آنالیز بیان ژن همولوگ cps1 در آسپرژیلوس فومیگاتوس و بررسی اثر حذف آن بر رشد قارچ

بررسی بیان ژن cps1در فاز های مختلف رشد : پس ازشمارش تعداد مشخصی از سلول های آسپرژیلوس فومیگاتوس این قارچ درزمان های 6 ساعته،8 ساعته و 24 ساعت ، کشت داده می شود, از نظر میزان بیان ژن مورد نظر در زمان های مختلف بررسی می شود.استخراج rna از آسپرژیلوس فومیگاتوس و ساختن cdna و rt-pcrدر هر یک از ساعت های مذکور جز مراحل کار در نظر گرفته شده است. 2. تکثیر ژن cps1 از قارچ a.fumigatus: ابتدا توالی cps1مربوط به قارچ a.fumigatusاز پایگاه های اطلاعاتی موجود بدست می آید و با توجه به این توالی پرایمر ها طراحی شده و با روش pcrتوالی ژن به انضمام 1 کیلو بازمربوط به ناحیه فرادست و فرودست آن تکثیر می شود همچنین باید جایگاه برش اختصاصی برای آنزیم های محدودالاثر (restriction enzyme) مورد نظر در انتهای 5’و3’توالی ژنی مورد نظر در هنگام طراحی پرایمر در نظر گرفته شود 3. همسانه سازی ژن در یک کلونینگ وکتور مناسب : محصولات حاصل از pcr را تخلیص کرده و سپس داخل یک کلونینگ وکتور مناسب وارد می کنیم کلون های مثبت که حاصل واکنش ligation هستند شناسایی می شوند و سپس توسط آنزیم های محدودالاثر تائید می شود . 4. ساب کلونینگ قطعات مورد نظر در وکتور بیانی:pgem-t easy حال با استفاده از قطعه بزرگی که در مرحله 3 همسانه سازی شده است، چندین pcr انجام شده تا حدودا 1 کیلو باز از نواحی 5’&3’ flankingژن cps1تکثیر شده و در کنار یکدیگر در وکتور pgem همسانه سازی شوند. در مرحله آخریک مارکر آنتی بیوتیکی یا آکسوتروفی در بین این دوقطعه کلون می گردد و سازه نهائی تهیه می شود