ساخت سازه ی کلروپلاستی حاوی ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tpa) و بررسی بیان آن در کلروپلاست گیاه کاهو (.lactuca sativa l)

چکیده به تولید پروتئین های دارویی و صنعتی ارزشمند در گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک، کشاورزی مولکولی اطلاق می شود. از مزایای انتقال ژن به ژنوم کلروپلاست در مقایسه با ژنوم هسته می توان به سطح بالای بیان، امکان بیان چند ژن در یک اپرون پلی سیسترونی، نبود اثرات خاموشی ژن و احتمال بسیار اندک انتقال افقی ژن از طریق دانه گرده اشاره نمود. سالانه میلیون ها نفر در دنیا از عوارض ناشی از بیماری های قلبی و عروقی رنج می برند. یکی از مهم ترین داروهای حذف کننده لخته برای درمان این نوع از بیماری ها، پروتئین فعال کننده ی پلاسمینوژن بافتی (tpa) است. این آنزیم پروتئازی با تبدیل پلاسمینوژن به فرم فعال پلاسمین، موجب تجزیه رشته های فیبرین لخته می گردد. فرم کوتاه شده فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (k2s) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی تر نسبت به tpa است. در تحقیق حاضر، ناقل کلروپلاستی مناسبی به کمک بررسی های بیوانفورماتیکی و با در نظر گرفتن توالی های مورد نظر مانند نواحی احاطه کننده ی اختصاصی گیاه کاهو و عناصر افزایش دهنده بیان در سطوح رونویسی و ترجمه، طراحی گردید. ناقل کلروپلاستی حاوی ژن ترکیبی plygbs::k2s، پس از همسانه سازی، از نظر ساختاری و عملکردی با استفاده از روش های مولکولی مورد تأیید قرار گرفت. به منظور انتقال ژن به کلروپلاست گیاه کاهو، سیستم کشت بافت و باززایی مستقیم نوساقه ها از سلول های تراریخت بهینه سازی شد. ناقل کلروپلاستی (pbl102) با استفاده از روش بمباران ذره ای به ریزنمونه های برگی منتقل گردید و ریزنمونه ها روی محیط گزینشگر حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین (یا استرپتومایسین) قرار گرفتند. پس از چند مرحله واکشت و باززایی، گیاهچه های تراریخت کلروپلاستی به صورت مستقیم از ریزنمونه ها باززایی شدند. نتایج ارزیابی گیاهان تراریخت کلروپلاستی در سطح dna نشان داد که ژن های انتقالی در جایگاه صحیح در ژنوم کلروپلاستی درج شده اند. همچنین، رونویسی از ژن plygbs::k2s به روش rt-pcr اثبات شد. بررسی بیان پروتئین به وسیله آزمون های sds-page، elisa، لکه گذاری نقطه ای و وسترن، تولید پروتئین نوترکیب plygbs-k2s را در کلروپلاست گیاهان کاهو تأیید نمود. کلمات کلیدی: مهندسی ژنوم پلاستیدی، ناقل کلروپلاستی، کشاورزی مولکولی، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی، گیاه کاهو