حذف توالی his-tag و ساخت یک سازه جدید حاوی ژن آلفا سینوکلئین، مطالعه بیان پروتئین، خالص سازی، فیبریلاسیون و سمیت سلولی پروتئین

پایان نامه
  • وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک وزیست فناوری
  • نویسنده جعفر فلاحی
  • استاد راهنما دینا مرشدی
  • سال انتشار 1391
چکیده

در بیان و خالص سازی پروتئین های نوترکیب از توالی مکملی معروف به دنباله استفاده میشود که از انواع آنها می توان به his-tag، gst-tag، mbp-tag وstrep-tag اشاره نمود. وجود این توالیها موجب تسهیل وتسریع امر خالص سازی میگردد و در این میان his-tag پرکاربردترین این توالی هاست. در بسیاری از مواقع حضور این دنباله ها میتواند تاثیر منفی بر روی ساختار و عملکرد پروتئین داشته باشد اما در مطالعات معمولا این مسئله در نظر گرفته نمیشود. در این مطالعه به بررسی اثر حضور his-tag بر روی فرآیندهای فیبریلاسیون و سمیت سلولی آلفاسینوکلئین پرداخته شد و روش خالص سازی مناسب برای پروتئین بدون دنباله طراحی گردید. آلفاسینوکلئین پروتئین مونومری است که در سلولهای مغزی بیان میشود و نقش مهمی در بیماریهای تحلیل برنده سیستم عصبی ازجمله پارکینسون ایفا میکند و به همین دلیل مطالعات وسیعی برروی آن حتی درمدلهای برون تنی صورت میگیرد. آلفاسینوکلئین برچسبدار با هیستیدین در باکتری e.coli بیان شد و توسط کروماتوگرافی تمایلی خالص گردید. برای مقایسه، توالیhis-tag در وکتور توسط آنزیم های ndei و hindiii برش زده، حذف گشته و سپس در e.coli بیان شد و با بکارگیری روش متفاوت خالص سازی با کمک حرارت، خاصیت شلات کنندگی edta و رسوب دهی با ایزوپروپانول پروتئین بدون دنباله با خلوص بالای 95% خالص شد. در مرحله بعد فعالیت فیبریلاسیون هر دو پروتئین برچسب دار و بدون برچسب توسط تستهای استاندارد بررسی شد و تفاوت آن دو از نظر کینتیک تشکیل فیبریل مشخص گردید. his-tag باعث افزایش سرعت فیبریلاسیون می شود که این یافته توسط نتایج پیش گویی نیز ثابت شد. ازساعت های مختلف فیبریلاسیون هر دو پروتئین، نمونه برداری شد و به محیط کشت سلولی اضافه گردید و با تست mtt ثابت شد که نمونه 3 ساعته پروتئین his-tag دار و نمونه 7 ساعته آلفاسینوکلئین بدون his-tag بیشترین مرگ سلولی را دارند. این نتیجه نشان می دهد کهhis-tag باعث تسریع فیبریلاسیون می شود و قاعدتا مقدار بیشتری از سلول ها در نمونه 3 ساعته دچار آسیب می شوند اما همین نتیجه، برای نمونه 7 ساعته پروتئین بدون his-tag دیده می شود..

منابع مشابه

ساخت و بررسی کارآیی ناقل بیانی گیاهی pBI105، با هدف سهولت همسانه سازی و خالص سازی پروتئین نوترکیب

ناقلین دوتایی مرسوم مثل pBI121 که هنوز به طور گسترده ای در انتقال ژن به گیاه به واسطه آگروباکتریوم استفاده می شوند، عمدتاً تعداد محدودی جایگاه منحصر به فرد شناسایی آنزیم های برشی در جایگاه همسانه سازی خود دارند. همچنین این ناقل ها فاقد بسیاری از عناصر و توالی های مفید مثل توالی‌های مورد استفاده در خالص سازی پروتئین نوترکیب هستند. در این مقاله یک ناقل بیانی جدید گیاهی با جایگاه همسانه سازی توسعه ...

متن کامل

طراحی و ساخت یک سازه ژنی نوترکیب بیان کننده پروتئین p24 ویروس لکوز گاوی در اشرشیاکلی

لکوز انزئوتیک گاوی(EBL) یک بیماری رتروویروسی است که بوسیله ویروس لکوز گاوی (BLV) ایجاد و عموماً در دامداری‏های صنعتی مشاهده می‏شود. این بیماری موجب کاهش توان تولید و بروز خسارت‏‏های اقتصادی قابل توجه در گله می‏شود. کنترل عفونت‏های ناشی از BLV با انجام آزمایش‏های سرولوژی، شناسایی و جداسازی یا حذف حیوانات سرم مثبت انجام می‏گردد. در این مطالعه، ژن پروتئین p24 از BLV پس از تکثیر توسط PCR، به پلاسمید...

متن کامل

ساخت و بررسی کارآیی ناقل بیانی گیاهی pBI105، با هدف سهولت همسانه سازی و خالص سازی پروتئین نوترکیب

ناقلین دوتایی مرسوم مثل pBI121 که هنوز به طور گسترده ای در انتقال ژن به گیاه به واسطه آگروباکتریوم استفاده می شوند، عمدتاً تعداد محدودی جایگاه منحصر به فرد شناسایی آنزیم های برشی در جایگاه همسانه سازی خود دارند. همچنین این ناقل ها فاقد بسیاری از عناصر و توالی های مفید مثل توالی‌های مورد استفاده در خالص سازی پروتئین نوترکیب هستند. در این مقاله یک ناقل بیانی جدید گیاهی با جایگاه همسانه سازی توسعه ...

متن کامل

بررسی اثرات مهاری مولکولهای کوچک برروی فیبریلاسیون پروتئین های لیزوزیم و آلفا سینوکلئین

تجمعات آمیلوئیدی از جمله حالت های غیر طبیعی پروتئین ها می باشد که می تواند تحت شرایط مختلف از قبیل استرس اکسیداتیو و بالا رفتن میزان اسیدهای چرب غیر اشباع درون سلول ها ایجاد شود. مطالعات نشان می دهد که تشکیل این تجمعات با برخی از بیماری ها نظیر بیماریهای عصبی و سیستماتیک در ارتباط می باشند. بعنوان مثال آلزایمر و پارکینسون از جمله بیماری های تحلیل رونده عصبی هستند که به ترتیب در اثر تجمع پروتئین...

15 صفحه اول

بررسی اثر اندازه نانوذرات آلبومین بر روی فیبریلاسیون پروتئین آلفا-سینوکلئین

در راستای رشد روزافزون علم نانوفناوری و کاربرد آن در دارورسانی، نانوذرات آلبومین به واسطه‏ی ویژگی زیست‏تخریب‏پذیری و غیر حساسیت‏زایی مورد توجه قرار گرفته‏اند. نانوذرات با توجه به دارا بودن نسبت سطح به حجم بالایشان تمایل زیادی به برهم‏کنش با مواد زیستی از قبیل پروتئین‏ها دارند، از این رو ممکن است در روند فیبریل‏شدن پروتئین‏ها اختلال ایجاد کنند و موجب مهار و یا تسریع آن شوند. تجمعات فیبریلی پروتئ...

طراحی و ساخت سازه بیانی گیاهی جهت تولید پروتئین کایمری حاوی PGIP1 و PGIP2

امروزه کنترل بیماریهای گیاهی یکی از اهداف مهم اقتصاد جهانی است. پاتوژنهای قارچی با گسترش وسیع و سریعی که دارند خسارت زیادی به محصولات گیاهی وارد می کنند و به همین دلیل مبارزه با پاتوژنهای قارچی جزء برنامه های اصلی مبارزه با بیماریهای گیاهی در بسیاری از آزمایشگاههای تحقیقاتی می باشد. بیشترین آنزیمهای قارچی تجزیه کننده دیواره سلولی گیاهی که مطالعه شده اند پلی گالاکتوروناز ها (PG/polygalacturonase...

متن کامل

منابع من

با ذخیره ی این منبع در منابع من، دسترسی به آن را برای استفاده های بعدی آسان تر کنید

ذخیره در منابع من قبلا به منابع من ذحیره شده

{@ msg_add @}


نوع سند: پایان نامه

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک وزیست فناوری

میزبانی شده توسط پلتفرم ابری doprax.com

copyright © 2015-2023