تولید اریتریتول توسط مخمرها و بهینه سازی تولید با استفاده از روش های مهندسی متابولیک

در آغاز هدف از این بررسی اثر زایلیتول و یک شیرین کننده جدید، اریتریتول، بر روی رشد استرپتوکوک های دهانی و مقایسه اثر آنها بود. برای این منظور اثر مهاری زایلیتول و اریتریتول تجاری بر روی رشد سویه های استرپتوکوکوس های دهانی و همین طور تشکیل بیوفیلم آنها مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که رشد استرپتوکوکوس موتانس در حضور 4 درصد زایلیتول و 4 درصد اریتریتول به ترتیب 68 و 71 درصد کاهش رشد یافت. تشکیل بیوفیلم بوسیله استرپتوکوکوس موتانس در حضور 4 درصد اریتریتول 32/31 درصد کاهش رشد نشان داد. در این مطالعه 650 مخمر اسموفیل جدا شد که تنها چهار مورد آنها قادر به تولید اریتریتول بودند. برای شناسایی و تعیین جایگاه فیلوژنی این مخمرها توالی dna بینits1 و its4 ریبوزومی آنالیز شد. این مخمرها به ترتیب جداسازی تحت نام های یاروویا لیپولیتیکا سویه isf7، کاندیدا سویه isf57، آئروبازیدیوم پلولانس سویه isf143 و مونیلیلا استوابوتنس سویه isf468 شناسایی شدند که به ترتیب از گلوکز 24/60، 43/9، 56/11 و 74/121 گرم بر لیتر اریتریتول تولید می-کردند. مونیلیلا استوابوتنس سویه isf468 جدایه جدیدی بود که قادر بود از لاکتوز با بازده 19 درصد 39/35 گرم بر لیتر اریتریتول تولید کند. تولید اریتریتول از لاکتوز برای اولین بار گزارش می گردد. به علاوه، این سویه توانایی تولید اریتریتول از سوکرو و مالتوز را داشت که این تولید به ترتیب 43/62 و 25/42 گرم بر لیتر بود. به منظور افزایش تولید اریتریتول، جهش یافته های کاندیدا مگنولیا dsm70638 و یاروویا لیپولیتیکا dsm70562 با استفاده از اشعه ماوراء بنفش و موتاژن های شیمیایی تولید شدند. یکی از جهش یافته های کاندیدا مگنولیا با نام 2-12 افزایش تولید 38/2 برابری در تولید اریتریتول، 32/20 گرم بر لیتر تولید در مقایسه با 54/8 گرم برلیتر در سویه وحشی، و کاهش 48/5 برابری در گلیسرول را نشان داد. نقشه ژنی اریتروز ردوکتاز در این مخمر جایگزینی باز آدنین با باز گوانین در جایگاه 321 را نشان داد که تغییری را در توالی اسید آمینه ای در پروتئین را موجب نشد. بنابراین، یک دلیل افزایش تولید در جهش یافته 2-12 احتمالا افزایش بیان چارچوب خوانش بوده است. جهش یافته دیگر جهش یافته 49 بود که از یاروویا لیپولیتیکا به دست آمد و بیشترین تولید اریتریتول را بدون تولید هرگونه محصول جانبی به خصوص گلیسرول داشت. تولید اریتریتول و فعالیت اختصاصی آنزیم اریتروز ردوکتاز در جهش یافته 49 در مقایسه با سویه وحشی به ترتیب 65/1 و 47/1 برابر بود. توالی ژن اریتروز ردوکتاز در سویه وحشی و جهش یافته تعین و آنالیز شد. مقایسه عمومی توالی ژن در سویه وحشی و جهش یافته نشان داد که در جایگاه 270 پروتئین اریتروز ردوکتاز گلوتامیک اسید جایگزین آسپارتیک اسید شد. به منظور افزایش تولید اریتریتول، از مدل طرح پاسخ سطح با سه فاکتور و سه سطح به روش باکس بنکن برای سه مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویه isf7، یاروویا لیپولیتیکا جهش یافته 49 و مونیلیلا استوابوتنس سویه isf468 استفاده شد. پودر آب پنیر 26/340 گرم بر لیتر، عصاره مخمر 94/7 گرم بر لیتر و ph برابر با 55/5 به عنوان بهترین شرایط تولید برای مونیلیلا استوابوتنس سویه isf468 انتخاب شد و با این شرایط 47/34 گرم بر لیتر تولید شد. بعد از مشخص شدن بهترین شرایط تولید اریتریتول، تولید اریتریتول مونیلیلا استوابوتنس isf468 در فرمانتور سه لیتری به صورت کشت بسته و کشت تغذیه شونده بر اساس فاکتورهای به دست آمده از طرح پاسخ سطح مطالعه شد. در حالت کشت بسته 24/26 گرم بر لیتر اریتریتول با بازده 1/17 بدون تولید هر گونه پلی الکل دیگر تولید شد. تشابه تقریبی تولید اریتریتول در حالت فرمانتور آزمایشگاهی و ارلن مایر نشان دهنده این است که تولید اریتریتول از آب پنیر توسط مونیلیلا استوابوتنس سویه isf468 قابلیت تجاری شدن را دارد. ادغام پروتوپلاستی نیز به منظور انتقال توانایی مصرف لاکتوز از کلایورومایسس لاکتیس به یاروویا لیپولیتیکا جهش یافته 49 انجام شد و نتیجه آن به دست آمدن سلول ادغام شده f7-3 بود که از محیط دارای 150 گرم بر لیتر لاکتوز 65/4 گرم بر لیتر اریتریتول تولید می کرد. تثبیت سلول های یاروویا لیپولیتیکا جهش یافته 49 درون کپسول آلژیناتی از دیگر مطالعات این بررسی بود که مخمر فوق در سدیم آلژینات 3 درصد با روکش اسید بوریک در محیط 150 گرم بر لیتر گلوکز 32/8 گرم بر لیتر اریتریتول تولید می کرد.