انتقال ژن به سلول های یونجه (medicago sativa)با استفاده از نانوپلیمرها

ترکیب نانوفناوری و زیست شناسی (نانوفناوری زیستی) ابزار موثری را برای انتقال مواد مختلف از جمله اسیدهای نوکلئیک به سلول-های زنده فراهم می آورد. در این تحقیق نانوپلیمر پلی آمیدوآمین دندریمر نسل دوم، با هسته دی اتیلن تری آمین به منظور انتقال ژن gusa (بتاگلوکورونیداز) تحت کنترل پروموتور camv 35s وترمیناتور nos به سلول های یونجه مورد استفاده قرار گرفت. سازه ژنی مورد نظر از طریق اتصال کاست ژنی gusa از وکتور pbi 121 به puc 18 تهیه و جهت تکثیر به استرین dh5? باکتری e.coli تراریخت شد. صحت ساخت سازه ژنی از طریق برش آنزیمی و رنگ آمیزی gus تایید شد. برای ایجاد کمپلکس dna-pamam، dna و دندریمرpamam با هم در نسبت های متفاوتn/p مخلوط شده و ایجاد کمپلکس توسط ژل آگارز، بررسی شد. این کمپلکس dna-pamam برای تراریختی سلول های سوسپانسیون یونجه استفاده شد. برای این منظور، کمپلکس pamam-dna در محیط های تراریختی متفاوت روی سلول ها اضافه و به آرامی تکان داده شد. پس از گذشت مدت زمان های متفاوت، بیان موقت ژن gus از طریق آزمون فعالیت gus بررسی شد. به منظور افزایش بازده انتقال ژن، از تیمار هم زمان سلول ها با امواج فراصوت استفاده گردید. برای این منظور ابتدا اثر امواج فراصوت بر زنده مانی و شکست سلول با استفاده از میکروسکوپ نوری و میکروسکوپ الکترونی نگاره، بررسی شد. نتایج حاصل نشان داد که تیمار های پالس، شدت و زمان تیمار سلول ها با امواج فراصوت به طور معنی-داری زنده مانی سلول ها را کاهش، و شکست شان را افزایش داد. همچنین اثر دندریمر pamam در محافظت از dna در برابر امواج فراصوت و هضم آنزیمی توسط ژل آگارز 8/0 درصد بررسی شد. مورفولوژی و اندازه نانوذرات dna- pamamدر نسبت های مختلف n/p و استفاده از دندریمر ها با اندازه متفاوت، با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره برسی گردید. علاوه بر این، اثر زیست سازگاری پلیمر pamam روی سلول های یونجه نیز با رنگ آمیزی تریپان بلو مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دادند که دندریمر pamam از توانایی زیادی در برهم کنش با dna برخوردار بوده و می تواند آن را به طور موثری از آسیب توسط امواج فراصوت و هضم آنزیمی محافظت نماید. همچنین، تصاویر میکروسکوپ الکترونی از کمپلکس dna-pamam نشان داد این نانوذرات دارای شکل کروی تا بیضوی و اندازه ای در حدود 20 تا 250 نانومتر می باشند که با افزایش اندازه پلیمر و کاهش نسبت n/pاندازه نانوذرات کاهش پیدا کرده و شکل کروی تری به خود می گیرند. نتایج حاصل از تراریختی سلول های یونجه با کمپلکس pamam-dna نشان داد که این پلیمر در نسبت های پایینn/p به طور مستقل از توانایی نفوذ از دیواره سلول های کالوس یونجه و بیان ژن خارجی برخوردار است، اما بازده این تراریختی پایین است. در حالیکه، تیمار سلول ها با امواج فراصوت و محیط نفوذ پذیر کننده دیواره سلولی (ms حاوی ساکارز 21 درصد)، بازده انتقال ژن را به طور قابل ملاحظه ای تا شش درصد افزایش داد.