بهینه سازی تولید تانناز میکروبی از ریز اندامگان جهش یافته جداسازی شده از ضایعات کشاورزی

تانناز یا تانن آسیل هیدرولاز (e.c.3.1.1.20) آنزیمی القایی است که بوسیله واریته هایی از ریز اندامگان تولید می شود. این آنزیم واکنش شکستن تانن های قابل آبکافت و استر های گالیک اسید را کاتالیز می کند. این آنزیم در بازیافت توده های زیستی گیاهی، تصفیه فاضلاب دباغی ها و همچنین در تولید گالیک اسید بسیار مهم بوده و در ساخت چای فوری، و برخی از نوشیدنی ها استفاده می شود. با توجه به کاربرد روزافزون تانناز در صنعت، هدف از انجام این رساله جداسازی قارچ جدید تولید کننده تانناز از برگ های کپک زده چای و بهبود میزان تولید آن به کمک جهش و بهینه سازی محیط و شرایط کشت بوده است. بر این اساس این رساله در سه مرحله انجام شد. در ابتدا، شانزده قارچ مهم تولید کننده تانناز با استفاده از روش محیط کشت آگار ساده از برگ های کپک زده چای جدا سازی شد و سپس غربال گری ریز اندامگان تولید کننده تانناز با استفاده از روش محیط کشت غنی شده در آگار czapek dox’s اصلاح شده انجام شد. تانناز تولید شده توسط قارچ بومی جدا شده از برگ های کپک زده چای، penicillium sp. ez-zh190، به طور جزئی خالص سازی و ویژگی های آن بررسی شد. حداکثر تولید آنزیم (u/ml 33/4) توسط این ریز اندامگان پس از 96 ساعت تخمیر غوطه وری (چرخش rpm 100) در °c 30 به کمک اسید تانیک (w/v 1%) به عنوان تنها منبع کربن به ثبت رسید. این آنزیم به ترتیب دارای دما و ph بهینه °c 35 و 5/5 بود و حدود 50% حداکثر فعالیت خود را در °c 50 و بیش از 50% پایداری را پس از 24 ساعت در غلظت نمک طعام 1 مولار از خود نشان داد. در مرحله دوم، به منظور یافتن بهترین تولید کننده تانناز، penicillium sp. ez-zh190 در معرض جهش بوسیله تیمار حرارتی قرار گرفت و سویه ez-zh290 جدا گردید. حداکثر تولید تانناز در این سویه جهش یافته پس از 84 ساعت گرمخانه گذاری به میزان u/ml 32/4 به ثبت رسید و تانناز حاصل از آن دارای دما و ph بهینه °c 40 و 5/5 بوده است. سپس اسپور های حاصل از penicillium sp. ez-zh290 تحت جهش بوسیله پرتو گاما در مقادیر 200 تا 400 گری قرار گرفت و سویه ez-zh390 جدا سازی شد. سویه ez-zh390 آنزیم تانناز بیشتر (u/ml 66/7) از سویه مادری خود، ez-zh290، تولید کرد. همچنین مشخص شد که تانناز حاصل از penicillium sp. ez-zh390 دارای دمای بهینه °c 35 و منحنی ph گسترده با ph بهینه 5/5 بود.جهت تایید پایداری جهش یافته حداکثر میزان تولید آنزیم و ویژگی های آنزیم تولید شده در پنج نسل پیاپی با یکدیگر مقایسه شد. در انتهای رساله نیز تولید تانناز بوسیله سویه جهش یافته penicillium sp. ez-zh390 به روش غوطه وری و با استفاده از دو روش آماری بهینه سازی گردید. در ابتدا برای بهینه سازی منبع نیتروژن و کربنی محیط کشت جهت تولید حداکثر آنزیم، از طرح آماری یک عامل در یک زمان استفاده شد. بهینه سازی منبع کربن سبب تولید u/ml 74/10 تانناز پس از 72 ساعت تخمیر در حضور 14% پودر برگ تمشک گردید. همچنین یک افزایش دو برابری در تولید تانناز نیز پس از بهینه سازی منبع نیتروژن به ثبت رسید (در حضور 2/1% آمونیوم نیترات). سپس متغیر های شرایط کشت به روش آماری سطح پاسخ (rsm) و با طرح مرکب مرکزی بهینه سازی گردید. نتایج نشان داد که افزایش دما تا نزدیک °c 30 و سرعت چرخش محیط کشت تا حدود rpm 90 سبب افزایش تولید تانناز به حداکثر مقدار خود شده و افزایش بیشتر در این دو متغیر سبب کاهش تولید آنزیم می شود. در شرایط بهینه، تولید تانناز به u/ml 67/21 افزایش یافت و بهره وری تولید نیز به 84/2 برابر (u/ml.h 3/0) بیش از حداکثر بهره وری پیش از بهینه سازی رسید. این رساله نشان داد که penicillium sp. ez-zh390 در شرایط بهینه یک سویه عالی برای تولید کارآمد آنزیم تانناز می باشد.