شناسایی و رده بندی عوامل فایتوپلاسمایی سیب زمینی در ایران با استفاده از روش های مولکولی

فایتوپلاسماها یکی از عوامل مهم بیماری های گیاهان بوده و سالانه خسارات فراوانی به محصولات کشاورزی در سراسر جهان وارد می کنند. در سال های اخیر، علایم مشابه با بیماری های فایتوپلاسمایی در جوانه غده های بذری و بوته های سیب زمینی مناطقی از استان های اصفهان، تهران، کرمانشاه، همدان، آذربایجان شرقی و چهارمحال و بختیاری مشاهده شد. بوته های سیب زمینی آلوده علایم ریزبرگی، پیچیدگی برگ، زردی و ارغوانی شدن حاشیه برگچه ها، تشکیل غده های هوایی و پلاسیدگی غده ها را دارا بودند که با علایم بیماری فایتوپلاسمای سر ارغوانی سیب زمینی شباهت داشت. علایم بیماری در غده ها شامل ایجاد جوانه هایی نازک و مویی شکل و تولید غده های ثانویه به جای جوانه بودند غده ها پس از کشت گلخانه ای، علایم بیماری سر ارغوانی را نشان دادند و در یک نمونه علایم بیماری جاروی جادوگر شامل پرپشت شدن بوته و تغییر شکل برگ ها مشاهده شد. برای تشخیص فایتوپلاسمایی بودن در این نمونه ها، ابتدا از جوانه غده ها و رگبرگ بوته های آلوده استخراج dna صورت گرفت و سپس از واکنش های زنجیره ای pcr و nested-pcr برای تکثیر فایتوپلاسمایی استفاده شد. در ردیابی فایتوپلاسما در این نمونه ها طی pcr دور اول توسط جفت آغازگرهای p1/p7 و p1/tint، در دو نمونه قطعه 1784 نوکلیوتیدی تکثیر شد و بقیه نمونه ها باندی تولید نکردند، ولی استفاده از جفت آغازگرr16f2n/r2 در nested-pcr بعد از pcr اول با جفت آغازگرهای p1/p7 و p1/tint منجر به تکثیر یک قطعهbp 1239 در تعداد زیادی از این نمونه ها شد. همچنین جفت آغازگر fu5/ru3 نیز یک قطعه bp876 از dna حاصل از pcr دور اول با p1/p7 و p1/tint تکثیر نمود. ردیابی توالی فایتوپلاسمایی از سیب زمینی های دارای علایم بیماری های جاروی جادوگر و سر ارغوانی سیب زمینی و عدم تکثیر قطعات dna فایتوپلاسمایی در گیاه سالم نشان داد که عوامل فایتوپلاسمایی در ایجاد این بیماری ها در مزارع سیب زمینی مورد بررسی نقش دارند. برای شناسایی جدایه های بیمارگر سیب زمینی جمع آوری شده، از آزمون pcr-rflp استفاده شد. به این منظور یک قطعه bp1239 نوکلیوتیدی از ناحیه داخلی ژن 16sr rna فایتوپلاسمایی به کمک جفت آغازگر p1/p7 در pcr دور اول و r16f2n/r16r2 در دور دوم تکثیر شد و سپس این قطعه توسط آنزیم های محدودگر alui، ecori، cfoi، hindiii، kpni، msei، rsai و taqi برش داده شدند. نتایج pcr-rflp نشان داد که جدایه های مختلفی در ایجاد بیماری فایتوپلاسمایی سر ارغوانی سیب زمینی نقش دارند. بر اساس این آزمون, چهار الگوی باندی مختلف از فایتوپلاسماهای سیب زمینی به دست آمد که تعدادی از آنها به عنوان نماینده برای تعیین توالی نوکلیوتیدی انتخاب گردیدند. مقایسه توالی های نوکلیوتیدی این جدایه ها با توالی های موجود در بانک ژن نشان داد که توالی جدایه های مورد مطالعه به میزان 98-99% با توالی فایتوپلاسماهای ثبت شده در بانک ژن جهانی(ncbi) مشابهت دارند. بررسی توالی های به دست آمده مشخص نمود که علایم جاروی جادوگر سیب زمینی در گلخانه توسط گونه candidatus phytoplasma trifolii ایجاد گردیده است و گونه های ca. phytoplasma trifolii، ca. phytoplasma astrisو ca. phytoplasma solani عوامل فایتوپلاسمایی بروز بیماری سر ارغوانی سیب زمینی در مزارع ایران می باشند. دو گونه ca. phytoplasma trifolii و ca. phytoplasma astris که در دنیا به عنوان مهمترین عوامل فایتوپلاسمایی سیب زمینی شناخته شده اند، پراکندگی محدودی در مزارع ایران داشتند. به نظر می رسد، با توجه به خسارت و پراکنش وسیع جغرافیایی ca. phytoplasma solani در مزارع سیب زمینی، بتوان آن را به عنوان مهمترین عامل فایتوپلاسمایی سیب زمینی کاری های ایران معرفی کرد که تاکنون خسارت جدی از این گونه فایتوپلاسمایی در مناطق سیب زمینی کاری دنیا گزارش نشده است. نتایج مطالعات نشان داد، هر سه جدایه ca. phytoplasma trifolii، ca. phytoplasma astris و ca. phytoplasma solani قادرند از طریق غده های بذری انتقال یابند بنابراین استفاده از بذور گواهی شده در کاهش آلودگی موثر است.