همسانه سازی ژنی و تعیین خصوصیات ساختاری آنزیم کربوکسی متیل سلولاز حاصل از bacillus sp.z14

سلولازها گروهی از آنزیم های گلیکوزیل هیدرولازند که پیوندهای – 1,4 ? سلولز را هیدرولیز می کنند و به سه دسته کلی اندوگلوکانازها، اگزوگلوکانازها و ?-گلوکوزیدها تقسیم می شوند. اندوگلوکانازها پیوندهای بتاگلوکوزیدی را به طور اتفاقی در نواحی داخلی زنجیره سلولز قطع نموده و تولید قطعات کوتاه الیگوساکاریدی می کنند. سویه های باسیلوس توانایی تولید انواعی از آنزیم های خارج سلولی هیدرولیتیک و مهم از لحاظ صنعتی ازقبیل سلولازها را دارا هستند. انواع مختلفی از اندوگلوکانازهای گونه های باسیلوس، شناسایی و کلون شده اند؛ که علاوه بر کاربردهای بیوتکنولوژیکی، از نظر اقتصادی نیز در صنعت کاربرد وسیعی پیدا کرده اند. در این تحقیق، باکتری bacillus sp.z14 رادر اختیار داشتیم که قادر به تولید یک کربوکسی متیل سلولاز با پایداری حرارتی قابل ملاحظه بود. این آنزیم توسط ستون کروماتوگراقی تعویض یونی deae-sepharose تخلیص گردید. وزن مولکولی آنزیم خالص با استفاده از sds-page و زایموگرافی kda25/71 تخمین زده شد. پارامترهای کینتیکی km و vmax با استفاده از نمودار لینویور-برگ برای آنزیم خالص به ترتیب برابر با mg/ml 54/4 و µmol/min/mg 125 تعیین گردید. بر اساس توالی ژن 16s rdna، سویه باکتری تولید کننده آنزیم، به صورت bacillus pumilus مشخص شد. ژن کد کننده آنزیم سلولاز این باکتری همراه با نواحی بالادست و پایین دست آن، در داخل وکتور ptg19-t کلون گردید. نتایج حاصل از تعیین توالی نشان داد که ناحیه orf این ژن شامل 1980 نوکلئوتید می باشد که پروتئینی با 616 آمینواسید را کد می کند. این پروتئین تشابه بالایی با سلولازهای سایر باکتری های b.pumilus نشان می دهد و از یک دومن کاتالیتیک از خانواده 9 گلیکوزیل هیدرولازها و یک دومن متصل شونده به سلولز از نوع 3 تشکیل شده است. از آن جایی که این آنزیم توانایی هیدرولیز سوبستراهای طبیعی از قبیل کاه و سبوس گندم را دارد، می تواند در خوراک دام و تجزیه مواد لیگنوسلولزی تیمارشده کاربرد داشته باشد.