جهش زایی در آمینواسید 428 (e428k/q) آنزیم لوسیفراز به روش هدفمند و بررسی میزان فعالیت آنزیم و پایداری آن

واکنش آنزیمی بیولومینسانس با دخالت آنزیم لوسیفراز توسط کاتالیز اکسیداسیون لوسیفرین (lh2) در حضور atp و mg2+ و مولکول اکسیژن رخ داده و منجر به نشر نور می شود. لوسیفراز به-طور گسترده ای به عنوان گزارشگر مورد استفاده قرار می گیرد زیرا دارای حساسیت بالا و گستره فعالیت خطی است. نیاز روزافزون به آنزیم های سازگار از نظر اقتصادی و صنعتی در زیست شناسی، بیوتکنولوژی و پزشکی توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کرده است. روش های متعددی برای افزایش پایداری حرارتی پروتئین به کار می رود. در این مطالعه، روش جهش زائی هدفمند به عنوان یک روش منطقی برای جایگزینی گلوتامیک اسید 428 به گلوتامین و لیزین انتخاب شده است. مطالعات دینامیک مولکولی انجام گرفته روی لوسیفراز گونه photinus pyralis نشان داده است که چگالی زیاد بار منفی در این موقعیت آن را انعطاف پذیر کرده است. بنابراین انعطاف پذیری آنزیم از طریق جایگزینی با اسید آمینه های هم اندازه اما با بار متفاوتی چون لیزین (بار مثبت) و گلوتامین (قطبی بدون بار) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادند که جایگزینی لیزین باعث کاهش فعالیت، فعالیت ویژه و پایداری حرارتی شده در حالی که جایگزینی گلوتامین رفتاری مشابه با پروتئین نوع وحشی دارد. مطالعات سینتیکی نشان داد که میزان km برای atp برای هر دو جهش یافته نسبت به نوع وحشی افزایش یافته، که نشان دهنده کاهش تمایل آنزیم به atp می-باشد، در حالی که میزان تمایل آنزیم به لوسیفرین در جهش یافته e428q افزایش یافته ولی در جهش یافته e428k تغییر محسوسی ندارد. بررسی های ساختاری، فشردگی ساختار آنزیم لوسیفراز در مورد جهش یافته e428k را تایید می کند که منجر به کاهش ساختار منظم در پروتئین می شود. در مورد جهش یافته e428q این تغییرات ساختاری موضعی بوده و منجر به باز شدن ساختار آنزیم شده است.