده شدند و در مورد هر دو دستواره ژنتیکی از ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (nptii) به عنوان ژن گزینش گر گیاهی استفاده شد. به منظور انتقال ژن، از ریزنمونه های برگی جوانه دار که از قابلیت باززایی بالایی برخوردارند، استفاده شد. جوانه های سبز در محیط کشت msb حاوی غلظت های مختلف کانامایسین با موفقیت غربال شدند. واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr)، حضور تراژن های chi و mtld را در اغلب گیاهچه های چغندرقند مقاوم به کانامایسین تأیید نمود. آنالیز لکه گذاری نقطه ای (dot blot)، درج تراژن chi را در ژنوم لاین های تراریخته اولیه (t0) تأیید نمود. از طریق انجام آنالیز دورگه سازی سادرن، تعداد نسخه های درج شده از تراژن های chi و mtld و درج کامل کاست های ژنی مورد نظر در ژنوم لاین های تراریخته چغندرقند تأیید شد. آنالیز رونوشت برداری معکوس-واکنش زنجیره ای پلیمراز (rt-pcr)، حضور رونوشت تراژن های chi و mtld را در لاین های تراریخته نشان داد. آنالیز لکه گذاری وسترن، حضور پروتئین کیتیناز لوبیا با اندازه پیش بینی شده 31 کیلودالتون را در لاین های تراریخته آشکار نمود. آزمون نشت در ژل آگار، عملکرد بازدارندگی عصاره پروتئینی استخراج شده از برگ لاین های تراریخته با بیان پروتئین کیتیناز را بر رشد میسلیومی rhizoctonia solani ag-4 در شرایط in vitro مشخص نمود. ارزیابی مقاومت لاین های تراریخته t0 دارای ژن های chi و mtld در مقابل قارچ های بیمارگر برگی cercospora beticola و alternaria alternata و همچنین بیمارگر خاک زاد r. solani ag-2-2 مورد بررسی قرار گرفت. زیست سنجی با c. beticola در سطح گیاه کامل، افزایش سطح مقاومت لاین های تراریخته دارای ژن های chi و mtld، شامل تأخیر در ظهور علائم بیماری و کاهش متوسط قطر لکه های برگی را در مقایسه با گیاهان تیپ وحشی نشان داد. نتایج حاصل از آزمون زیست سنجی با استفاده از قطعات جدا شده برگ و نیز گیاه کامل نشان داد که لاین های تراریخته chi، و نیز لاین های تراریخته mtld که به مدت 10 روز در معرض دمای c° 5 قرار داده شده بودند، مقاومت افزایش یافته ای را به a. alternata دارا می باشند؛ هرچند که لاین های تراریخته mtld که در شرایط بدون تنش نگهداری شده بودند خسارت کمتری را در مقایسه با گیاهان تیپ وحشی، همراه با تأخیر چهار تا پنج روزه در ظهور علائم آلودگی قارچی نشان دادند. زیست سنجی با استفاده از برگ های جدا شده آشکار نمود که ژن های chi و mtld حفاظت قابل توجهی را برای لاین های تراریخته مورد بررسی در برابر r. solani ag-2-2 فراهم نموده اند. لاین های چغندرقند تراریخته و گیاهان تیپ وحشی از نظر میزان مقاومت به بیمارگرهای قارچی مورد بررسی دارای تفاوت معنی دار (01/0 ? p) بودند.