جداسازی،خالص سازی و مطالعه خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم آلفا آمیلاز مقاوم به حلال آلی از سویه باکتریایی اکستریموفیل بومی جدید

آلفا آمیلازها از مهمترین و با اهمیت ترین آنزیم ها به شمار می آیند و اهمیت فراوانی در بیوتکنولوژی امروزی ایفا می کنند. اگر چه منابع مختلفی قادر به تولید آلفا آمیلاز می-باشند عموما آنزیم های مشتق شده از منابع میکروبی به ویژه منابع باکتریایی و از جنس باسیلوس از جنبه های کاربردی و صنعتی دارای ارزش می باشند و بیشتر مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته اند. استفاده از آنزیم ها در حلال های آلی به علت کاهش مقدار آب، محصولات جانبی ناخواسته را کاهش داده و از طرف دیگر تعادل ترمودینامیکی را در جهت سنتز فراورده پیش می برد و به این ترتیب راندمان عمل آنزیم را بالا می برد. بنابر این دست یابی به آمیلاز مقاوم به حلال آلی برای صنعت یک ضرورت است. در این تحقیق ابتدا سویه های باکتری از مناطق صنعتی عسلویه جداسازی و نسبت به تولید آنزیم تجزیه کننده نشاسته غربالگری شدند. در این مطالعه سویه باکتریای مقاوم به حلال آلی توانایی تولید آلفا آمیلاز خارج سلولی را دارا بود. در ادامه با استفاده از آنالیز 16s rdna این سویه با نام asm1 در پایگاه ncbi ثبت گردید و با رسم درخت فیلوژنتیکی جایگاه این سویه در مقایسه با سایر باسیلوس های شناخته شده تعیین شد. مطالعات تعیین توالی نشانگر شباهت بالای سویه با سویه bacillu methylotrophicusبود. با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی و بکار بردن ستون q-sepharose آلفا آمیلاز حاصل از methylotrophicusbacillusخالص و سپس تعیین خصوصیت گردید. فعالیت آنزیمی به کمک روش برنفلد و در حضور بافر تریس mm 20 تعیین شد. این آنزیم برای فعالیت به کلسیم نیاز ندارد. دما و phبهینه این آنزیم به ترتیب 55درجه سانتی گراد و4/7 بود. الکتروفورز با sds-page باندی را با وزن مولکولی65 کیلو دالتون نشان داد. آنزیم نشاسته مایع را با km و vmax به ترتیب 4mm وmol/minµ 6 تجزیه می نمود. فعالیت این آنزیم در حضور درصد های مختلف حلال های آلی ازجمله بوتانل، متانل، پروپانل، کلروفرم و سورفکتا نت های غیر یونی توئین 80 و توئین20 بررسی شد. آنزیم در حضور45% از بوتانل، متانل و پروپانل بطور میانگین تا 30% از فعالیت خود را کاملا حفظ کرده و در حضور60% از توئین 80 ، توئین20 و کلروفرم این درصد از فعالیت در آنزیم باقی ماند. این آنزیم در حضور 20% از مایعات یونی 1-butyl-3-methylimidazolium([bmim] ) و 1-ethyl-3-methylimidazolium([emim] ) نیز تا 70% از فعالیت خود را حفظ کرد. پایداری آنزیم در حضور 10% از بوتانل، پروپانل، متانل، کلرفرم، توئین20 وتوئین80 به مدت 96 ساعت انکوباسیون بررسی شد. فعالیت باقی مانده آنزیم به مدت 50 ساعت تا بیش از 10% در حضور همه انواع ترکیبات نامبرده مشاهده شد و نیمه عمر آنزیم تعیین گردید. ساختار آنزیم خالص در حالت کنترل و در حضور 30% از حلال آلی بوتانل توسط تکنیک فلوروسانس مورد مطالعه و بررسی قرار گرفت. الگوی غیر فعال شدن حرارتی برگشت ناپذیر در حضور کلسیم ،edta و حلال بوتانل بررسی گردید. این آنزیم در حضور یونهایcr,mg,mo,mn,al,li,na,k ،سورفکتانت آنیونیsds، شلاته کننده edta و ترکیب شیمیایی مرکاپتواتانل دچار کاهش فعالیت گردید، در حضور یون baفعالیت خود را 100% حفظ کرد و در حضور fe,cuدچار افزایش فعالیت گردید. دناتوراسیون شیمیایی آنزیم در حضور اوره mm 6 مورد مطالعه قرار گرفت، همچنین فعالیت آلفا آمیلاز در حضور مهار کننده آکاربز اندازه گیری شد