طراحی یک روش فلورسانس جهت تشخیص ترکیبات ارگانو فسفره با استفاده از کونژوگه نانوذرات طلا -آنزیم ارگانو فسفر هیدرولاز

ترکیبات ارگانوفسفره، استر، آمید یا مشتقات تیولی فسفریک اسید هستند که شامل حشره کش ها و عوامل جنگی شیمیایی می باشند. آنها به دلیل اینکه مهار کننده قوی آنزیم استیل کولین استراز اند به عنوان سموم عصبی شناخته می شوند که تمام این ترکیبات برای انسان و حشرات سمی اند. تا کنون طیف وسیعی از حسگرهای زیستی جهت تشخیص ترکیبات ارگانوفسفره بر مبنای اتصال آنزیم، آنتی بادی و سلول کامل روی مبدل-های الکتروچمیکال، نوری و پیزوالکتریکی طراحی شده اند. آنزیمoph به عنوان بهترین آنزیم تجزیه کننده سموم ارگانوفسفره شناخته شده است. حساسیت و اختصاصیت سوبسترایی و فضایی هیدرولیز ترکیبات op توسط این آنزیم بسیار بالا می باشد؛ لذا جهت تخلیص و استفاده از آن در حسگرهای زیستی به عنوان بخش شناساگر زیستی تحقیقات بسیاری صورت پذیرفته است. در این پروژه جداسازی و شناسایی میکروارگانیسم برتر بومی ایران از خاک زمین های کشاورزی در معرض تماس مداوم با سموم ارگانوفسفره و همچنین تخلیص و تعیین ویژگی آنزیمoph از باکتری منتخب با استفاده از روش های سونیکاسیون، سانتریفیوژ، روش رسوبی با استفاده از نمک سولفات آمونیوم 40% و 60% و کروماتوگرافی تعویض یونیdeae-sepharose cl-6b صورت پذیرفت. با استفاده از روش الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید 10% (sds- page)، تنها یک باند پروتئینی در ژل مشاهده شد که توسط مارکر، وزن مولکولی آن kd 36 تشخیص داده شد؛ همچنین فعالیت ویژه آنزیم iu/mg pro. 72/22 محاسبه شد بطوریکه آنزیم 97/57 مرتبه تخلیص یافت. سپس آنزیم oph تخلیص شده روی نانوذرات طلا تثبیت شد. نانوذرات طلا با احیاء haucl4 توسط تری سدیم سیترات سنتز و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره، اندازه نانوذرات طلا در حدود 2 ±10 نانومتر تخمین زده شد. سپس لینکر های سیستامین به نانوذرات طلا متصل شدند؛ پیک جذبی اسپکتروفتومتریک نانوذرات طلا و نانوذرات طلا- سیستامین به ترتیب 520 و 710 نانومتر تعیین شد. ازسوئی دیگر لینکر های گلوتارآلدهید به آنزیم متصل و در نهایت آنزیم و نانوذرات طلا به واسطه دو نوع لینکر به یکدیگر متصل شدند همچنین در روش دیگر آنزیم مستقیما روی نانو ذرات طلا تثبیت یافت که در نتیجه این دو روش به ترتیب نانوبیوکونژوگه با و بدون لینکر سنتز شدند که توسط طیف جذبی اسپکتروفتومتر (به ترتیب در 535 و 730 نانومتر) و ftir و سنجش فعالیت آنزیمی تأیید شدند. هدف اصلی پروژه طراحی حسگر زیستی فلوریمتریک جهت شناسایی ترکیبات ارگانوفسفره با استفاده از ویژگی های فلورسانس کومارین1 در مجاورت نانو ذرات طلایی که آنزیم روی آن تثبیت شد، بود؛ بطوریکه در حضور و عدم حضور غلظت های 150-300-450-600-750-900-1050 نانومولار پارااکسون به عنوان سوبسترای اختصاصی آنزیم، جایگاه کومارین1 به عنوان مهارکننده اختصاصی آنزیم و در نتیجه شدت فلورسانس کومارین1 تغییر نمود که حاکی از سنتز صحیح حسگر زیستی فلوریمتریک ابداع شده بود. ph بهینه آنزیم آزاد و نانوبیوکونژوگه با و بدون لینکر 8 و دمای بهینه آنها 37 درجه سانتیگراد بدست آمد. پایداری ph در طیفی از ph های 2-12 به مدت 30 دقیقه نشان داد که در طی تثبیت پایدرای ph آنزیم تثبیت شده روی نانوذرات طلا افزایش می یابد. همچنین پایداری دمایی آنها در سه دمای 45، 56 و 70 درجه سانتیگراد در سه بازه زمانی 30، 45 و 60 دقیقه نشان داد که تثبیت آنزیم روی نانوذرات طلا افزایش پایداری آنزیم به دماهای فوق در طی بازه های زمانی را نشان می دهد بطوریکه فعالیت آنزیمی باقیمانده آنزیم آزاد در دمای 70 درجه سانتیگراد بعد از 60 دقیقه 40/5% را نشان داد در حالیکه فعالیت آنزیمی باقیمانده نانوبیوکونژوگه با و بدون لینکر به ترتیب 58/26% و 93/23% بود. پارامترهای کینیتیکی یعنی km آنزیم آزاد و نانوبیوکونژوگه با و بدون لینکر به ترتیب 98/89، 88/29 و 54/8 و vmax به ترتیب 28/20، 39/47 و 88/19 واحد در میکروگرم آنزیم و kcat به ترتیب 8973/0، 4707/4 و 6566/1 می باشد که نشان از افزایش فعالیت کاتالیتیکی آنزیم بعد از فرایند تثبیت می باشد. اثر یون های sds ، licl ، fecl3، mgcl2 ، nacl ، co (no3)2، zncl و edta بر فعالیت آنزیم آزاد و نانوبیوکونژوگه با و بدون لینکر نشان داد که در مجاورت edta و sds فعالیت آنزیمی هر سه به کلی از دست می رود در حالیکه در مجاورت co (no3)2فعالیت آنزیمی هر سه ناگهان افزایش می یابد. اثر حلال های اتانول 25%-0 و متانول 25%-0 بررسی شد نتایج نشان داد که فعالیت آنزیمی باقیمانده آنزیم آزاد در غلظت 25% متانول و اتانول به ترتیب 35/11% و 07/9% را نشان می دهد ولی در مجاورت غلظت های 25%-0 اتانول و متانول تفاوت چندانی در فعالیت آنزیمی نانوبیوکنژوگه با و بدون لینکر مشاهده نشد. نهایتا پایداری ذخیره ای بر فعالیت آنزیمی آنزیم آزاد و نانوبیوکونژوگه با و بدون واسطه لینکر ارزیابی شد نتایج نشان داد که بعد از 18 روز فعالیت آنزیم آزاد تقریبا 574/9% باقی ماند درحالیکه در فعالیت آنزیمی نانوبیوکونژوگه با و بدون لینکر تغییرات کمی مشاهده شد. نتایج حاصل از این پروژه حاکی از نقش مثبت تثبیت آنزیم در افزایش فعالیت و پایداری آنزیم می باشد؛ بطوریکه روش مذکور جهت تثبیت آنزیم های مشابه روی نانوذرات فلزی به ویژه طلا بسیار مناسب بوده و نانوبیوکونژوگه سنتز شده جهت کاربردهای مختلف به ویژه جهت استفاده در حسگرهای زیستی و شناسایی و سنجش بسیاری از ترکیبات پیشنهاد می شود. لغات کلیدی : حسگر زیستی، ترکیبات ارگانوفسفره، نانوذرات طلا، تخلیص آنزیم ارگانوفسفرهیدرولاز، ویژگی های فلوریمتری کومارین1