شناسایی و جداسازی ژن های پاسخ دهنده به تنش شوری در گیاه اسطوخودوس با روش cdna-aflp

چکیده در سال¬های اخیر اهمیت استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده¬های حاصل از آن، نقش این گیاهان را در چرخه اقتصاد جهانی بسیار مشخص تر کرده است. گیاه دارویی اسطوخودوس فرانسوی از خانواده نعناع می باشد و کاربردهای فراوانی در جنبه های مختلف صنعت برای آن برشمرده اند. ترکیبات فراری که در ماده مؤثره اسطوخودوس بیشترین اهمیت را دارند به میزان زیادی از محیطی که گیاه در آن توسعه یافته تأثیر می پذیرند. تکنیک cdna-aflp برای شناسایی برخی از ژن های افتراقی پاسخ دهنده به تنش شوری در گیاه اسطوخودوس به کار گرفته شد. گیاه اسطوخودوس در بستر پرلیت کوکوپیت (2:1) در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار کشت گردید. تیمار شوری با غلظت های صفر، 25 و 50 میلی مولار از nacl اعمال شد. نمونه برداری از برگ و گل برای استخراج rna با روش بیوزول صورت گرفت. خالص سازی mrna از rnaکل با استفاده از کیتmrna capture انجام شد. رشته اول cdna از روی mrna توسط آنزیم رونوشت بردار معکوس ساخته شد و سنتز رشته دوم cdna با استفاده از آنزیم dna پلیمراز از روی رشته اول cdna تکمیل گردید. آنزیم هایpsti وtaqi جهت هضم آنزیمی cdna دو¬رشته ای استفاده شد. بعد از تکثیر با آغازگر¬های عمومی، cdna¬ها با آغازگرهای اختصاصی تکثیر شدند. با استفاده از 23 ترکیب آغازگری، 43 باند افتراقی از الکتروفورز عمودی با ژل پلی¬اکریل¬آمید 5 درصد جداسازی شد. بعد از تکثیر مجدد باندها با آغازگرهای اختصاصی خود و بارگذاری روی ژل آگارز، tdf 15 برای همسانه سازی تائید شد. بعد از انجام همسانه¬سازی در باکتری e.coli با استفاده از کیت کلون جت و توالی یابی آنها، ژن ها با نرم افزار blastxمورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. ژن هایی که درنتیجه این تحقیق شناسایی شدند در گروه های ژنی مربوط به تنش شوری مثل اکسیدوردوکتاز، انتقال سیگنال مانند کالمودولین، سرین/ ترئونین کیناز و پروتئین های غشایی، حمل¬و نقل همچون سدیم:پروتون آنتی پورتر و منیزیم ترانسپورتر، ایجاد مکانیسم دفاعی از جمله سیتوکروم p450 و پکتین استراز، دفع سموم آلدئیدی مانند ایزوبوتیرات دهیدروژناز، کنترل کیفیت پروتئین¬ها مثل چاپرون clpb و پروتئین مرتبط با یوبی کوئیتین و انتقال سیگنال¬های هورمونی مانند gamyb و استروئیدهای گیاهی طبقه بندی شدند که بسیاری از ژن¬های مربوطه نقش مستقیم در تحمل به شوری دارند. کلمات کلیدی: اسطوخودوس، تنش شوری، بیان افتراقی، cdna-aflp