تهیه سویه نوترکیب مخمر حاوی ژن لاکاز

قابلیت بالای آنزیم های لاکاز قارچی در اکسیداسیون طیف وسیعی از ترکیبات آروماتیک فنلی و غیر فنلی، لیگنین، برخی ترکیبات غیر آلی و غیره باعث توجه ویژه ای در بکارگیری این آنزیم ها در مصارف صنعتی مختلف از جمله صنایع خمیر و کاغذ سازی، منسوجات، صنایع غذایی، تیمار فاضلاب ها، پسماند های کشاورزی و صنعتی، زیست پالایی و... شده است. جهت بکارگیری این آنزیم ها به منظور استفاده تجاری، تولید مقادیر انبوه آنزیم با هزینه کم، ضروری است امروزه عدم دست یابی به این هدف عمدتا بدلیل تولید پایین آنزیم از منابع طبیعی تولیدکننده آن، تبدیل به یکی از محدودیت های بهره مندی از این آنزیم ها شده است. روش هایی جهت حل این مشکل، ارائه شده که از جمله می توان بیان نو ترکیب لاکاز از طریق میزبان های یوکاریوتی را نام برد. در این تحقیق cdna آنزیم لاکاز lap2 قارچ trametes pubescens بعد از بهینه سازی، توسط شرکت سازنده biomatik سنتز شد. پارامتر هایی که در این تحقیق بهینه شدند، عمدتا شامل همخوانی کدون قارچ و مخمر ((codon usage ،محتوایg و c، محتوای p-g-c، ساختار ثانویه mrna و غیره می باشند. ژن تهیه شده با استفاده از پرایمر-های طراحی شده، تکثیر یافت. پس از هضم ژن و وکتور پلاسمیدی ppicza? توسط آنزیم های محدود الاثر ecori وxbai عمل الحاق ژن هدف به وکتور توسط آنزیم dnaلیگاز t4 صورت گرفت. سازه نوترکیب حاصل، با انتقال به باکتری e.coli سویه dh?? تکثیر یافت. رشد ارگانیسم در محیط lba حاوی آنتی بیوتیک زئوسین، حضور و تکثیر این سازه را در ارگانیسم تایید نمود. تایید نهایی سازه حاوی ژن، با colonypcr، استخراج پلاسمید از باکتری های تراریخت، هضم آنزیمی سازه و تعیین توالی اثبات شد. در مرحله بعد، جهت بیان ژن هدف در مخمر، ابتدا وکتور حاوی ژن از باکتری dh??استخراج شد، سپس حامل با آنزیم saci خطی شده و با روش الکتروپوریشن به مخمر pichia pastoris سویه km71 انتقال یافت. ورود سازه حاوی ژن به کروموزوم مخمر با استخراج ژنوم مخمر و pcr (با استفاده از پرایمر های aox) تایید شد. سرانجام مخمر نو ترکیب در محیط bmmy تحت القاء متانول که سبب بیان و تولید آنزیم می شود، قرار گرفت. حضور آنزیم در محیط با تکنیک بلات نقطه ای نشان داده شد. نتایج توالی یابی ژن و بررسی آن با نرم افزار vector ntiو clcbio صحت عدم تغییر توالی اسیدهای آمینه این پروتئین نوترکیب را نشان داد.