افزایش بیان پروتئین نوترکیب rop1 توکسوپلاسما گوندی در e.coli از طریق بیان پروتئین کوتاه شده(truncated )

توکسوپلاسموز یک بیماری مشترک بین انسان و دام است که توسط انگل اجباری درون سلولی، توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً عوارض خفیفی ایجاد می کند. ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. همچنین در افراد دارای نقص سیستم ایمنی مانند مبتلایان به ایدز و افراد دریافت کننده پیوند اعضاء، ابتلا به عفونت اولیه یا عود آن می تواند عوارضی چون آنسفالیت کشنده توکسوپلاسمایی ایجاد کند. بنابراین پیشگیری یا تشخیص صحیح و به موقع عفونت برای اقدامات درمانی اهمیت می یابد و می تواند از تعداد و شدت موارد عفونت بکاهد. تشخیص توکسوپلاسموز معمولاً به روش های سرولوژیک به ویژه تست الایزا صورت می گیرد. در کیت های تجاری موجود برای الایزا عمدتاً از مجموعه آنتی ژن های تخلیص شده از انگل استفاده می شود. در این راستا انگل در محیط های کشت سلولی یا مایع صفاقی موش کشت داده می شود و در نتیجه امکان آلودگی آنتی ژن های انگلی به مواد غیر انگلی منشاء گرفته از کشت یا مایع صفاقی وجود دارد. به این ترتیب کیفیت آنتی ژن ها در سری های مختلف تولید یکسان نخواهد بود و همین امر سبب می شود استانداردسازی تست، با مشکل مواجه شود. علاوه بر این فرایند تهیه آنتی ژن های طبیعی انگل پر زحمت و پر هزینه است. این در حالی است که پیشرفت فناوری dna نوترکیب امکان تولید آنتی ژن های نوترکیب را فراهم آورده است. تولید ارزانتر و استاندارد سازی ساده تر تست های تشخیصی از مهمترین مزایای آنتی ژن های نوترکیب می باشد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های igm در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. با انتخاب صحیح آنتی ژن های نوترکیب که مارکر عفونت حاد یا مزمن هستند، می توان عملکرد تست های تشخیصی را در جهت تفکیک و تمایز مراحل عفونت بهبود بخشید. واکسن های نوترکیب dna و پروتئین، همراه با ادجوانت های مناسب با القاء پاسخ ایمنی سلولی قوی، امید زیادی در پیشگیری از عفونت های داخل سلولی از جمله توکسوپلاسما ایجاد کرده اند. مطالعات نشان داده است که آنتی ژن های راپتری (rop1)انگل، قادر به ایجاد پاسخ ایمنی قوی همورال و سلولی هستند. از این رو بررسی های زیادی جهت ارزیابی پتانسیل انواعی از این آنتی ژن ها به صورت نوترکیب برای اهداف پیشگیری و تشخیص صورت گرفته است. از این بین آنتی ژن rop1 به عنوان یکی از آنتی ژن های راپتری انگل که شاخص مرحله حاد عفونت است، می تواند در تشخیص عفونت اولیه یا حاد که در مورد زنان باردار اهمیت ویژه ای دارد و نیز جهت ایمن سازی به صورت واکسن dna مفید باشد. با وجود مطالعات انجام شده در این رابطه، تا کنون در مطالعات محدودی پروتئین rop1 به تنهایی در جهت اهداف مذکور مورد ارزیابی قرار گرفته است. از این رو در این تحقیق سعی شد به عنوان اولین گام، ژن rop1 کوتاه شده از ژن rop1 کامل سویه rh ایران کلون و محصول پروتئینی این ژن به منظور ارزیابی های بیشتر بیان شود. در این راستا یک جفت پرایمر اختصاصی با استفاده از توالی ژن rop1 موجود در پایگاه داده های genbank طوری طراحی شد که پس از تکثیر ژن به روش pcr و با استفاده از الگوی ژنوم، بخش عمده توالی سیگنال پپتید و همچنین بخش عمده دارای کدون های نادر حذف شد و جایگاه های شناسایی دو آنزیم محدودالأثر ndei و xhoi در دو انتهای 5 و 3 ژن قرار گرفتند. محصول pcr در ناقل کلونینگ ptz57r/t کلون شد. پس از غربالگری، پلاسمیدهای نوترکیب با هضم آنزیمی تأیید شدند و آنالیز تعیین توالی،99% شباهت بین ژن rop1 کلون شده و توالی موجود در genbank را نشان داد. سپس ژن rop1 توسط آنزیم های ndei و xhoi از پلاسمیدهای نوترکیب ptz57r/t-rop1 بریده و در ناقل بیانی pet-28b(+) زیرکلون شد. پلاسمیدهای نوترکیب تأیید شده با هضم آنزیمی برای بیان پروتئین rop1 به میزبان های بیانیe. coli ,bl21-plyss(de3) rosetta(de3) و bl21-ai منتقل شدند. بیان پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده e. coli با آنالیز sds-page بررسی شد. نتیجه این آنالیز باند حدود70 کیلو دالتونی مربوط به پروتئین نوترکیب را در نمونه باکتریایی پس از القاء نشان داد. پس از بهینه سازی شرایط بیان، مشاهده شد که سویه میزبان بیانی بیشترین تأثیر را در میزان بیان پروتئین نوترکیب دارد بطوریکه بیان در سویه rosetta(de3) از باکتری e. coli با داشتن پلاسمیدی که trna های مربوط به کدون های نادر در e. coli را کد می کند بهتر از سویه ی bl21-plyss(de3) شد. همچنین بیان در سویه bl21-ai که همزمان با iptgو l-arabinose در محیط با1/0 درصد گلوکزالقا می شود خیلی از دو سویه ی دیگر بیشتر بود که این ممکن است بدلیل اینکه این سویه از بیان نشتی جلوگیری کرده و باعث افزایش بیان پروتئین های سمی می شود، باشد. تأیید هویت و بررسی آنتی ژنیسیته پروتئین کوتاه شده rop1 توسط آنالیز وسترن بلاتینگ و با استفاده از نمونه سرم های افراد مبتلا به فاز حاد و مزمن و افراد منفی برای عفونت صورت گرفت. مشاهده باند حدود 70 کیلو دالتونی(به دلیل وجود اکتاپپتید پرولین –اسیدگلوتامیک همچنین بدلیل داشتن بار قوی نامتقارن به کندی در ژل حرکت می کند.) در سرم های فاز حاد و بدون واکنش در سرم های فاز مزمن آنتی ژن نوترکیب rop1 ، آنتی ژنیسیته آن را تأیید کرد و نشان داد که تلاش جهت تولید پروتئین نوترکیب آن در آینده ای نه چندان دور به تفکیک فاز حاد و مزمن در الایزا کمک می کند. بنابراین در گام های بعدی توانایی پروتئین نوترکیب rop1 در مطالعات واکسیناسیون و تشخیص عفونت توکسوپلاسما، مورد بررسی قرار خواهد گرفت.