اصلاح مولکولی ژن کیتیناز 42 جهت افزایش فعالیت کیتینازی

کیتین پس از سلولز بزرگترین منبع بیومس تجدید پذیر در طبیعت می باشد. این پلیمر در ساختار پوشش خارجی (exoskeleton) حشرات، سخت پوستان و دیواره سلولی برخی از قارچ ها وجود دارد. اولین و مهمترین مرحله در تجزیه طبیعی کیتین، ترشح آنزیم های کیتینازی است. کیتینازها اتصالات n-acetylglucosamine در پلیمر تشکیل دهنده زنجیرهای کیتین را هیدرولیز می کنند. در این تحقیق به منظور افزایش کارایی آنزیم کیتیناز42 (chit42)در تجزیه ساختارهای کیتینی موجود در دیواره سلولی قارچهای پاتوژن، دومین اتصال به کیتین (chitin binding domain) به انتهای کربوکسیلی آنزیم کیتیناز 42 متصل شده و فعالیت کیتینولیتیکی آنزیم هیبرید بیان شده مورد ارزیابی قرار گرفت. کیتیناز42 و کیتیناز کایمری فعالیت مشابهی علیه کیتین کلوئیدی داشته و ثابت اختصاص برای هر یک به ترتیب 83/0 و 07/1 بر دقیقه است. دما و ph بهینه برای هر دو تقریباً یکسان می باشد. در حضور کیتین کریستالی، کیتیناز کایمری فعالیت کیتینازی بیشتری (70 درصد) و هم چنین ثابت اتصال به کیتین در مقایسه با کیتیناز42 به طور قابل توجه بالاتر می باشد. مطالعات اسپکتروسکوپی نشان می دهد که تشکیل کایمر کیتیناز با تغییراتی در ساختار آنزیم همراه می باشد که باعث کاهش ساختارهای مارپیچ آلفا در ساختمان کیتیناز کایمری می شود. مطالعات پایداری دمایی نشان می دهد که کیتیناز کایمری نسبت به کیتیناز42 از لحاظ ساختاری پایدارتر می-باشد.. در این تحقیق به منظور انتقال ژن کیتیناز کایمری به گیاه نیشکر (sugarcane) و افزایش مقاومت آن علیه آفات و عوامل بیماریزای قارچی، ابتدا کشت بافت و انتقال ژن به این گیاه بهینه شد و تأثیر پارامترهای مختلف در کشت بافت و انتقال ژن به گیاه نیشکر دو واریته cp57 و nco310 به روش بمباران ذره ای مورد بررسی قرار گرفت. هم چنین، اثرات پارامترهای فیزیکی و بیولوژیکی مختلف مانند غلظت dna ، نوع محیط اسموتیک، نوع ذره، تعداد بمباران، فاصله ذرات پرتاب شونده از بافت هدف روی بیان موقت ژن gus ارزیابی شد. بدین منظور کالوس جنین زای حاصل از کشت ریز نمونه ساقه نیشکر در محیط ms حاوی هورمون 2,4-d توسط حامل های ژنی حاوی ژن uida تحت کنترل پروموترهای camv 35s, act1 و ubi بمباران شد. به منظور بررسی انتقال ژن از تعداد لکه های آبی ظاهر شده پس از رنگ آمیزی با ماده x-gluc استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که شرایط بهینه بیان ژن gus در کالوس جنین زای نیشکر در واریته cp57 شامل ژن تحت کنترل پروموتر ubi، بمباران با ذرات طلا یک میکرومتر پوشانده شده با یک میکروگرم dna و با فشار psi 1100 ، شش سانتی متر فاصله ذرات پرتاب شونده از بافت هدف و در محیط اسموتیک m 2/0 مانیتول و m 2/0 سوربیتول و در واریته nco310 شامل ژن تحت کنترل پروموترact1، بمباران با ذرات طلا یک میکرومتر با 5/12 میکروگرم dna و با فشار psi 1100 ، cm 9 فاصله ذرات پرتاب شونده از بافت هدف و در محیط اسموتیک m 2/0 مانیتول وm 2/0 سوربیتول هستند. از شرایط بهینه فوق برای انتقال ژن کیتیناز کایمری به گیاه نیشکر استفاده شد و ایجاد گیاهان تراریخت با روش های مولکولی تایید و مقاومت آن ها به قارچ های بیماریزا بررسی شد. نتایج حاصل نشان می دهد که مقاومت به عوامل بیماری زا در لاین های تراریخت نسبت به گیاه کنترل بیشتر می باشد. بدین ترتیب می توان با استفاده از ژن های مهندسی مقاوم به قارچ ها، قارچ های بیماری زای را کنترل نمود.