بررسی اثر دستکاری شیمیایی باقیمانده های لیزین بر پایداری حرارتی، ساختار و عملکرد پراکسیداز تربچه

در این تحقیق، دستکاری شیمیایی آنزیم پراکسیداز تربچه با گروه های انیدرید به منظور پایدارسازی آن انجام شد، گروههای انیدرید در ph قلیایی به زنجیره جانبی اسیدهای آمینه لیزین متصل می شوند. تعداد باقیمانده های لیزین آنزیم hrp، ? عدد است، لیزین های شماره 65، 84، 149، 174، 232 و 241 که سطح در دسترس هر یک از آنها به ترتیب 17/0، 02/0، 25/0، 33/0، 42/0 و 22/0 می باشد؛ از این ? تا باقیمانده، ? تا در سطح آنزیم مستقر می باشند، این لیزین های موجود در سطح بیشتر از لیزین های درونی در معرض دستکاری قرار دارند [1]. نتایج به دست آمده نشان می دهد که مادیفایر ?و?- دی کلرومالئیک انیدرید، حدود ? باقیمانده لیزین و ?و?- دی متیل مالئیک انیدرید حدود 5/2 باقیمانده لیزین را در هر مولکول آنزیم hrp مادیفای می کند. حدس زده می شود که این سه اسیدآمینه مادیفای شده همان اسیدآمینه های موجود در سطح یعنی اسید آمینه های 174، 232 و 241 باشند. همانطور که اشاره شد دستکاری شیمیایی این آنزیم با دو نوع انیدرید انجام شد که دستکاری با ?و?- دی کلرومالئیک انیدرید باعث می شود بار مثبت زنجیره جانبی باقیمانده های لیزین با بارهای منفی گروههای کلر این مادیفایر جایگزین شود؛ در نتیجه این تغییر بار، در داخل این ماکرومولکول دافعه الکتروستاتیک ایجاد می شود و از طرف دیگر سطح آنزیم آبدوست تر می شود؛ گروه های آبدوست در سطح پروتئین مانند لنگر عمل کرده و باعث می شوند که ماکرومولکول با مولکول های آب محیط، پیوند هیدروژنی بیشتری برقرار کند که نتیجه آن کاهش تماس گروه های آبگریز مجاور با حلال می باشد؛ همچنین در اثر دستکاری شیمیایی با این مادیفایر ظرفیت ایجاد پیوند هیدروژنی بین آنزیم و مولکول های آب حلال افزیش می یابد که این عامل همسو با افزایش آبدوستی سطح می تواند باعث افزایش پایداری آنزیم گردد. در این صورت است که پایداری حرارتی آنزیم در دماهای مختلف بویژه در محدوده دمایی c? (65-??) افزایش می یابد. دستکاری شیمیایی با ?و?- دی متیل مالئیک انیدرید و اتصال این مادیفایر به آنزیم hrp باعث آبگریز شدن سطح پروتئین می شود، این تغییر خروج گروه های آبگریز پروتئین و آمدن آنها به سطح را آسان می کند، در نتیجه تعداد پیوندهای هیدروژنی مابین آنزیم و محیط کاهش می یابد که نتیجه نهایی، تغییر نکردن میزان پایداری و حتی در بعضی موارد کاهش پایداری این نوع آنزیم دستکاری شده در حرارت های بالا و سایر شرایط نامطلوب می باشد. شکل 4-1: 2و3- دی کلرومالئیک انیدرید )راست( و 2و3- دی متیل مالئیک انیدرید )چپ(. همانطور که اشاره شد علاوه بر پایداری حرارتی، پایداری آنزیم در شرایط دیگر نیز بررسی شد. حلال های آلی باعث کاهش قطبیت محیط و افزایش دافعه یونی می گردند، در نتیجه حلالیت اسیدهای آمینه آبگریز را افزایش داده و پروتئین را واسرشته می کنند؛ دستکاری شیمیایی بعنوان یکی از روش های پایدارسازی، جهت افزایش پایداری پروتئین ها به ویژه آنزیم ها در محیط های آلی و به تبع آن افزایش کارآیی آنها انجام می گیرد. در آزمایشی که برای بررسی اثر دستکاری شیمیایی با ?و?- دی کلرومالئیک انیدرید و ?و?- دی متیل مالئیک انیدرید بر پایداری hrp داخل حلال آلی دی متیل سولفوکساید (dmso) انجام شد، مشخص شد که میزان پایداری انواع طبیعی و دستکاری شده این آنزیم داخل این حلال آلی تفاوت محسوسی نداشت. همچنین نتایج بدست آمده نشان می دهد که دستکاری آنزیم hrp با ?و?- دی کلرومالئیک انیدرید و ?و?- دی متیل مالئیک انیدرید باعث افزایش پایداری این آنزیم در حضور غلظت های مختلف اوره در مقایسه با نوع طبیعی می شود. علاوه بر پایداری در حلال آلی و دناتورانت شیمیایی پایداری آنزیم در شرایط استرس اکسیداتیو نیز بررسی شد؛ با افزایش غلظت h 2o2 به میزان های بالاتر از 00085/0، فعالیت هر سه نوع آنزیم تقریباً با یک شیب یکسان کاهش می یابد؛ علت این کاهش، اثر انتحاری پراکسیدهیدروژن است که افزایش غلظت آن تغییر شیمیایی آنزیم و متعاقباً غیرفعال شدن آن را به همراه دارد. این نتیجه نشان می دهد که هر سه نوع طبیعی و دستکاری شده آنزیم hrp به میزان برابر در مقابل فشار اکسیداتیو غلظت های بالای سوبسترا غیرفعال می شوند. علاوه بر موارد ذکرشده، نتایج بدست آمده از بررسی پایداری انواع طبیعی و دستکاری شده آنزیم hrp در محیط هایی با phهای مختلف نشان داد که پایداری هر سه نوع این آنزیم در ? =ph بیشتر از سایرph هاست و شیب کاهش پایداری هر سه نوع این آنزیم در phهای ?، ?، ?? و ?? برابر می باشد. در نهایت گفته می شود که دستکاری شیمیایی، پایداری آنزیم hrp را در phهای مختلف افزایش نمی دهد. مرکز کاتالیتیک آنزیم hrp، گروه هم است که در مجاورت آن آمینواسیدهای هیستیدین 170(پروکسیمال)، هیستیدین42(دیستال)، آرژنین38، فنیل آلانین41 و آسپارتات247 قرار گرفته است؛ با توجه به این که در دستکاری فقط آمینواسیدهای لیزین موجود در سطح تغییر کرده اند، بنابراین پس از دستکاری آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال، تغییری نیافته اند. نتیجه نهایی که از این تحقیق گرفته می شود این است که دستکاری شیمیایی آنزیم hrp با مادیفایر ?و?- دی کلرومالئیک انیدرید باعث افزایش پایداری حرارتی این آنزیم و پایداری آن در برابر دناتورانت شیمیایی می شود اما بر پایداری آن در شرایط استرس اکسیداتیو، حلال آلی و phهای مختلف اثر ندارد و دستکاری شیمیایی با ?و?- دی متیل مالئیک انیدرید باعث افزایش پایداری در برابر دناتورانت شیمیایی می شود اما در پایداری حرارتی این آنزیم و پایداری آن در استرس اکسیداتیو، حلال آلی و phهای مختلف تأثیری ندارد. مهمترین نتایج حاصله را می توان در موارد زیر خلاصه کرد: 1- در بیشتر موارد هیدروفیل کردن سطح پروتئین اصولاً می تواند باعث پایداری آن شود. 2- هیدروفوب کردن سطح پروتئین پایداری آن را کاهش می دهد. 3- راهکاری که باعث افزایش پایداری پروتئین در شرایط واسرشتگی خاص می شود، لزوماً در شرایط واسرشته کننده دیگر موثر نیست. 4- دستکاری شیمیایی آنزیم hrp با هر دو مادیفایرهای 2و?-دی کلرومالئیک انیدرید و 2و?-دی متیل مالئیک انیدرید با هزینه اندک و روشی نسبتاً ساده و بدون تغییر عملکرد آنزیم، می تواند پایداری آنرا در شرایط خاصی افزایش داده و به تبع آن کارایی آنرا بالا ببرد.